基于量子點(diǎn)多級(jí)檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物傳感器及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于納米材料制備和免疫組化技術(shù)交叉領(lǐng)域，涉及一種傳感器及其制作方 法尤其是一種量子點(diǎn)結(jié)合免疫探針檢測(cè)自身免疫病生物標(biāo)記物的光學(xué)傳感器及其制備方 法，應(yīng)用于檢測(cè)和監(jiān)控自身免疫疾病技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 量子點(diǎn)與傳統(tǒng)的突光染料相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1)光穩(wěn)定性好、耐漂白、熒光強(qiáng) 度約為羅丹明6G的20倍，穩(wěn)定性約為它的100倍；（2)激發(fā)光譜范圍寬并且可以實(shí)現(xiàn)多組 分同時(shí)激發(fā)；（3)發(fā)射光譜半峰寬比較窄、峰形尖銳、對(duì)稱性好及發(fā)光光譜可調(diào)性，可調(diào)波 長(zhǎng)范圍為400-2000mn，覆蓋了紫外到近紅外區(qū)域；(4)熒光壽命較長(zhǎng)；（5)顏色具有多樣 性，不同粒徑的量子點(diǎn)顏色也不同；(6)檢測(cè)便利性，對(duì)檢測(cè)儀器的要求不是很高；（7)量 子產(chǎn)率高、斯托克位移較大等。因此量子點(diǎn)廣泛應(yīng)用在生物傳感、突光探針標(biāo)記及檢測(cè)、分 子診斷、靶向治療、生物成像和生物分析等方面。
[0003] 生物傳感利用量子點(diǎn)作為一個(gè)平臺(tái)，根據(jù)調(diào)節(jié)量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度（而不是改變量 子點(diǎn)的數(shù)量）為組裝生物探針提供一種信號(hào)轉(zhuǎn)換。雖然人們對(duì)CT傳感越來(lái)越有興趣，但是 調(diào)整量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度最常見(jiàn)也許是最具特色的機(jī)制仍是熒光共振能量轉(zhuǎn)移，量子點(diǎn)是突光 共振能量轉(zhuǎn)移理想的供體，當(dāng)遇到合適的供體時(shí)也能變成極好的受體。因此，量子點(diǎn)在FRET 傳感器方面獲得了極大的發(fā)展。
[0004] 自從1998年《Science》上報(bào)道了可將生物大分子偶聯(lián)到量子點(diǎn)的表面之后，科 學(xué)研究者對(duì)量子點(diǎn)標(biāo)記生物分子越來(lái)越感興趣。最近十年這個(gè)領(lǐng)域的研究更集中于低毒 性，高生物親和性的量子點(diǎn)的合成及生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
[0005] 19世紀(jì)末，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，免疫現(xiàn)象只是機(jī)體對(duì)外界傳染因子的入侵而發(fā)生的 防御反應(yīng)，而對(duì)人體自身組織成分不產(chǎn)生抗體，稱之為免疫耐受。隨著科學(xué)發(fā)展，科學(xué)家發(fā) 現(xiàn)有一類(lèi)疾病是由于機(jī)體對(duì)自身抗原的耐受失去時(shí)，免疫系統(tǒng)對(duì)自身抗原發(fā)起攻擊進(jìn)而引 起組織或器官造成的損害，這類(lèi)疾病被稱為自身免疫病?？乖再|(zhì)變異、交叉免疫反應(yīng)、遺 傳因素和病毒因素都會(huì)引起機(jī)體的自身抗原耐受失去。
[0006] 對(duì)于自身免疫病的國(guó)際通用診斷標(biāo)準(zhǔn)主要依靠臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室對(duì)血清中自身 抗體抗原的評(píng)估，尤其是通過(guò)患者血清內(nèi)的一種或幾種生物標(biāo)記物水平表征。生物標(biāo)志物 可用來(lái)反映自身免疫病的發(fā)病機(jī)制，并用于疾病的診斷、監(jiān)測(cè)、分層和預(yù)測(cè)個(gè)人對(duì)治療的反 應(yīng)。長(zhǎng)期以來(lái)，抗dsDNA抗體、補(bǔ)體活性和免疫復(fù)合物等免疫學(xué)指標(biāo)是自身免疫病活動(dòng)性的 經(jīng)典標(biāo)志。隨著技術(shù)的進(jìn)步和研究的深入，大量新相關(guān)生物標(biāo)志物出現(xiàn)。
[0007] 生物芯片、蛋白微陣列技術(shù)是20世紀(jì)末期產(chǎn)生的高通量平行檢測(cè)技術(shù)，它一經(jīng)產(chǎn) 生就顯示了極大的優(yōu)勢(shì)，寡核苷酸微陣列已經(jīng)在基因表達(dá)和人類(lèi)疾病的研究中取得了廣泛 的成果。而蛋白質(zhì)微陣列近年來(lái)也發(fā)展迅速.已經(jīng)應(yīng)用于TORCH感染病原體和過(guò)敏原的檢 測(cè)。目前，自身抗體抗原及其類(lèi)似物的檢測(cè)手段主要是western blotting和ELISA (酶聯(lián) 免疫吸附）等，但這些手段無(wú)一例外都擁有繁瑣的制備過(guò)程，又由于需要相對(duì)大量的試劑和 臨床標(biāo)本而受到限制，并不能進(jìn)行多級(jí)檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對(duì)目前自身免疫病檢測(cè)的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于克服已有技術(shù)存在的不 足，采用新的檢測(cè)體系，提供一種基于量子點(diǎn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)多級(jí)檢測(cè)自身免疫 疾病生物標(biāo)記物的方法。提高相關(guān)疾病生物標(biāo)記物檢測(cè)的靈敏度、精確度，與其他檢測(cè)方法 相比，有更為靈敏的檢測(cè)效果，大大降低最低檢測(cè)濃度和檢出限，并且可以進(jìn)行多級(jí)檢測(cè)， 對(duì)具有多種生物標(biāo)記物的自身免疫病的檢測(cè)更具有應(yīng)用價(jià)值。
[0009] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：基于量子點(diǎn)多級(jí)檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物傳 感器，基于量子點(diǎn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)檢測(cè)自身免疫病生物標(biāo)記物體系由玻璃基底、 QDs-Ag復(fù)合物為免疫探針、二抗-DNA-Au NPs復(fù)合物為識(shí)別生物標(biāo)記物的探針構(gòu)成體 系。玻璃基底經(jīng)過(guò)硅烷化試劑進(jìn)行硅烷化修飾，在生物交聯(lián)劑作用下作為攜帶熒光信號(hào)的 QDs-Ag復(fù)合物的承載體。而二抗-DNA-Au NPs復(fù)合物中的Au NPs作為熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET)的能量受體，接受與其接近的QDs-Ag復(fù)合物提供的能量供給，從而形成熒光信號(hào)的 變化。二抗-DNA-Au NPs通過(guò)生物交聯(lián)劑結(jié)合二抗、長(zhǎng)鏈DNA及均一尺寸金納米顆粒構(gòu)成， 經(jīng)過(guò)免疫結(jié)合過(guò)程連接到體系之中。
[0010] 基于量子點(diǎn)多級(jí)檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物傳感器，該傳感器包括：利用量子點(diǎn)偶聯(lián)抗原形 成QDs-Ag復(fù)合物作為免疫探針，負(fù)載玻璃基底和識(shí)別生物標(biāo)記物的探針，所述探針為二 抗-DNA-Au NPs復(fù)合物。進(jìn)一步，所述量子點(diǎn)同抗原偶聯(lián)方法有：雙功能蛋白或生物素-親 和素介導(dǎo)非共價(jià)結(jié)合偶聯(lián)法；氨基同羧基、氨基與巰基及醛基和酰肼共價(jià)結(jié)合方法。
[0011] 本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述傳感器的方法，該方法包括以下步驟： 步驟1)、CdTe-ZnS核殼量子點(diǎn)的合成； 步驟2) QDs-Ag復(fù)合物的合成及負(fù)載； 步驟3)二抗-DNA-Au NPs復(fù)合物的合成； 進(jìn)一步，所述步驟1的核殼量子點(diǎn)合成，具體步驟如下： 步驟1. 1 :配制亞碲酸鉀溶液作為碲前體，水合乙酸鎘提供鎘源，按比例加入巰基丙酸 作為包被液，三者之間濃度比為I :2 :1. 7 ;調(diào)節(jié)體系pH在10-11，在溫度為100°C下，加熱回 流 1-10 h，得到 CdTe QDs ; 步驟1. 2 :取步驟1得到CdTe QDs加入二水合乙酸鋅和硫化鈉的混合物中，二水合乙 酸鋅和硫化鈉的比例為2 :1，以巰基丙酸溶液為包被液，三者之間濃度比為I :2 :1. 7 ;重新 調(diào)節(jié)體系的pH為10-11，采用高溫水熱法最終合成最終得到發(fā)射峰為550 nm-676 nm的 CdTe-ZnS核殼量子點(diǎn)。
[0012] 進(jìn)一步，所述步驟2的具體步驟如下： 步驟：2. 1 :將合成的CdTe-ZnS核殼量子點(diǎn)通過(guò)的交聯(lián)劑的作用，活化CdTe-ZnS核殼 量子點(diǎn)表面的羧基，同自身免疫抗原（Ag)上的氨基結(jié)合，形成QDs-Ag復(fù)合物，超速離心除 去未連接的CdTe-ZnS核殼量子點(diǎn)和自身免疫抗原（Ag); 步驟2. 2 :利用濃度為25%氫氧化鈉溶液對(duì)玻璃片進(jìn)行浸泡處理30 min，使玻璃基片表 面羥基化，再通過(guò)硅烷偶聯(lián)劑3-氨丙基-三乙氧基硅烷的浸泡使得玻璃片硅烷化；將步驟 2. 1得到的QDs-Ag復(fù)合物負(fù)載于硅烷化后的玻璃基底上，在溫度為4°C下放置過(guò)夜，完成 負(fù)載。
[0013] 進(jìn)一步，所述二抗-DNA-Au NPs復(fù)合物的合成的步驟如下： 利用交聯(lián)劑將免疫球蛋白（IgG)和二抗同3 '修飾氨基的DNA雙鏈結(jié)合，免疫球蛋白 (IgG)和二抗同3 '修飾氨基的DNA雙鏈的濃度配比為3 :1，形成二抗-DNA復(fù)合物，色譜 純化后再利用DNA 5'端修飾的巰基同Au NPs形成配位鍵，兩種濃度比為1:2. 5,構(gòu)成二 抗-DNA-Au NPs復(fù)合物，對(duì)所述二抗-DNA-Au NPs復(fù)合物使用色譜法進(jìn)行純化。
[0014] 進(jìn)一步，所述步驟2.1中的交聯(lián)劑為EDC(1-乙基-3-[3_二甲基氨基丙基]碳化 二亞胺鹽酸化物）和NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)，二者之間的質(zhì)量比為4 :1。
[0015] 4)熒光強(qiáng)度變化表征目標(biāo)物濃度。
[0016] 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)，得出不同QDs-Ag復(fù)合物熒光淬滅即熒光強(qiáng)度減小量與標(biāo)準(zhǔn) 液濃度的關(guān)系式，利用關(guān)系式在實(shí)際檢測(cè)中得出目標(biāo)物濃度。能夠同時(shí)進(jìn)行多種自身免疫 疾病生物標(biāo)記物的檢測(cè)，是本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)。
[0017] 利用納米熒光分子作為能量受體接近QDs-Ag復(fù)合物，產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET)。納米熒光分子可以是諸如CdTe、CdSn/ZnS等不同類(lèi)型的量子點(diǎn)；可以是以聚苯乙 烯、聚甲基丙烯酸酯類(lèi)、聚丙烯酰胺類(lèi)為微粒主體，表面鍵合或吸附熒光素、菁色素等熒光 物質(zhì)的熒光納米微球；也可以是金、銀納米顆粒等具有熒光性質(zhì)的貴金屬納米顆粒。這一部 分的是在那個(gè)步驟中處理的？（此部分屬于熒光淬滅部分，所涉及的是