一種猝死病分子探針及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種急診醫(yī)學檢驗技術領域，特別是涉及一種猝死分子探針及猝死分子探針的制備方法。
【背景技術】
[0002]猝死病是世界上最可怕的疾病，其發(fā)病率超過大腸癌、乳腺癌、前列腺癌、流感、肺炎、車禍、HIV、槍支案件和家庭火災致死人數(shù)的總和，全球每年有1200萬人猝死，中國每年有180萬人猝死。據(jù)臨床醫(yī)學統(tǒng)計，猝死癥發(fā)病后，其小時病死率達2%，周病死率達50%，月病死率達75%，年病死率達90%，10年病死率達100%。研究發(fā)現(xiàn)，99%的猝死癥患者發(fā)病前尿液現(xiàn)猝死抗原，其靈敏度達98%，特異性達100%。
[0003]研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+綁定親粹死抗原復合體(troponin complex)，使粹死抗原的頭部搭在肌動蛋白上形成過橋后，猝死抗原ATP酶水解釋放能量，產(chǎn)生張力，并使肌動蛋白滑動。
[0004]肌動蛋白+猝死抗原-ATP —肌動猝死抗原+ADP+P1。
[0005]心肌舒張，必需充足的ATP激活猝死抗原ATP酶，以恢復收縮力。
[0006]肌動猝死抗原+ATP —肌動蛋白+猝死抗原-ATP。
[0007]疲勞產(chǎn)生血乳酸、缺氧、感染激活磷脂酶水解心肌細胞膜磷脂和猝死抗原分子上的磷酸基，使猝死抗原失去活性進入血液、尿液，心肌細胞猝死抗原停止運載肌動蛋白，宏觀上表現(xiàn)心肌不收縮，猝死抗原分子馬達消逝生命動力致猝死病發(fā)生。
[0008]猝死抗原主要存于心肌細胞和骨骼肌細胞，正常人尿液不含猝死抗原。心肌細胞和骨骼肌細胞嚴重損傷，猝死抗原失活進入血液，機體出現(xiàn)體液免疫反應。猝死抗原經(jīng)腎排泄進入尿液，遇TMB-SNE-AMS顯藍色反應。因此，猝死抗原成為早期猝死病的血液、尿液生化標志物。
[0009]猝死癥起病急驟病情兇險，恢復緩慢病死率高，威脅中、青年人，已成為IT業(yè)等職場上最大的隱形殺手。
[0010]目前尚無理想的檢測設備和檢測試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的，在于提供一種猝死病分子探針，使用本發(fā)明的猝死病分子探針操作簡單快速，結果準確穩(wěn)定，檢測成本低廉，適于個人、家庭和診所，有益于猝死病患者的及時診斷和搶救。
[0012]本發(fā)明的另一目的，是提供一種猝死病分子探針的制備方法。
[0013]采用的技術方案是:
一種猝死病分子探針，其特征是依次由ABS襯墊、樣品墊、金標墊、硝酸纖維素墊、吸水墊和保護墊疊貼在一起構成。其中樣品墊疊貼金標墊厚度為0.9-1.lmn，吸水墊疊貼硝酸纖維素墊厚度為0.9-1.lmn。
[0014]所述的樣品墊為經(jīng)Tris、酪蛋白鈉鹽液處理過的包被ProteinA的玻璃纖維素膜，所述的金標墊為經(jīng)Tris、牛血清液處理過的包被鼠抗人粹死抗原單克隆抗體-膠體金復合物的玻璃纖維膜，所述的硝酸纖維素墊的檢測區(qū)為包被特異性的基因重組猝死抗原的T線，所述的硝酸纖維素墊的質控區(qū)為包被羊抗鼠IgG多克隆抗體的C線，所述的T線包被的猝死抗原量高于樣液中能與金標墊中交聯(lián)抗體結合的猝死抗原量。
[0015]—種猝死病分子探針的制備方法，包括下述步驟:
1)、制備鼠抗人猝死抗原單克隆抗體:以人猝死抗原為抗原，脾內(nèi)注射免疫鼠，取免疫鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合制備雜交瘤細胞，再將雜交瘤細胞接種于鼠腹腔制備腹水，提取鼠抗人猝死抗原單克隆抗體；
2)、制備羊抗鼠IgG多克隆抗體:以鼠抗人猝死抗原單克隆抗體免疫山羊，取血清經(jīng)離心制得羊抗鼠IgG多克隆抗體；
3)、制備膠體金:取0.01%HAuC14水溶液100ml，加入1%枸櫞酸三鈉水溶液0.75ml，加熱煮沸至溶液呈紅色，冷卻至4°C，加入0.1Mol/L K2C03 0.5ml制成50nm膠體金；
4)、制備鼠抗人猝死抗原單克隆抗體-膠體金復合物:用0.1M碳酸鉀調(diào)膠體金溶液pH值至8.2，按0.02mgIgM /mL膠體金的比例加入鼠抗人粹死抗原單克隆抗體混勾，高速離心棄上清液，制得鼠抗人猝死抗原單克隆抗體-膠體金復合物，置5%的牛血清白蛋白、1%聚乙二醇、0.02M Tris-HCl緩沖液中保存?zhèn)溆茫?br> 5)、制備樣品墊:將ProteinA用pH值為8.2的2%海藻糖和0.02Mol/LPBS液稀釋至lmg/mL后均勻噴涂在玻璃纖維素膜，充分干燥制得樣品墊；
6)、制備金標墊:將鼠抗人猝死抗原單克隆抗體-膠體金復合物均勻包被在玻璃纖維膜上，充分干燥制得金標墊；
7)、制備硝酸纖維素墊:將羊抗鼠IgG多克隆抗體和重組猝死病抗原分別包被在硝酸纖維素膜的質控區(qū)和檢測區(qū)，充分干燥制得硝酸纖維素墊；
8)、制備猝死病分子探針:將樣品墊、金標墊、硝酸纖維素墊和吸水墊依次貼在ABS襯墊上，樣品墊疊金標墊lmn，金標墊疊硝酸纖維素墊lmn，吸水墊疊硝酸纖維素墊lmn制得粹死病分子探針，即得。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)勢在于:
(1)生產(chǎn)工藝簡單，探針小巧便攜；
(2)無創(chuàng)取病樣:口液、鼻液、淚液、尿液；
(3)檢測速度快，5分鐘完成試驗；
(4)單克隆金標，定性結果準確穩(wěn)定；
本發(fā)明為搶救猝死病患者提供一種快速檢驗方法，提高了猝死病人的搶救成功幾率。
【附圖說明】
[0017]圖1是本發(fā)明的猝死病分子探針分解結構示意圖。
[0018]圖2、圖3、圖4、圖5、圖6和圖7為猝死病分子探針檢測流程圖。
[0019]圖8、圖9、圖10和圖11為本發(fā)明的猝死分子探針檢測結果顯示圖。
【具體實施方式】
[0020]實施例一
一種猝死病分子探針，其特征是依次由ABS襯墊1、樣品墊2、金標墊3、硝酸纖維素墊4、吸水墊5和保護墊6疊粘在一起構成。其中，樣品墊2疊貼金標墊厚為lmn，金標墊疊貼硝酸纖維素墊厚為lmn，吸水墊疊硝酸纖維素墊厚為lmn。
[0021]金標墊包被鼠抗人猝死抗原單克隆抗體-膠體金復合物，硝酸纖維素墊檢測區(qū)包被特異性的基因重組猝死抗原，硝酸纖維素墊質控區(qū)包被羊抗鼠IgG多克隆抗體。
[0022]實施例二
一種猝死病分子探針及其制備方法，其結構與實施例一基本相同，其不同之處是樣品墊2疊貼金標墊厚為0.9mn，金標墊疊貼硝酸纖維素墊厚為0.9mn，吸水墊疊貼硝酸纖維素墊厚為0.9mn。
[0023]實施例三
一種猝死病分子探針及其制備方法，其結構與實施例一基本相同，其不同之處是樣品墊2疊貼金標墊厚為1.lmn，金標墊疊貼硝酸纖維素墊厚為1.lmn，吸水墊疊貼硝酸纖維素墊厚為1.lmn。
[0024]圖2-圖7顯示本發(fā)明的猝死病分子探針檢測方法:用棉簽取樣液或手持猝死病分子探針，將樣品墊垂直浸入樣液1秒鐘，5分鐘定性判斷檢測猝死病結果。若C線、T線均顯紅帶，提示猝死病風險；若C線顯紅帶，T線不顯紅帶，則提示無猝死病風險；若C線不顯紅帶，則提示猝死病分子探針無效。
[0025]實施例四
圖8-圖11顯示本發(fā)明的猝死病分子探針檢測原理:檢測時，樣液中的猝死抗原與金標記鼠抗人猝死抗原單抗結合形成抗原抗體復合物，流向硝酸纖維素墊的T區(qū)時，固定在硝酸纖維素墊上的重組猝死抗原特異性抗原捕獲該復合物并逐漸凝集成一條肉眼可見的紅T線，未結合的金標記鼠抗人猝死抗原單抗流過T區(qū)被C區(qū)的羊抗鼠多抗捕獲形成肉眼可見的紅C線。顯示C線則表明猝死病分子探針有效；顯示T線則表明液樣中含猝死病抗原。
[0026]結果判斷:如果樣液中存在猝死病抗原，則質控線、檢測線均顯紅色條帶，結果為陽性；如果樣液中不存在猝死病抗原，則僅質控線顯紅色條帶；如質控線處未見條帶，則猝死病分子探針無效。
【主權項】
1.一種猝死病分子探針，其特征是依次由ABS襯墊(1 )、樣品墊(2)、金標墊(3)、硝酸纖維素墊(4 )、吸水墊(5 )和保護墊(6 )疊粘在一起構成；其中，樣品墊(2 )疊貼金標墊厚為lmn，金標墊疊貼硝酸纖維素墊厚為lmn，吸水墊疊硝酸纖維素墊厚為lmn。2.根據(jù)權利要求1所述的一種猝死病分子探針及其制備方法，其特征在于:樣品墊(2)疊貼金標墊厚為0.9mn，金標墊疊貼硝酸纖維素墊厚為0.9mn，吸水墊疊貼硝酸纖維素墊厚為 0.9mn。3.根據(jù)權利要求1所述的一種猝死病分子探針及其制備方法，其特征在于:樣品墊(2)疊貼金標墊厚為1.lmn，金標墊疊貼硝酸纖維素墊厚為1.lmn，吸水墊疊貼硝酸纖維素墊厚為 1.lmn ο4.根據(jù)權利要求1所述的一種猝死病分子探針及其制備方法，其特征在于:所述的樣品墊為經(jīng)Tris、酪蛋白鈉鹽液處理過的包被ProteinA的玻璃纖維素膜，所述的金標墊為經(jīng)Tris、牛血清液處理過的包被鼠抗人猝死抗原單克隆抗體-膠體金復合物的玻璃纖維膜，所述的硝酸纖維素墊的檢測區(qū)為包被特異性的基因重組猝死抗原的T線，所述的硝酸纖維素墊的質控區(qū)為包被羊抗鼠IgG多克隆抗體的C線，所述的T線包被的猝死抗原量高于樣液中能與金標墊中交聯(lián)抗體結合的猝死抗原量。5.根據(jù)權利要求1所述的一種猝死病分子探針的制備方法，其特征在于:包括下述步驟: 1)、制備鼠抗人猝死抗原單克隆抗體:以人猝死抗原為抗原，脾內(nèi)注射免疫鼠，取免疫鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合制備雜交瘤細胞，再將雜交瘤細胞接種于鼠腹腔制備腹水，提取鼠抗人猝死抗原單克隆抗體； 2)、制備羊抗鼠IgG多克隆抗體:以鼠抗人猝死抗原單克隆抗體免疫山羊，取血清經(jīng)離心制得羊抗鼠IgG多克隆抗體； 3)、制備膠體金:取0.01%HauC14水溶液100ml，加入1%枸櫞酸三鈉水溶液0.75ml，加熱煮沸至溶液呈紅色，冷卻至4°C，加入0.1Mol/L K2C03 0.5ml制成50nm膠體金； 4)、制備鼠抗人猝死抗原單克隆抗體-膠體金復合物:用0.1M碳酸鉀調(diào)膠體金溶液pH值至8.2，按0.02mgIgM /mL膠體金的比例加入鼠抗人粹死抗原單克隆抗體混勾，高速離心棄上清液，制得鼠抗人猝死抗原單克隆抗體-膠體金復合物，置5%的牛血清白蛋白、1%聚乙二醇、0.02M Tris-HCl緩沖液中保存?zhèn)溆茫? 5)、制備樣品墊:將ProteinA用pH值為8.2的2%海藻糖和0.02Mol/LPBS液稀釋至lmg/mL后均勻噴涂在玻璃纖維素膜，充分干燥制得樣品墊； 6)、制備金標墊:將鼠抗人猝死抗原單克隆抗體-膠體金復合物均勻包被在玻璃纖維膜上，充分干燥制得金標墊； 7)、制備硝酸纖維素墊:將羊抗鼠IgG多克隆抗體和重組猝死病抗原分別包被在硝酸纖維素膜的質控區(qū)和檢測區(qū)，充分干燥制得硝酸纖維素墊； 8)、制備猝死病分子探針:將樣品墊、金標墊、硝酸纖維素墊和吸水墊依次貼在ABS襯墊上，樣品墊疊金標墊lmn，金標墊疊硝酸纖維素墊lmn，吸水墊疊硝酸纖維素墊lmn制得粹死病分子探針，即得。
【專利摘要】一種猝死病分子探針，其特征是依次由ABS襯墊、樣品墊、金標墊、硝酸纖維素墊、吸水墊和保護墊疊粘在一起構成。其中，樣品墊疊貼金標墊厚為1mn，金標墊疊貼硝酸纖維素墊厚為1mn，吸水墊疊硝酸纖維素墊厚為1mn。本發(fā)明的優(yōu)勢在于：生產(chǎn)工藝簡單，探針小巧便攜；無創(chuàng)取病樣:口液、鼻液、淚液、尿液；檢測速度快，分鐘完成試驗；單克隆金標，定性結果準確穩(wěn)定；本發(fā)明為搶救猝死病患者提供一種快速檢驗方法，提高了猝死病人的搶救成功幾率。
【IPC分類】G01N33/531, G01N33/53
【公開號】CN105259341
【申請?zhí)枴緾N201510711946
【發(fā)明人】周伊娃, 雷耀輝, 苑振貴, 吳玉寶, 劉丹
【申請人】苑振貴
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年10月28日