一種基于絲網(wǎng)印刷電極的四環(huán)素適配體傳感器制備及檢測(cè)方法
【專利說明】 —種基于絲網(wǎng)印刷電極的四環(huán)素適配體傳感器制備及檢測(cè)
方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種基于絲網(wǎng)印刷電極的適配體傳感器制備及檢測(cè)方法，屬于農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，隨著我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，奶產(chǎn)量大幅度提高，新鮮牛奶和奶制品已經(jīng)成為人民(尤其是老人和兒童)生活食品中的重要組成部分?？股乇粡V泛用于預(yù)防及治療奶牛疾病，由于頻繁、超劑量使用，使得牛奶等動(dòng)物源食品中存在一定量的抗生素殘留。長(zhǎng)期飲用或食用有抗生素殘留的牛乳或乳制品，也就相當(dāng)于長(zhǎng)期低劑量的攝入抗生素，從而使人體腸道內(nèi)的正常菌群受到抑制，導(dǎo)致致病菌大量繁殖引起全身或局部感染。由于奶牛乳腺炎發(fā)病率較高，用四環(huán)素來治療乳腺炎等產(chǎn)科疾病仍較普遍，這容易導(dǎo)致在牛奶中四環(huán)素的殘留。過量使用四環(huán)素類抗生素不可避免會(huì)使母體代謝產(chǎn)物等相關(guān)抗生素殘留于動(dòng)物的肌肉、蛋、奶、臟器組織中，進(jìn)而通過食物鏈影響人體健康。牛奶中含有抗生素殘留，不僅對(duì)人的健康造成很大的危害，而且對(duì)乳品加工企業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。因此必須嚴(yán)格控制牛奶中抗生素殘留，除了要做好科學(xué)飼養(yǎng)、精心管理、正確擠奶和預(yù)防疾病外，還要規(guī)范抗生素的使用。因此要避免上述情況的發(fā)生，除了從源頭上控制抗生素的使用外，及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)出動(dòng)物源食品中的抗生素殘留是保障畜產(chǎn)品安全的有效途徑。可見，加強(qiáng)對(duì)牛奶等農(nóng)產(chǎn)品中抗生素殘留的檢測(cè)，尤其是保障人類健康有著十分深遠(yuǎn)的意義。
[0003]傳統(tǒng)的抗生素殘留檢測(cè)方法主要有:氣相色譜(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/LC-MS)、毛細(xì)管電泳法(CE)、熒光分析、酶聯(lián)免疫法(ELISA)。這些方法雖然選擇性好、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、檢出限低，可同時(shí)檢測(cè)多種元素或化合物，但其需要昂貴的儀器設(shè)備，樣品前處理過程繁瑣、費(fèi)時(shí)，并且對(duì)分析人員的技術(shù)水平要求很高，不適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。核酸適配體(Aptamer)是人工合成的核酸序列，經(jīng)多次篩選獲得的核酸適配體與靶分子有很高的特異性和親和力。而且適配體是由體外篩選和擴(kuò)增獲得的，不需要免疫動(dòng)物或培養(yǎng)細(xì)胞，具有極好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，很高的純度，可以避免產(chǎn)生批間差異。另外，核酸適配體無免疫原性，可在不同溫度、不同離子濃度、金屬螯合劑存在條件下反復(fù)變性和復(fù)性，在合成過程中，各種報(bào)告分子(熒光素或生物素)和功能集團(tuán)可精確地結(jié)合在適配體位點(diǎn)上。目前用抗體進(jìn)行檢測(cè)和診斷的技術(shù)幾乎可以全部由適配體來代替。抗生素是小分子半抗原物質(zhì)，難以制備相應(yīng)的抗體，即使制備出相應(yīng)的抗體，也存在免疫傳感器的信號(hào)弱、重復(fù)使用性差、重現(xiàn)性不能滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的要求等問題。核酸適配體就可以很好的解決這個(gè)問題。與傳統(tǒng)的分析方法相比，適配體具有如下特點(diǎn):(I)較高的選擇性，因此不需要對(duì)被測(cè)組分進(jìn)行分離，即不用對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。(2)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，體積小，使用方便，特別是便攜式的免疫傳感器，非常有利于農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量的快速測(cè)定。(3)可實(shí)現(xiàn)連續(xù)在線檢測(cè)，使食品加工過程的質(zhì)量控制變得簡(jiǎn)便。(4)響應(yīng)速度快，樣品用量少，與其他大型分析儀器相比，免疫傳感器制作成本低，且可反復(fù)使用。
[0004]本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供了一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作方便、成本低且檢測(cè)靈敏度高的絲網(wǎng)印刷電極適配體傳感器制備方法及檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]其技術(shù)方案為:一種基于絲網(wǎng)印刷電極的適配體傳感器制備及檢測(cè)方法，其特征在于:在由離子液和四氧化三鐵逐層修飾的絲網(wǎng)印刷電極表面，滴涂四環(huán)素適配體，制備四環(huán)素適配體傳感器，將四環(huán)素適配體傳感器用于牛奶中四環(huán)素殘留的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
[0006]為實(shí)現(xiàn)以上功能，本發(fā)明的一種基于絲網(wǎng)印刷電極的適配體傳感器的制備方法為:(1)所述的離子液的制備方法如下:將4mg N-辛基吡啶六氟磷酸鹽(離子液體)分散于4mL無水乙醇中，超聲分散6小時(shí)以得到穩(wěn)定的分散液，所獲得的高度分散懸浮液為lmg/mL離子液體溶液，將制備好的離子液體溶液在4 °0下存儲(chǔ)。(2)所述的四氧化三鐵的制備方法如下:稱取ImL乙酸溶液于小燒杯中，加入10mL超純水配成1.0%乙酸溶液。在50mL乙酸溶液中加入0.1g殼聚糖，配成0.2%殼聚糖溶液。取4mL 0.2%殼聚糖溶液，加入Img四氧化三鐵粉末，超聲分散6h以上得到穩(wěn)定的分散液。(3)適配體在絲網(wǎng)印刷電極表面的固定:在絲網(wǎng)印刷電極表面滴涂6 μ L 0.5mg/mL離子液體，待表面自然晾干后，接著滴涂6 μ L0.25mg/mL四氧化三鐵溶液，自然晾干，最后在絲網(wǎng)印刷電極上滴加15 μ L的5mM的適配體，在室溫條件下使其自然晾干，保存在4° C條件下備用。
[0007]所述的一種基于絲網(wǎng)印刷電極的適配體傳感器制備及檢測(cè)方法，其特征在于:絲網(wǎng)印刷電極的清洗與活化，基于絲網(wǎng)印刷電極的適配體傳感器的制備及過程表征(制備離子液和四氧化三鐵納米材料，利用離子液和四氧化三鐵的協(xié)同作用共同修飾電極)，適配體傳感器工作曲線的建立，適配體傳感器性能的檢測(cè)，適配體傳感器對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)。
[0008]所述的一種基于絲網(wǎng)印刷電極的適配體傳感器制備及檢測(cè)方法，其特征在于:實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，主要包括適配體濃度、測(cè)試底液的PH以及測(cè)試時(shí)間和溫度；所制備的適配體傳感器的工作曲線為:ΔΙ (μA)= 0.8881 LogC (M)+10.710 (R2= 0.9687);適配體傳感器性能檢測(cè)包括重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、再生性、特異性以及適配體傳感器對(duì)牛奶樣品回收率的測(cè)定。其制備原理為:適配體生物傳感器以適配體作為識(shí)別元件，通過固定化技術(shù)將適配體結(jié)合到感受器表面，適配體與目標(biāo)物結(jié)合后，形成的復(fù)合物與產(chǎn)生的物理或化學(xué)信號(hào)相關(guān)聯(lián)，由換能器將其轉(zhuǎn)化為與待測(cè)物質(zhì)濃度(或活度)有關(guān)的可定量或者可處理的物理化學(xué)信號(hào)，再通過二次儀表放大并且輸出信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)。本發(fā)明采用離子液-四氧化三鐵復(fù)合物修飾電極，離子液體電導(dǎo)率高，電化學(xué)窗口大，離子液體可替代傳統(tǒng)有機(jī)溶劑或酸堿成功用作化工反應(yīng)和分離的新介質(zhì)，由于離子液體具有導(dǎo)電性、難揮發(fā)、不燃燒、電化學(xué)穩(wěn)定電位窗口比其它電解質(zhì)水溶液大很多等特點(diǎn)；Fe304磁性納米顆?？稍陔姌O表面形成一層薄膜，增大電極面積，同時(shí)可將氧化還原活性物質(zhì)運(yùn)輸?shù)诫姌O表面。因此使用Fe3O4磁性納米粒子修飾電極后，大大提高與生物分子的結(jié)合能力，進(jìn)而將生物分子很好的固定到電極表面，提高傳感器檢測(cè)的靈敏度；因此采用離子液-四氧化三鐵復(fù)合物不僅可促進(jìn)電極與測(cè)試底液直接的電子傳遞，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大，而且離子液和四氧化三鐵有很好的生物相容性，為適配體在電極表面的固定提供了一個(gè)良好的生物界面，保持了適配體的生物活性以用來和目標(biāo)物進(jìn)行有效的結(jié)合。采用本發(fā)明一種基于絲網(wǎng)印刷電極的適配體傳感器制備及檢測(cè)方法，可用于牛奶中抗生素殘留現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，可以在牛奶上市前，進(jìn)行四環(huán)素殘留的快速測(cè)定，直接對(duì)四環(huán)素殘留量是否超標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，避免因食用含有四環(huán)素的牛奶而引起四環(huán)素在人體內(nèi)的蓄積造成嚴(yán)重的后果，為畜牧產(chǎn)品安全生產(chǎn)與消費(fèi)提供殘留檢測(cè)的技術(shù)支撐。
[0009]本發(fā)明所用絲網(wǎng)印刷碳電極制作簡(jiǎn)單，具有能夠?qū)崿F(xiàn)批量生產(chǎn)、電極集成、樣品用量小、成本低且一次使用可拋棄的優(yōu)點(diǎn)，避免了共用同一電極檢測(cè)多個(gè)樣本時(shí)的交叉干擾問題，為生物傳感器走向廉價(jià)、大規(guī)模應(yīng)用提供了一種具有前景的途徑，很好地解決了當(dāng)前電極預(yù)處理的繁瑣程序，且同批次電極具有很好的同一性，可以批量生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)商品化。
[0010]所述絲網(wǎng)印刷碳電極，包括印制電極的基片，印制于基片上的外部絕緣層和至少兩根電極引線，基片印制有三個(gè)電極，分別為一個(gè)工作電極、一個(gè)對(duì)電極及一個(gè)參比電極，各電極對(duì)應(yīng)連接有一電極引線。
[0011]所述清洗、活化絲網(wǎng)印刷碳電極，過程是:首先，將絲網(wǎng)印刷碳電極置于NaOH溶液中超聲，超純水沖洗，N2吹干，其次，將電極置于HCl溶液中超聲，超純水沖洗，N2吹干，再次，用無水乙醇沖洗電極，N2吹干，最后，在磷酸鹽緩沖液中掃描電流-時(shí)間曲線，之后掃描循環(huán)伏安曲線直至性能穩(wěn)定。
[0012]所述的一種基于絲網(wǎng)印刷電極的適配體傳感器制備及檢測(cè)方法，其特征在于:對(duì)裸絲網(wǎng)印刷電極、離子液-四氧化三鐵修飾的絲網(wǎng)印刷電極，以及復(fù)合物修飾電極后固定適配體、適配體傳感器結(jié)合四環(huán)素后的逐步修飾過程進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)表征。循環(huán)伏安測(cè)試是在-0.2-0.6V，掃速為0.05V/S的條件下進(jìn)行，其測(cè)試底液為含5mmol/L[Fe (CN)6J3^P 0.lmol/L KCl的混合液的0.lmol