一種基于絲網(wǎng)印刷電極檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的傳感器的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于絲網(wǎng)印刷電極檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的傳感器的制備方法及應(yīng)用，屬于生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0002]我國是蔬菜生產(chǎn)和消費大國。病蟲害是影響蔬菜產(chǎn)量的主要因素之一，每年有20%以上的蔬菜損失是因為病蟲害導(dǎo)致的，為了確保農(nóng)業(yè)增產(chǎn)和農(nóng)民增收，在蔬菜種植過程中會使用大量的農(nóng)藥，平均一年施藥達(dá)26次之多。我國使用的殺蟲劑有70%是有機(jī)磷農(nóng)藥，有機(jī)磷農(nóng)藥毒性大、觸殺面廣，引起的中毒事故非常突出。我國加入世貿(mào)組織之后，因為不符合歐美等發(fā)達(dá)國家的相關(guān)農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)的勞動密集型產(chǎn)品，例如茶葉、糧食等農(nóng)產(chǎn)品屢屢遭到退貨、銷毀、暫停進(jìn)口的處理。要避免上述情況的發(fā)生，除了從源頭上控制農(nóng)藥的使用外，及時、準(zhǔn)確地檢測出蔬菜中的農(nóng)藥殘留量是保障農(nóng)產(chǎn)品安全的重要環(huán)節(jié)。
[0003]傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留檢測方法有氣相色譜法、高效液相色譜法、質(zhì)譜法、氣質(zhì)聯(lián)用儀等，但這些檢測方法使用的儀器價格昂貴，需對樣品進(jìn)行繁瑣的分離、提取、衍生化等預(yù)處理步驟，耗時、成本高，而且存在有機(jī)溶劑污染環(huán)境等問題，需要專業(yè)技術(shù)人員維護(hù)，不適用于現(xiàn)場檢測。乙酰膽堿酯酶(AChE)生物傳感器是通過檢測接觸農(nóng)藥前后酶催化底物產(chǎn)生電流的變化來測定農(nóng)藥濃度，易于實現(xiàn)檢測儀器的便攜和在線檢測，且操作簡單分析速度快，可用于農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場檢測。絲網(wǎng)印刷電極輕巧，攜帶方便，可一次性使用，將絲網(wǎng)印刷電極用于乙酰膽堿酯酶生物傳感器，更加適合于農(nóng)藥殘留的快速檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種能夠克服傳統(tǒng)檢測技術(shù)的不足，具有操作簡單、成本低廉、檢測靈敏度高等優(yōu)點的乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備及應(yīng)用。采用技術(shù)方案如下:
一種基于絲網(wǎng)印刷電極檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的傳感器的制備方法及應(yīng)用，其特征在于，是在清洗活化后的絲網(wǎng)印刷電極表面先后修飾上制備的納米四氧化三鐵-殼聚糖的復(fù)合物和有序介孔碳-殼聚糖的復(fù)合物，然后在修飾好的電極上滴加乙酰膽堿酯酶，得到檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的乙酰膽堿酯酶生物傳感器。
[0005]所述方法步驟如下:
O納米四氧化三鐵-殼聚糖復(fù)合物和有序介孔碳-殼聚糖復(fù)合物的制備；
2)清洗活化絲網(wǎng)印刷電極，得到預(yù)處理的絲網(wǎng)印刷電極；
3)將步驟I)制備得到的納米四氧化三鐵-殼聚糖復(fù)合物和有序介孔碳-殼聚糖復(fù)合物先后修飾到步驟2)預(yù)處理的絲網(wǎng)印刷電極上，得到修飾好的絲網(wǎng)印刷電極；
4)將乙酰膽堿酯酶滴加到步驟3)所得的修飾好的絲網(wǎng)印刷電極上，自然晾干后得到基于絲網(wǎng)印刷電極的乙酰膽堿酯酶生物傳感器； 5)優(yōu)化步驟4)所得的乙酰膽堿酯酶生物傳感器的三種試驗條件；
6)在步驟5)所得的最優(yōu)條件下，對甲胺磷和毒死蜱進(jìn)行檢測。
[0006]所述方法，其特征在于，步驟I)所述納米四氧化三鐵-殼聚糖復(fù)合物和有序介孔碳-殼聚糖復(fù)合物分別是以殼聚糖為分散劑，分散納米四氧化三鐵和有序介孔碳，得到的分散均勻的懸濁液。
[0007]所述方法，其特征在于，步驟3)所述絲網(wǎng)印刷電極電極的修飾，是先將8 μ L納米四氧化三鐵-殼聚糖復(fù)合物滴加到預(yù)處理的絲網(wǎng)印刷電極上，室溫下晾干后，再滴加上8μ L有序介孔碳-殼聚糖復(fù)合物，室溫下晾干，得到四氧化三鐵-殼聚糖/介孔碳-殼聚糖修飾的絲網(wǎng)印刷電極。
[0008]所述方法，其特征在于，步驟4)所述在修飾好的電極上滴加乙酰膽堿酯酶，是將5μ L 0.02U/ μ L的乙酰膽堿酯酶滴加到四氧化三鐵-殼聚糖/介孔碳-殼聚糖修飾好的絲網(wǎng)印刷電極上，在4°C條件下干燥，得到乙酰膽堿酯酶生物傳感器。
[0009]所述方法，其特征在于，步驟5)所述乙酰膽堿酯酶生物傳感器的三種試驗條件測試底液PH值、乙酰膽堿酯酶固定量、孵育時間進(jìn)行了優(yōu)化:pH值為8.0，乙酰膽堿酯酶固定為0.1 U，孵育時間為12 Hiin0
[0010]所述方法，其特征在于，具體步驟如下:
O納米四氧化三鐵-殼聚糖復(fù)合物和有序介孔碳-殼聚糖復(fù)合物的制備:稱取0.5 g殼聚糖(CS)置于燒杯中，加入1.0 %的醋酸溶液攪拌溶解，將溶解好的溶液置于250 mL容量瓶中并定容，定容后的溶液倒入燒杯中，在磁力攪拌器下磁力攪拌10 h，得到0.2%的殼聚糖溶液；取納米四氧化三鐵(Fe3O4)顆粒2 mg，分散于4 mL 0.2%的殼聚糖溶液中，在超聲波清洗機(jī)中超聲至分散均勾，得到0.5 mg/mL納米四氧化三鐵-殼聚糖復(fù)合物；取2 mg有序介孔碳(OMC)溶于4 ml的0.2%殼聚糖溶液中，在超聲波清洗機(jī)中超聲I小時得到均一、淺黑色的懸濁液，即為0.5 mg/mL有序介孔碳-殼聚糖復(fù)合物；
2)絲網(wǎng)印刷電極的清洗、活化:首先，將絲網(wǎng)印刷碳電極放入盛有ImMNaOH溶液的小燒杯中超聲清洗5分鐘，超純水清洗，氮氣吹干，然后，將電極放入盛有ImM HCl溶液的小燒杯中超聲清洗5分鐘，超純水清洗，氮氣吹干，之后，用無水乙醇清洗電極，氮氣吹干，最后，在pH=5的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行電流-時間曲線掃描300s，之后，進(jìn)行循環(huán)伏安曲線掃描，直至性能穩(wěn)定；
3)絲網(wǎng)印刷電極的修飾:在絲網(wǎng)印刷電極上滴加8μ L 0.5 mg/mL的四氧化三鐵-殼聚糖溶液，在室溫下放置自然干燥，得到四氧化三鐵-殼聚糖電極，接著在滴加過四氧化三鐵-殼聚糖溶液的電極上滴加8 μ L 0.5 mg/mL的介孔碳-殼聚糖溶液，在室溫條件下放置自然干燥，得到四氧化三鐵-殼聚糖/介孔碳-殼聚糖電極；
4)乙酰膽堿酯酶的固定:在上述的電極上滴加5μ L 0.02 U的乙酰膽堿酯酶(AChE)，在4°C條件下干燥，得到乙酰膽堿酯酶生物傳感器，并將制備好的電極放于4 °(:干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫?br> 5)試驗條件的優(yōu)化:制備一系列pH值的磷酸鹽緩沖液，pH值分別為6.0,6.5,7.0,7.5、8.0、8.5、9.0，并分別配成了一系列的1.0 mmol/L硫代乙酰膽堿(ATC1)底液，在這些底液中對傳感器電流值進(jìn)行檢測，篩選出最佳pH值8.0 ;分別向電極負(fù)載0.02 U,0.04 U、0.06U,0.08 U、0.1 U、0.12 U、0.14 U的酶量，對其電流值進(jìn)行檢測，篩選出最佳酶負(fù)載量為0.1U;用同一濃度的農(nóng)藥孵育時間分別控制為2 min、4 min、6 min、8 min、10 min、12 min、14min，對其電流值進(jìn)行檢測，篩選出最佳孵育時間為12 min ；
6)農(nóng)藥的檢測:在最優(yōu)條件下:pH 8.0，酶負(fù)載量0.1 U，孵育時間12 min，對不同濃度的甲胺磷和毒死蜱進(jìn)行電流檢測，并分別建立了農(nóng)藥濃度與抑制率之間的線性關(guān)系，得不同濃度的甲胺磷農(nóng)藥的對數(shù)值與農(nóng)藥的抑制率之間的線性回歸方程為y=21.843x-0.2084，相關(guān)系數(shù)為0.9928，不同濃度的甲胺磷農(nóng)藥的對數(shù)值與農(nóng)藥的抑制率之間的線性回歸方程為 y=7.7421x+16.607，相關(guān)系數(shù)為 0.9957。
[0011]所述方法，其特征在于，蔬菜中農(nóng)藥殘留具體檢測步驟如下:
1)蔬菜樣品的前處理:從當(dāng)?shù)爻匈徺I新鮮的白菜、油菜、生菜，去掉葉片上的泥土和灰塵，并清洗干凈，室溫下晾干，然后，分別將蔬菜切成3 X 3 _的小葉片，稱取2.0 g蔬菜樣品于小燒杯中，加入I mL的丙酮和9 mL的0.1 M的磷酸鹽緩沖液(pH = 7.5)。將樣品混合液在超聲波清洗儀中超聲15 min,然后將懸浮液置于離心管中，用離心機(jī)離心(10min, 2000 rpm)，取上清液備用；
2)樣品的檢測:在最優(yōu)條件下:pH8.0，酶負(fù)載量0.1 U，孵育時間12 min，對蔬菜樣品進(jìn)行檢測；
3)根據(jù)建立的相應(yīng)的線性關(guān)系，計算出相應(yīng)樣品的農(nóng)藥殘留量。
[0012]所述方法，其特征在于，用于檢測有機(jī)磷類農(nóng)藥。
[0013]所述方法，其特征在于，所用電極為絲網(wǎng)印刷電極，包括一印制電極的基片、基片上印制的外部絕緣層和三根電極引線，其特征在于所述的基片上還印制有三個電極，一個工作電極:碳電極；一個對電極:碳電極，直徑3mm ;和一個參比電極:Ag/AgCl電極，各電極對應(yīng)連接有一電極引線，該電極電化學(xué)性能穩(wěn)定，均一性好，后面的說明中，該絲網(wǎng)印刷電極簡寫為SPCE。
[0014]所述方法，其特征在于，采用本發(fā)明制備的基于絲網(wǎng)印刷電極檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的傳感器具有操作簡單、成本低廉、檢測靈敏度高等優(yōu)點且反應(yīng)時間短，樣品和試劑消耗量少，穩(wěn)定性高，可用于實際樣品的現(xiàn)場檢測，符合我國農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)發(fā)展和國際化要求。
【附圖說明】
[0015]圖1和圖2為OMC-CS的SEM圖
圖 3 AChE/0MC-CS/Fe304_CS/SPCE 傳感器組裝過程中含 0.1 mol/L KCl