熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，特別涉及一種用于表征超分辨熒光顯微系統(tǒng)分辨率的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]長期以來，光學(xué)顯微成像技術(shù)在人類探索微觀世界的過程中一直發(fā)揮著重要作用。然而，受阿貝衍射極限的約束，傳統(tǒng)光學(xué)顯微技術(shù)無法將生命科學(xué)研究帶到納米尺度。隨著熒光顯微成像學(xué)的不斷發(fā)展和完善，使得突破衍射極限成為可能。近年來，涌現(xiàn)出了許多超分辨焚光顯微技術(shù)，如單分子定位顯微術(shù)(Single Molecule Localizat1nMicroscopy，SMLM)、結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)(Structured Illuminat1n Microscopy, SIM)以及受激發(fā)射損耗顯微術(shù)(Stimulated Emiss1n Deplet1n, STED)等。這些焚光顯微成像技術(shù)將科學(xué)研究帶入“納米”領(lǐng)域，讓人類能夠“實(shí)時(shí)”觀察活細(xì)胞內(nèi)的分子運(yùn)動(dòng)規(guī)律，為疾病研究和藥物研發(fā)帶來革命性變化。與其他技術(shù)相比，STED基于共聚焦顯微技術(shù)，通過把被激發(fā)的熒光物質(zhì)限制在小于衍射極限的范圍內(nèi)來實(shí)現(xiàn)超高分辨率，成像速度快，可以觀察活細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)變化的過程。
[0003]分辨率是評價(jià)光學(xué)顯微系統(tǒng)最重要的標(biāo)準(zhǔn)，不同于普通光學(xué)顯微系統(tǒng)，超分辨熒光顯微系統(tǒng)的分辨率并不能直接給出，而是需要借助測試標(biāo)準(zhǔn)板進(jìn)行復(fù)雜的圖像處理，與光學(xué)系統(tǒng)參數(shù)(如光源波長、強(qiáng)度等)、數(shù)據(jù)處理技術(shù)及熒光染料種類等因素密切相關(guān)，而這些都大大提高了對測試標(biāo)準(zhǔn)板的要求。因此，準(zhǔn)確表征超分辨熒光顯微系統(tǒng)的分辨率顯得非常重要。但在現(xiàn)有技術(shù)中，標(biāo)準(zhǔn)板的結(jié)構(gòu)及尺寸難以得到可重復(fù)性的精確加工，熒光線條的排列不夠整齊，制造工藝復(fù)雜，無法實(shí)現(xiàn)批量化生產(chǎn)，而這種加工的難度主要是源自對標(biāo)準(zhǔn)板的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)還不夠科學(xué)合理，一些工藝環(huán)節(jié)的排布上也未能做到盡善盡美。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，其通過對板材結(jié)構(gòu)的重新設(shè)計(jì)和對工藝細(xì)節(jié)的重新設(shè)計(jì)，可用于超分辨熒光顯微系統(tǒng)分辨率的測定，制備工藝簡單，可重復(fù)使用，產(chǎn)品穩(wěn)定性高，易于批量生產(chǎn)。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0006]—種熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，包括:
[0007]步驟I)采用電子束蒸發(fā)法或磁控濺射法在基底層表面形成一層金屬層；
[0008]步驟2)在所述金屬層表面旋涂光刻膠層；利用電子束光刻法對光刻膠層等間距曝光，顯影后形成等間距的光刻膠線條；
[0009]步驟3)將所述光刻膠線條浸泡于硅烷化試劑中進(jìn)行表面硅烷化處理，在光刻膠線條表面形成硅烷層；
[0010]步驟4)將所述硅烷層浸泡于熒光染料溶液中反應(yīng)30min以在所述硅烷層的表面修飾熒光染料層；用乙醇沖洗后，氮?dú)獯蹈桑?br>[0011]步驟5)在所述熒光染料層表面旋涂用于保護(hù)熒光染料的透明保護(hù)層。
[0012]優(yōu)選的是，所述的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，其中，所述基底層為硅或氮化硅。
[0013]優(yōu)選的是，所述的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，其中，所述基底層為硅。
[0014]優(yōu)選的是，所述的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，其中，所述金屬層選自鉻、鈦、鋁、金或其組合。
[0015]優(yōu)選的是，所述的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，其中，所述金屬層為鉻。
[0016]優(yōu)選的是，所述的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，其中，所述硅烷化試劑為3-氨丙基三乙甲氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷。
[0017]優(yōu)選的是，所述的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，其中，所述金屬層的厚度為5?50nmo
[0018]優(yōu)選的是，所述的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，其中，所述光刻膠層的厚度為50 ?130nm。
[0019]優(yōu)選的是，所述的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，其中，所述透明保護(hù)層的厚度為30 ?10nm0
[0020]優(yōu)選的是，所述的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，其中，所述熒光染料為異硫氰酸熒光素或熒光蛋白ATTO 488。
[0021]本發(fā)明的有益效果是:本案提及的標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法步驟少，工藝簡單，反應(yīng)條件溫和無污染，工藝重現(xiàn)性好，通過對標(biāo)準(zhǔn)板結(jié)構(gòu)的改進(jìn)，使得其可用于超分辨熒光顯微系統(tǒng)分辨率的精確測定；通過精確調(diào)整熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的結(jié)構(gòu)尺寸，實(shí)現(xiàn)熒光線條結(jié)構(gòu)的整齊排列，直觀地反應(yīng)出系統(tǒng)的分辨能力；同時(shí)，這種結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)板能夠?qū)崿F(xiàn)批量制作，操作簡易方便，可重復(fù)使用，穩(wěn)定性高，分辨率高。
【附圖說明】
[0022]圖1為采用本發(fā)明所述的制備方法制得的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0024]參照圖1，本案提出一實(shí)施例的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，包括:
[0025]步驟I)采用電子束蒸發(fā)法或磁控濺射法在基底層I表面形成一層金屬層2 ;
[0026]步驟2)在金屬層2表面旋涂光刻膠層3 ;利用電子束光刻法對光刻膠層3等間距曝光，顯影后形成等間距的光刻膠線條；
[0027]步驟3)將光刻膠線條浸泡于硅烷化試劑中進(jìn)行表面硅烷化處理，形成硅烷層4 ;顯影后的光刻膠線條為類石英(S12)結(jié)構(gòu)，其表面具有豐富的羥基基團(tuán)，可直接利用硅烷化試劑對線條結(jié)構(gòu)表面進(jìn)行硅烷化，使表面具有功能化基團(tuán)。金屬層表面沒有利于硅烷化的羥基基團(tuán)，所以可實(shí)現(xiàn)選擇性修飾。
[0028]步驟4)將硅烷層4浸泡于熒光染料溶液中反應(yīng)30min以在硅烷層4的表面修飾熒光染料層5 ;用乙醇沖洗后，氮?dú)獯蹈桑?br>[0029]步驟5)在熒光染料層5表面旋涂用于保護(hù)熒光染料的透明保護(hù)層6。透明保護(hù)層6為透明的高分子樹脂材料，它的作用是保護(hù)熒光染料，它自身不會(huì)產(chǎn)生熒光。
[0030]在上述實(shí)施例中，基底層I優(yōu)選為娃或氣化娃，最優(yōu)選為娃。
[0031]在上述實(shí)施例中，金屬層2優(yōu)選選自鉻、鈦、鋁、金或其組合，最優(yōu)選為鉻。
[0032]在上述實(shí)施例中，硅烷化試劑優(yōu)選為3-氨丙基三乙甲氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基娃燒。
[0033]在上述實(shí)施例中，金屬層2的厚度優(yōu)選為5?50nm。研究發(fā)現(xiàn)，金屬層2的厚度對標(biāo)準(zhǔn)板所測分辨率的精度有一定的影響，若超出優(yōu)選的范圍將導(dǎo)致分辨率精度偏離最優(yōu)值。
[0034]在上述實(shí)施例中，光刻膠層3的厚度優(yōu)選為50?130nm。研究發(fā)現(xiàn)，光刻膠層3的厚度對標(biāo)準(zhǔn)板所測分辨率的精度有一定的影響，若超出優(yōu)選的范圍將導(dǎo)致分辨率精度偏離最優(yōu)值。
[0035]在上述實(shí)施例中，透明保護(hù)層6的厚度優(yōu)選為30?lOOnm。研究發(fā)現(xiàn)，透明保護(hù)層6的厚度對標(biāo)準(zhǔn)板所測分辨率的精度有一定的影響，若超出優(yōu)選的范圍將導(dǎo)致分辨率精度偏離最優(yōu)值。
[0036]在上述實(shí)施例中，熒光染料優(yōu)選為異硫氰酸熒光素或熒光蛋白ATTO 488，最優(yōu)選為異硫氰酸熒光素。異硫氰酸熒光素與此結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)板匹配度最好，兩者配合協(xié)調(diào)，可使標(biāo)準(zhǔn)板獲得最佳的分辨率測試精度。
[0037]盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，包括: 步驟I)采用電子束蒸發(fā)法或磁控濺射法在基底層表面形成一層金屬層； 步驟2)在所述金屬層表面旋涂光刻膠層；利用電子束光刻法對光刻膠層等間距曝光，顯影后形成等間距的光刻膠線條； 步驟3)將所述光刻膠線條浸泡于硅烷化試劑中進(jìn)行表面硅烷化處理，在光刻膠線條表面形成硅烷層； 步驟4)將所述硅烷層浸泡于熒光染料溶液中反應(yīng)30min以在所述硅烷層的表面修飾熒光染料層；用乙醇沖洗后，氮?dú)獯蹈桑? 步驟5)在所述熒光染料層表面旋涂用于保護(hù)熒光染料的透明保護(hù)層。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，其特征在于，所述基底層為硅或氮化硅。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，其特征在于，所述基底層為硅。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，其特征在于，所述金屬層選自絡(luò)、鈦、招、金或其組合。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，其特征在于，所述金屬層為鉻。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，其特征在于，所述硅烷化試劑為3-氨丙基三乙甲氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，其特征在于，所述金屬層的厚度為5?50nm。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，其特征在于，所述光刻膠層的厚度為50?130nm。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，其特征在于，所述透明保護(hù)層的厚度為30?10nm010.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，其特征在于，所述熒光染料為異硫氰酸熒光素或熒光蛋白ATTO 488。
【專利摘要】本案涉及熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的制備方法，包括：1)采用電子束蒸發(fā)法或磁控濺射法在基底層表面形成金屬層；2)在金屬層表面旋涂光刻膠層；利用電子束光刻法對光刻膠層等間距曝光，顯影后形成等間距的光刻膠線條；3)將光刻膠線條浸泡于硅烷化試劑中進(jìn)行表面硅烷化處理，形成硅烷層；4)將硅烷層浸泡于熒光染料溶液中反應(yīng)30min以在硅烷層的表面修飾熒光染料層；5)在熒光染料層表面旋涂透明保護(hù)層。本制備方法步驟少，工藝簡單，反應(yīng)條件溫和無污染，工藝重現(xiàn)性好；通過精確調(diào)整熒光納米標(biāo)準(zhǔn)板的結(jié)構(gòu)尺寸，實(shí)現(xiàn)熒光線條結(jié)構(gòu)的整齊排列，直觀地反應(yīng)出系統(tǒng)的分辨能力；同時(shí)，這種結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)板能夠?qū)崿F(xiàn)批量制作，穩(wěn)定性高，分辨率高。
【IPC分類】G01N21/64
【公開號】CN105203508
【申請?zhí)枴緾N201510551458
【發(fā)明人】蔣克明, 黎海文, 周武平, 張濤, 劉聰
【申請人】中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年9月1日