一種曲妥珠單抗試劑盒及其抗藥抗體試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種曲妥珠單抗試劑 盒及其抗藥抗體試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是一種常見的上皮細(xì)胞癌。在我國女性癌癥患者中，乳腺癌患病率占第二 位。人類表皮生長因子受體-2(HER_2)是目前認(rèn)識較為清楚的與乳腺癌關(guān)系密切的人類癌 基因。約有25%~30%的乳腺癌患者HER-2有基因改變，促使腫瘤細(xì)胞HER-2增加。Slamon等 人證明有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者若HER-2過表達(dá)，復(fù)發(fā)時間明顯縮短，生存時間明顯減少;HER-2陽 性的乳腺癌病人的平均生存期為3年，而HER-2陰性的乳腺癌患者平均生存期為6~7年，首 先提出HER-2高表達(dá)與乳腺癌不良預(yù)后有關(guān)。HER-2在乳腺癌中的高表達(dá)往往預(yù)示著雌激素 受體(ER)陰性、易有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化差，預(yù)后不佳。隨著對HER-2研究的深入，它已經(jīng) 成為乳腺癌特異性治療的靶分子之一。
[0003] HER-2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，由胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì) 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（ICD)三部分組成。當(dāng)HER-2以單體跨膜存在時無活性，而細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與配體 結(jié)合，HER-2形成二聚體產(chǎn)生活化信號，激活受體細(xì)胞內(nèi)部分的酪氨酸激酶，完成傳遞細(xì)胞 調(diào)節(jié)信號的過程。
[0004]治療性單克隆抗體藥物經(jīng)歷了三十多年的發(fā)展，已經(jīng)成為生物醫(yī)藥的最重要組成 部分之一，成功用于治療腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反應(yīng)等多種疾。曲 妥珠單抗(Trastuzumab)是重組DNA人單克隆抗體，適用于HER-2過度表達(dá)的乳腺癌患者。曲 妥珠單抗選擇性作用于HER-2分子，抑制癌細(xì)胞的增生，具有高度親和力，高度靶向性，并且 只對癌細(xì)胞起作用，對正常細(xì)胞的殺傷較小，是當(dāng)代乳腺癌靶向治療的代表性藥物。
[0005] 研究表明，曲妥珠單抗治療乳腺癌的作用機理主要是通過與HER-2受體特異性結(jié) 合，影響生長信號的傳遞;促進(jìn)HER-2受體蛋白的內(nèi)在化降解;通過抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì) 胞毒性作用(ADDC作用）聚集免疫細(xì)胞攻擊并殺死腫瘤細(xì)胞;另外，它還可以下調(diào)血管內(nèi)皮 生長因子(VEGH和其它血管生長因子活性。HER-2不但可作為反映惡性腫瘤惡性生物學(xué)特 性的指標(biāo)，而且為治療腫瘤提出了新的理念:抗HER-2單抗藥物可以靶向抑制乳腺癌細(xì)胞中 HER-2的過表達(dá)。
[0006] 雖然曲妥珠單抗可以靶向性地治療乳腺癌，但在治療性抗體(藥物）的治療期間， 可能會產(chǎn)生針對治療性抗體本身的免疫應(yīng)答，患者體內(nèi)通常在治療過程中產(chǎn)生針對治療抗 體(藥物)本身的抗體，稱之為抗藥物抗體(ADA)。而這些抗藥物抗體會降低甚至中和治療性 抗體的作用。因此，在曲妥珠單抗治療乳腺癌患者的過程中，如果能即時同時監(jiān)測ADA的含 量以及曲妥珠單抗在患者體內(nèi)的含量，提供有關(guān)患者針對特定治療藥物的治療反應(yīng)的信 息，及時調(diào)整治療方法，根據(jù)病人的用藥情況進(jìn)行個性化治療，從而實現(xiàn)伴隨診斷，更有利 于乳腺癌的治療。
[0007] 目前對于ADA的檢測方法已有報道，主要為酶聯(lián)免疫吸附法，但該方法存在著不足 之處。
[0008] ELISA檢測ADA，簡便易行，特異性高，可為臨床對腫瘤單抗藥物的使用提供更為客 觀的實驗依據(jù)。但與其他生物檢測或免疫檢測比較，這種ELISA檢測方法、技術(shù)、工具或產(chǎn)品 仍有較多的不足而使其應(yīng)用受限，這些不足主要包括以下幾個方面： (1) 檢測試劑在檢測過程中為開放方式，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢 測結(jié)果； (2) ELISA方法檢測范圍和靈敏度都較低。
[0009] (3)ELISA方法的檢測時間較長，完成一個測試所需的總時間一般在2個小時以上， 不能完全滿足臨床上的快速診斷的需求。
[0010] (4)ELISA方法不能隨機進(jìn)樣檢測，檢測結(jié)果存在滯后性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種曲妥珠單抗試劑盒及其抗藥抗體試劑盒， 具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點。
[0012] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個技術(shù)方案是：提供一種單抗藥物曲妥珠 單抗Trastuzumab試劑盒，包括生物素化抗Trastuzumab抗體、Trastuzumab校準(zhǔn)品、 Trastuzumab質(zhì)控品、AP-抗人IgG抗體、磁微粒試劑、化學(xué)發(fā)光底物和清洗液，所述生物素化 抗Trastuzumab抗體為偶聯(lián)有生物素的抗Trastuzumab抗體，所述AP-抗人IgG抗體為AP標(biāo)記 的抗人I gG抗體，所述磁微粒試劑為表面有親和素的納米磁微粒懸浮液。
[0013]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述生物素化抗Trastuzumab抗體是生物素與抗 Trastuzumab抗體分子表面的-NH2基團(tuán)反應(yīng)得到。
[0014] 所述Trastuzumab校準(zhǔn)品是由含有Trastuzumab的人血清配制而成，用于得到校準(zhǔn) 曲線;所述Trastuzumab質(zhì)控品是由含有Trastuzumab的人血清配制而成。
[0015] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述磁微粒試劑中磁微粒的直徑為0.1-0.5μηι，所述 磁微粒試劑具有超順磁性。
[0016] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述化學(xué)發(fā)光底物中包括3-(2-螺旋金剛烷)-4_甲 氧基-4-(3-憐氧醜)-苯基_1，2_二氧環(huán)乙燒二納鹽AMPFO。
[0017] 提供一種抗藥抗體Anti-Trastuzumab試劑盒，包括生物素化Trastuzumab、抗 Trastuzumab抗體校準(zhǔn)品、抗Trastuzumab抗體質(zhì)控品、AP-抗ADA抗體、磁微粒試劑、化學(xué)發(fā) 光底物和清洗液，所述生物素化Trastuzumab為偶聯(lián)有生物素的Trastuzumab，所述AP-抗 ADA抗體為AP標(biāo)記的抗ADA抗體，所述磁微粒試劑為表面有親和素的納米磁微粒懸浮液。
[0018] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述生物素化Trastuzumab是生物素與Trastuzumab 分子表面的-NH2基團(tuán)反應(yīng)得到。
[0019] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述抗Trastuzumab抗體校準(zhǔn)品是由抗Trastuzumab 抗體配制而成，用于得到校準(zhǔn)曲線;所述抗Trastuzumab抗體質(zhì)控品是由抗Trastuzumab抗 體配制而成。
[0020] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述磁微粒試劑中磁微粒的直徑為0.1-0.5μηι，所述 磁微粒試劑具有超順磁性。
[0021] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述化學(xué)發(fā)光底物中包括3-(2-螺旋金剛烷)-4_甲 氧基-4-(3-憐氧醜)-苯基-1，2_二氧環(huán)乙燒二納鹽AMPFO。
[0022] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的曲妥珠單抗試劑盒及其抗藥抗體試劑盒，采用全 自動磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測方法，選取堿性磷酸酶AP-金剛烷AMPPD體系，具有穩(wěn)定性好、靈敏 度高、重復(fù)性好等優(yōu)點，同時大大縮短了檢測時間，完成一個測試所需的總時間在50分鐘以 內(nèi)，而且操作簡易方便，真正實現(xiàn)了檢測全自動化。
【附圖說明】
[0023] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使 用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它 的附圖，其中： 圖1是本發(fā)明單抗藥物曲妥珠單抗Trastuzumab試劑盒的檢測原理圖； 圖2是本發(fā)明抗藥抗體Anti-Trastuzumab試劑盒的檢測原理圖； 圖3是本發(fā)明單抗藥物曲妥珠單抗Trastuzumab試劑盒與國外知名公司同類產(chǎn)品樣本 比對圖； 圖4是本發(fā)明單抗藥物曲妥珠單抗Trastuzumab試劑盒的實際檢測濃度與理論濃度的 線性回歸圖； 圖5是本發(fā)明抗藥抗體Anti-Trastuzumab試劑盒的實際檢測濃度與理論濃度的線性回 歸圖。
【具體實施方式】
[0024] 下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施 例僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范 圍。
[0025] 實施例一： 提供一種單抗藥物曲妥珠單抗Trastuzumab試劑盒，包括生物素化抗Trastuzumab抗 體、Trastuzumab校準(zhǔn)品、Trastuzumab質(zhì)控品、AP-抗人IgG抗體、磁微粒試劑、化學(xué)發(fā)光底物 和清洗液。所述生物素化抗Trastuzumab抗體為偶聯(lián)有生物素的抗Trastuzumab抗體。所述 AP-抗人I gG抗體為AP標(biāo)記的抗人I gG抗體，是將堿性磷酸酶AP與抗人I gG抗體偶聯(lián)。所述磁 微粒試劑為表面有親和素 SA基團(tuán)的納米磁微粒懸浮液。所述清洗液可以是清洗濃縮液，在 使用時進(jìn)行配制。
[0026] 所述生物素化抗Trastuzumab抗體是生物素與抗Trastuzumab抗體分子表面的-順2基團(tuán)反應(yīng)得到。所述Trastuzumab校準(zhǔn)品是由含有Trastuzumab的人血清配制而成，用于 得到校準(zhǔn)曲線；所述Trastuzumab質(zhì)控品是由含有Trastuzumab的人血清配制而成。所述磁 微粒試劑中磁微粒的直徑為〇. 1-〇. 5μπι，所述磁微粒試劑具有超順磁性。所述化學(xué)發(fā)光底物 中包括3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽ΑΜΡΗ)， 主要成分為金剛烷(AMPH))，在堿性磷酸酶的催化下釋放光子。
[0027] 所述檢測試劑盒是基于磁微粒化學(xué)發(fā)光檢測原理來實現(xiàn)抗藥抗體的免疫含量檢 測的，其檢測原理如圖1所示：將單抗藥物樣本Trastuzumab與磁微粒試劑Μ、生物素化抗 Trastuzumab抗體R1混合，得到樣本-M-R1復(fù)合物，進(jìn)行洗滌，再加入酶結(jié)合物ΑΡ-抗人IgG抗 體R2，得到樣本-M-Rl -R2復(fù)合物，進(jìn)行洗滌，再加入化學(xué)發(fā)光底物，測定發(fā)光結(jié)果。
[0028] 實施例二： 提供一種抗藥抗體Anti-Trastuzumab試劑盒，包括生物素化Trastuzumab、抗 Trastuzumab抗體校準(zhǔn)品、抗Trastuzumab抗體質(zhì)控品、AP-抗ADA抗體、磁微粒試劑、化學(xué)發(fā) 光底物和清洗液