一種免固定生物傳感電極的制備及其在免標(biāo)記均相光致電化學(xué)農(nóng)殘檢測(cè)與癌癥診斷中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種可特異性地吸附單鏈DNA而不吸附雙鏈DNA的免固定生物傳感電極的制備及其免標(biāo)記均相光致電化學(xué)分析方法的應(yīng)用。通過目標(biāo)分子引起單鏈DNA至雙鏈DNA轉(zhuǎn)化，使卟啉分子在電極表面的吸附量減少，通過光致電化學(xué)檢測(cè)卟啉分子的光致電化學(xué)信號(hào)的減小，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)農(nóng)殘分子或癌癥標(biāo)志物的簡單、快速、免標(biāo)記、均相、高靈敏檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]光致電化學(xué)生物傳感器是最新興的一類生物傳感器，已在疾病監(jiān)測(cè)與診斷、藥物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域成為強(qiáng)有力的生化分析及生物傳感工具。光致電化學(xué)傳感器主要是采用固體電極作為基礎(chǔ)電極，將生物活性分子作為分子識(shí)別探針固定在電極表面，然后通過生物分子間的特異性識(shí)別作用，使目標(biāo)分子捕獲到電極表面，基礎(chǔ)電極將濃度信號(hào)轉(zhuǎn)換成光電壓、光電流、光阻抗等可測(cè)量的信號(hào)作為響應(yīng)信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子的定量分析。此外，與現(xiàn)代大規(guī)模集成電路技術(shù)相結(jié)合，極易實(shí)現(xiàn)光致電化學(xué)生物傳感器的微型化、集成化與批量化生產(chǎn)，因此，光致電化學(xué)生物傳感器不僅具有靈敏度高、分析速度快、操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，還具備設(shè)備便攜性高、設(shè)備成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)，基于以上優(yōu)勢(shì)，光致電化學(xué)生物傳感器在諸多現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)分析檢測(cè)及高通量應(yīng)用中大顯身手。
[0003]然而，現(xiàn)有的光致電化學(xué)生物傳感器大都將生物識(shí)別功能的生物分子固定在固相電極表面用來捕獲液相中目標(biāo)分子的異相分析方法。異相分析法主要存在如下缺陷:一方面，生物識(shí)別分子在固相電極表面的固定過程通常是一個(gè)非常繁瑣的化學(xué)修飾過程，有時(shí)所用試劑成本很高。另一方面，由于固相電極表面的空間位阻效應(yīng)，生物識(shí)別分子被固定在固相電極表面后，往往會(huì)導(dǎo)致生物分子的空間構(gòu)象發(fā)生很大變化，并給生物分子識(shí)別位點(diǎn)的空間取向帶來很大的不確定性，導(dǎo)致固定化的生物識(shí)別分子對(duì)液相中目標(biāo)分子的結(jié)合/識(shí)別能力與效率大大降低。與異相分析方法相比，完全在溶液中進(jìn)行的均相生物分子識(shí)別反應(yīng)不存在上述缺陷。
[0004]因此，采用均相反應(yīng)的分析方法受到廣泛關(guān)注。然而，基于電極的均相分析方法目前只在電化學(xué)生物傳感器中得到一定的程度的發(fā)展。均相電化學(xué)生物傳感器主要采用氧化銦錫導(dǎo)電玻璃(ΙΤ0)電極作為基礎(chǔ)電極，且無需在ΙΤ0電極表面固定任何生物識(shí)別分子，所有的生物識(shí)別反應(yīng)及其它生化反應(yīng)均在溶液中進(jìn)行。均相電化學(xué)生物傳感器主要通過檢測(cè)溶液中生成/激活的電化學(xué)活性物質(zhì)(例如亞甲基藍(lán)或二茂鐵)標(biāo)記DNA的擴(kuò)散電流的強(qiáng)弱實(shí)現(xiàn)定量分析。然而，現(xiàn)有的均相電化學(xué)生物傳感器主要存在三大缺陷。第一，電化學(xué)活性物質(zhì)需被標(biāo)記在DNA鏈的末端。該標(biāo)記過程亦是一個(gè)非常復(fù)雜的高難度化學(xué)修飾和提純過程，且成本極高。第二，擴(kuò)散電流檢測(cè)法無法最大限度地利用溶液中生成/激活的電化學(xué)活性物質(zhì)標(biāo)記DNA，導(dǎo)致其電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度及靈敏度受限，第三，電化學(xué)生物傳感器主要通過電流/電壓激發(fā)產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，激發(fā)源與檢測(cè)信號(hào)的能量形式相同，導(dǎo)致背景信號(hào)或干擾信號(hào)較高。因此，設(shè)計(jì)制備新型的免標(biāo)記均相光致電化學(xué)生物傳感器，實(shí)現(xiàn)高靈敏度的生化分析與生物傳感勢(shì)在必行。
[0005]本發(fā)明針對(duì)這一問題，在固相電極表面原位制備一層含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)及負(fù)電官能團(tuán)的復(fù)合薄膜，制備免固定生物傳感電極。該電極能夠特異性地吸附單鏈DNA，而不吸附雙鏈DNA。利用卟啉分子與電極表面吸附的單鏈DNA的親和力，可定量檢測(cè)電極表面單鏈DNA的吸附量。基于上述免固定生物傳感電極，設(shè)計(jì)一種免標(biāo)記均相農(nóng)殘/癌癥標(biāo)志物光致電化學(xué)分析方法，該分析方法包含一個(gè)目標(biāo)分子觸發(fā)的生化反應(yīng)回路。該生化反應(yīng)回路可根據(jù)目標(biāo)分子的多少，定量地將可被電極吸附的單鏈DNA轉(zhuǎn)化為不可被電極吸附的雙鏈DNA，不僅實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子的高靈敏檢測(cè)，而且提高了溶液中單鏈DNA及光致電化學(xué)活性物質(zhì)的利用率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種免固定生物傳感電極，用該電極實(shí)現(xiàn)農(nóng)殘與癌癥標(biāo)志物的免標(biāo)記、均相、高靈敏光致電化學(xué)檢測(cè)。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種免固定生物傳感電極，它是通過電還原的方式，將4-羧基苯基重氮鹽與4-聯(lián)苯基重氮鹽同時(shí)沉積在電極表面，形成復(fù)合薄膜修飾電極，即制得免固定生物傳感電極。
[0008]上述電極可以是玻碳電極、金電極或氧化銦錫導(dǎo)電玻璃電極(ΙΤ0)。
[0009]—種免固定生物傳感電極的制備方法，它由下列步驟組成:
步驟1.將一定量的對(duì)羧基苯胺與4-氨基聯(lián)苯混合后溶于含有0.2 - 0.7M HC1的無氧水溶液中，對(duì)羧基苯胺與4-氨基聯(lián)苯的摩爾比為5:1-1:5 ;
步驟2.在不斷攪拌的前提下，將濃度為1 - 8mM的亞硝酸鈉無氧水溶液以0.2 -0.5mL/min的速度滴入到步驟1所得的溶液中，反應(yīng)20 - 50min，即制得重氮鹽混合液，攪拌速度為 1000 - 3000 r/min ；
步驟3.若所用電極為金電極或玻碳電極，需將電極依次用粒徑為1.0、0.3和0.05微米的A1203拋光粉拋光，金電極還需再浸入一定濃度的硫酸溶液中，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直至循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定，若所用電極為ΙΤ0電極，只需將ΙΤ0電極在2.0 - 9.0mol/L的NaOH溶液中浸泡4 - 9小時(shí)，以上每步處理后均需用超純水充分淋洗并氮?dú)獯蹈桑?br> 步驟4.如圖1所示，將步驟3所得電極浸入到步驟2所得重氮鹽混合液中，以此電極為工作電極，飽和甘汞電極或Ag/AgCl電極為參比電極、鉑絲為對(duì)電極，在0.5 V至-0.3V電壓范圍內(nèi)進(jìn)行兩次連續(xù)的循環(huán)伏安掃描，掃描速度為100 - 200 mV/s ;
步驟5.將步驟4所得電極分別在乙腈和超純水中超聲清洗2 - 8min，氮?dú)獯蹈?，即制得免固定生物傳感電極。
[0010]上述對(duì)羧基苯胺可以替換為對(duì)磺酸基苯胺。
[0011]上述4-氨基聯(lián)苯可以替換為苯胺。
[0012]—種基于上述免固定生物傳感電極的免標(biāo)記均相光致電化學(xué)生物傳感器，它以含有1 - 5 μ Μ無任何標(biāo)記的DNA發(fā)卡(DNA-1)、1 - 5 μ Μ無任何標(biāo)記的DNA單鏈(DNA-2)、1 - 8U的DNA聚合酶、100 - 500 μ Μ脫氧核糖核苷三磷酸混合物(dNTPs)的混合溶液為檢測(cè)液，以含有2 - 5mM卟啉的Tris - HC1緩沖液為信號(hào)液。
[0013]如圖2所示，上述DNA-1具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，從5’端開始的前50個(gè)堿基包含目標(biāo)分子的特異性核酸適配體序列，其余為隨機(jī)序列。
[0014]如圖2所示，上述DNA-2包含兩個(gè)序列段，從3’端開始的序列段與DNA-1的3’端莖序列完全互補(bǔ)配對(duì)，另一個(gè)序列段為隨機(jī)序列。
[0015]上述的卟啉為5，10, 15，20-四(4_氨基苯基)卟啉、5，10, 15，20-四(N-甲基-4-吡啶鑰)卟吩對(duì)甲苯磺酸鹽或α，β，γ，δ -四(4-Ν-三甲基氨基苯基)卟吩。
[0016]上述檢測(cè)液的緩沖體系為含50 mM NaClUO mM MgCl2、l mM 二硫蘇糖醇的10 mMTris - HC1 緩沖體系，pH= 7.9。
[0017]上述免標(biāo)記均相生物傳感器，它由下列操作步驟組成:
步驟1.將5 - 10 μ L含有不同濃度目標(biāo)分子的樣品溶液與40 - 45 μ L檢測(cè)液混合，溫育反應(yīng)20 - 120 min分鐘，溫度為20 - 40攝氏度，
步驟2.將步驟1所得溶液轉(zhuǎn)移至免固定生物傳感電極表面，溫育反應(yīng)20 - 50 min，溫度為20 - 40攝氏度，
步驟3.將步驟2所得的電極用超純水充分淋洗后，在卟啉信號(hào)液中浸泡20 - 50min，取出后用超純水充分淋洗，
步驟4.光致電化學(xué)檢測(cè)，將步驟3所得電極浸入含有0.1 - 0.6M的抗壞血酸的磷酸鹽緩沖電解質(zhì)中，進(jìn)行光致電化學(xué)檢測(cè)，工作偏壓為-1 V至IV，光源波長為500 - 200 nm，光源強(qiáng)度為100 - 200W/m2。
[0018]上述免固定生物傳感電極區(qū)分單鏈DNA與雙鏈DNA的原理:
單鏈DNA堿基上的多元雜環(huán)是完全暴露的，可與復(fù)合薄膜表面的苯環(huán)之間產(chǎn)生較強(qiáng)的π - π共軛作用力，該作用力比DNA磷酸脂骨架與復(fù)合薄膜表面羧基之間的負(fù)-負(fù)靜電排斥作用力更強(qiáng)，使得單鏈DNA可被牢固地吸附到該復(fù)合薄膜表面；當(dāng)單鏈DNA與其互補(bǔ)序列雜交形成雙鏈DNA后，堿基上的多元雜環(huán)被隱藏在雙鏈DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，導(dǎo)致其無法與復(fù)合薄膜表面的苯環(huán)產(chǎn)生31-31共軛作用力，在DNA磷酸脂骨架與復(fù)合薄膜表面羧基之間的負(fù)-負(fù)靜電排斥作用力下，雙鏈DNA無法吸附在該復(fù)合薄膜，因此，該復(fù)合薄膜修飾的免固定生物傳感電極可特異性地區(qū)分單鏈DNA與互補(bǔ)配對(duì)的雙鏈DNA。
[0019]本免標(biāo)記均相光致電化學(xué)生物傳感器測(cè)定農(nóng)殘/癌癥標(biāo)志物的原理如圖3所示: 不存在目標(biāo)分子時(shí)，DNA-1和DNA-2之間不會(huì)發(fā)生任何雜交反應(yīng)，且均可吸附到免固定生物傳感電極表面；此時(shí)卟啉可借助電極表面的DNA-1與DNA-2吸附到電極表面，產(chǎn)生較強(qiáng)的光致電化學(xué)信號(hào)響應(yīng)；當(dāng)目標(biāo)分子存在時(shí)，目標(biāo)分子與DNA-1中核酸適配體序列發(fā)生特異性結(jié)合，使DNA-1發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)化，其發(fā)卡結(jié)構(gòu)被打開，并與DNA-2發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)，雜交生成較短的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，DNA聚合酶可同時(shí)識(shí)別該DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中DNA-1和DNA-2的3’端，并分別以DNA-2和DNA-1為模板，將DNA-1和DNA-2的3’端聚合延長，該聚合延長過程同時(shí)破壞了目標(biāo)分子與DNA-1中核酸適配體序列的結(jié)合，釋放出的目標(biāo)分子可與下一個(gè)DNA-1結(jié)合，從而繼續(xù)引發(fā)新一輪DNA聚合延長反應(yīng)，最終將大量的DNA-1和DNA-2轉(zhuǎn)變?yōu)闊o法吸附到免固定生物傳感電極表面表面的長雙鏈DNA (堿基對(duì)數(shù)大于30對(duì))，導(dǎo)致DNA-1與DNA-2在電極表面吸附量的減少及P卜啉光致電化學(xué)響應(yīng)的降低。
[0020]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下特點(diǎn):
本發(fā)明提供了一種可特異性吸附單鏈DNA而不吸附雙鏈DNA的免固定生物傳感電極，結(jié)合一種配套的免標(biāo)記均相農(nóng)殘/癌癥標(biāo)志物分析方法，構(gòu)建高靈敏度、高選擇性的農(nóng)殘/癌癥標(biāo)志物光致電化學(xué)生物傳感器，相對(duì)現(xiàn)有的農(nóng)殘/癌癥標(biāo)志物檢測(cè)方法，具有以下特占.(1)本發(fā)明所述的免固定生物傳感電極，在不固定任何生物識(shí)別分子的前提下，可直接檢測(cè)生物分子的吸附電流，與傳統(tǒng)均相電化學(xué)中的擴(kuò)散電流檢測(cè)相比，信號(hào)強(qiáng)度要高三個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0021](2)本發(fā)明所述的免固定生物傳感電極是通過電還原苯基重氮鹽的方式制備的，通過該方法獲得的電極表面有機(jī)復(fù)合薄膜穩(wěn)定性高，重復(fù)性好，可重復(fù)使用50次以上，并可在室溫下穩(wěn)定存儲(chǔ)4個(gè)月以上。
[0022](3)本發(fā)明所述的基于免固定生物傳感電極的免標(biāo)記均相光致電化學(xué)生物傳感器采用核酸適配體作為分子識(shí)別探針，與傳統(tǒng)農(nóng)殘/癌癥標(biāo)