生物體分子染色用的熒光納米粒子及其制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種生物體分子染色用的巧光納米粒子及其制造方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在病理診斷中，實(shí)施被稱(chēng)為免疫染色的用于確認(rèn)標(biāo)本的分子信息表達(dá)的分子祀染 色來(lái)進(jìn)行診斷基因或蛋白的表達(dá)異常運(yùn)樣的功能異常的免疫觀察。免疫染色使用例如使用 了酶的色素染色法值A(chǔ)B染色等）。然而，DAB染色運(yùn)樣的利用酶標(biāo)記進(jìn)行的染色存在如下 技術(shù)問(wèn)題：染色濃度主要受溫度、時(shí)間等環(huán)境條件影響，因此，難W由染色濃度估計(jì)實(shí)際的 抗體等的量。因此，在病理診斷的免疫觀察中，進(jìn)行使用巧光標(biāo)記體的巧光標(biāo)記法代替利用 酶標(biāo)記的染色。該方法與DAB染色相比，具有定量性?xún)?yōu)異的特征。巧光標(biāo)記法使用經(jīng)過(guò)巧 光色素修飾的抗體對(duì)作為對(duì)象的抗原進(jìn)行染色來(lái)進(jìn)行觀察，由此，測(cè)量抗原量。
[0003] 作為用于巧光標(biāo)記的染色液已知：含有使作為生物體分子識(shí)別分子的鏈霉親和素 與=聚氯胺樹(shù)脂粒子直接結(jié)合的巧光納米粒子的染色液（例如參照專(zhuān)利文獻(xiàn)1、2)。該巧光 納米粒子被用于生物體分子的檢測(cè)。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 陽(yáng)00引專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0006] 專(zhuān)利文獻(xiàn)1 :日本特表2008-543982號(hào)公報(bào)
[0007] 專(zhuān)利文獻(xiàn)2 :國(guó)際公開(kāi)W02013/035703

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題
[0009] 但是，在使用專(zhuān)利文獻(xiàn)1、2的巧光納米粒子進(jìn)行免疫染色的情況下，存在不論組 織上的抗原量，巧光納米粒子均非特異性地結(jié)合于細(xì)胞核等運(yùn)樣的問(wèn)題。特別是若為了 進(jìn)行高靈敏度的免疫染色而W高濃度使用巧光納米粒子，則容易產(chǎn)生運(yùn)樣的非特異性的結(jié) 厶 1=1 O
[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種可抑制與染色對(duì)象外的生物體分子發(fā)生非特異性結(jié) 合的生物體分子染色用的巧光納米粒子及其制造方法。 陽(yáng)011]用于解決技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案
[0012] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的中的至少一個(gè)，反映本發(fā)明的一方面的巧光納米粒子為用于對(duì) 生物體分子進(jìn)行染色的巧光納米粒子，其具備具有巧光色素的色素樹(shù)脂粒子和待與染色對(duì) 象的生物體分子發(fā)生特異性結(jié)合的生物體分子識(shí)別分子，所述巧光納米粒子在pH7. 0的水 中的Zeta電位為-IOmV~-60mV。
[0013] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的中的至少一個(gè)，反映了本發(fā)明的一方面的另一巧光納米粒子為 用于對(duì)生物體分子進(jìn)行巧光染色的巧光納米粒子，其具備具有巧光色素的色素樹(shù)脂粒子、 和待與染色對(duì)象的生物體分子發(fā)生特異性結(jié)合的生物體分子識(shí)別分子，所述巧光納米粒子 在抑6. 0~8. 0的緩沖液中的Zeta電位為OmV~-IOmV的范圍。
[0014] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的中的至少一個(gè)，反映了本發(fā)明的一方面的上述巧光納米粒子的 制造方法具有如下工序：通過(guò)對(duì)內(nèi)包有或表面固定有巧光色素的色素樹(shù)脂粒子的表面進(jìn)行 化學(xué)修飾，對(duì)所述色素樹(shù)脂粒子賦予在抑7. 0的水中W巧光納米粒子計(jì)為-IOmV~-60mV 的Zeta電位。
[0015] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的中的至少一個(gè)，反映了本發(fā)明的一方面的上述巧光納米粒子的 制造方法具有如下工序：通過(guò)對(duì)內(nèi)包有或表面固定有巧光色素的色素樹(shù)脂粒子的表面進(jìn)行 化學(xué)修飾，對(duì)所述色素樹(shù)脂粒子賦予在P冊(cè).0~8. 0的緩沖液中W巧光納米粒子整體計(jì)為 OmV ~-IOmV 的Zeta電位。
[0016] 發(fā)明的效果
[0017] 根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)將巧光納米粒子的Zeta電位調(diào)節(jié)至特定范圍的負(fù)值，與通常帶 負(fù)電的生物體分子之間可產(chǎn)生適度的電排斥力。其結(jié)果，可抑制巧光納米粒子與生物體分 子的非特異性結(jié)合，可通過(guò)超過(guò)所述電排斥力的相互作用使巧光納米粒子和染色對(duì)象的生 物體分子特異性結(jié)合，可提高特定的染色對(duì)象的生物體分子的可視性。另外，巧光納米粒子 彼此之間也產(chǎn)生適度的電排斥力，因此，可抑制它們的凝聚，也可維持染色液的分散性。
【附圖說(shuō)明】
[001引圖I(A)是使用了比較例1的巧光納米粒子的非特異性結(jié)合的評(píng)價(jià)試驗(yàn)的圖像。確 認(rèn)到大量亮點(diǎn)，表示大量產(chǎn)生巧光納米粒子向細(xì)胞核的非特異性結(jié)合。度）為表示使用了實(shí) 施例1的巧光納米粒子的非特異性結(jié)合的評(píng)價(jià)試驗(yàn)的結(jié)果的圖像。未確認(rèn)到亮點(diǎn)，表示巧 光納米粒子向細(xì)胞核及組織整體的非特異性結(jié)合得到抑制。（C)為使用了實(shí)施例7的巧光 納米粒子的免疫染色圖像?？蒞確認(rèn)在抑制向細(xì)胞核的非特異性結(jié)合的同時(shí)巧光納米粒子 適當(dāng)?shù)亟Y(jié)合于目標(biāo)生物體分子（肥R2)。值）為使用了實(shí)施例6的巧光納米粒子的免疫染色 圖像。與（C)同樣，可W確認(rèn)在抑制向細(xì)胞核的非特異性結(jié)合的同時(shí)巧光納米粒子適當(dāng)?shù)?結(jié)合于目標(biāo)生物體分子（HER2)，但其亮點(diǎn)數(shù)稍少于（C)。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明的巧光納米粒子為用于對(duì)生物體分子進(jìn)行巧光染色的巧光納米粒子，其具 備具有巧光色素的色素樹(shù)脂粒子、和會(huì)與染色對(duì)象的生物體分子發(fā)生特異性結(jié)合的生物體 分子識(shí)別分子，所述巧光納米粒子在抑7. 0的水中的Zeta電位為-IOmV~-60mV。
[0020] 另外，本發(fā)明的另一巧光納米粒子為用于對(duì)生物體分子進(jìn)行巧光染色的巧光納米 粒子，其具備具有巧光色素的色素樹(shù)脂粒子和與染色對(duì)象的生物體分子特異性結(jié)合的生物 體分子識(shí)別分子，P冊(cè).0~8. 0的緩沖液中的Zeta電位為OmV~-IOmV的范圍。
[0021] (巧光納米粒子）
[0022] 本發(fā)明中所使用的巧光納米粒子如上所述包含具有染色用的巧光色素且表面經(jīng) 過(guò)化學(xué)修飾的色素樹(shù)脂粒子和對(duì)作為染色對(duì)象的生物體分子進(jìn)行分子識(shí)別并進(jìn)行特異性 結(jié)合的生物體分子識(shí)別分子，且在染色環(huán)境抑下具有特定的范圍的負(fù)的Zeta電位。
[0023] "生物體分子"包含細(xì)胞核、核糖體、高爾基體等細(xì)胞器和存在于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表 面的其它的各種蛋白質(zhì)等。運(yùn)些通常通過(guò)核酸（核巧酸）所具有的憐酸基或氨基酸的側(cè)鏈 中含有的帶電的官能團(tuán)而在中性抑區(qū)域帶負(fù)電。因此，具有負(fù)的Zeta電位的巧光納米粒 子和帶負(fù)電的生物體分子互相電排斥，不易產(chǎn)生非特異性結(jié)合。
[0024]另一方面，巧光納米粒子通過(guò)具備會(huì)與作為染色對(duì)象的生物體分子發(fā)生特異性結(jié) 合的生物體分子識(shí)別分子，其能夠W超過(guò)上述的電排斥力的較強(qiáng)的相互作用，與作為染色 對(duì)象的生物體分子結(jié)合。
[00巧]因此，通過(guò)將抑7.0的水中的巧光納米粒子的Zeta電位調(diào)節(jié)為特定的負(fù)的范圍 (-IOmV~-60mV)，能夠防止巧光納米粒子與生物體分子發(fā)生非特異性結(jié)合，并且與作為染 色對(duì)象的生物體分子發(fā)生特異性地結(jié)合，可提高巧光染色的可視性。另外，通過(guò)將P冊(cè).0~ P冊(cè).0的緩沖液中的Zeta電位調(diào)節(jié)為特定的負(fù)的范圍（OmV~-IOmV)，也可W提高巧光染 色的可視性。
[0026] 如上所述由于采用"在染色環(huán)境抑下具有特定的范圍的負(fù)的Zeta電位的"巧光 納米粒子，因此，本發(fā)明中所使用的巧光納米粒子的Zeta電位設(shè)定為在中性、即抑7.0的水 中的環(huán)境下為-IOmV~-60mV的范圍，或設(shè)定為在抑6. 0~8. 0的PBS等抑緩沖液中的環(huán) 境下為OmV~-lOmV。作為緩沖液，例如可W舉出：選自憐酸緩沖生理鹽水（PBS)、Tris-肥1 緩沖液、及憐酸緩沖液（除PBSW外）中的1種W上。
[0027] 具有如上所述范圍的Zeta電位的巧光納米粒子對(duì)于進(jìn)行生物體分子的染色的pH 環(huán)境下，例如抑為6.0~8.0、優(yōu)選抑為6. 9~7.6的范圍下的使用而言是優(yōu)選的。
[0028] 若抑7. 0的水中的巧光納米粒子的Zeta電位大于-IOmV則與染色對(duì)象外的生物 體分子（例如細(xì)胞核）之間發(fā)生作用的排斥力弱，無(wú)法充分地防止非特異性結(jié)合，因此，改 善可視性的效果不足。另外，由于在巧光納米粒子彼此之間起作用的電排斥力也變?nèi)?，?此，試劑的分散性也變差。若抑7. 0的水中的巧光納米粒子的Zeta電位小于-60mV，則由于 與帶正電的生物體分子發(fā)生非特異性結(jié)合等而導(dǎo)致向組織整體的吸附（亮點(diǎn)數(shù)）過(guò)度，改 善可視性的效果也不足。 W29] 另一方面，若P冊(cè).0~P冊(cè).0的緩沖液中的巧光納米粒子的Zeta電位為OmV~-IOmV的范圍外，則即使進(jìn)行染色也無(wú)法得到足夠的亮點(diǎn)。需要說(shuō)明的是，巧光納米 粒子的Zeta電位可使用一般的Zeta電位測(cè)定裝置（例如"ZetasizerNano"、Malvern公 司制造）測(cè)定。
[0030] 通常，存在多種有可能引起非特異性結(jié)合的染色對(duì)象外的生物體分子，但帶負(fù)電 的程度根據(jù)生物體分子的種類(lèi)或抑環(huán)境的不同而不同，根據(jù)染色對(duì)象（組織切片等），適當(dāng) 調(diào)節(jié)巧光納米粒子的Zeta電位，使防止非特異性結(jié)合、提高可視性的效果變得極高。例如， 在染色對(duì)象外的生物體分子中非特異性結(jié)合特別成為問(wèn)題的細(xì)胞核的關(guān)系中，最優(yōu)選調(diào)節(jié) 巧光納米粒子的Zeta電位，使得能夠抑制非特異性結(jié)合。 陽(yáng)03UpH7. 0的水中的巧光納米粒子的Zeta電位、或抑6. 0~抑8. 0的緩沖液中的巧 光納米粒子的Zeta電位如后述的巧光納米粒子的制造方法的添加工序中所示，優(yōu)選通過(guò) 在色素樹(shù)脂粒子的表面添加可調(diào)節(jié)該表面的Zeta電位的化合物的化學(xué)修飾來(lái)將該表面的 Zeta電位設(shè)定為上述的范圍。此時(shí)，pH7. 0的水中的巧光納米粒子的Zeta電位、或P冊(cè).0~ P冊(cè).0的緩沖液中的巧光納米粒子的Zeta電位除色素樹(shù)脂粒子及生物體分子識(shí)別分子W 夕F，還基于為了上述化學(xué)修飾而使用的試劑、例如氨基導(dǎo)入試劑及PEG化試劑的電荷或分 子尺寸等而總體地調(diào)整。
[0032] 但是，本發(fā)明并不限定于運(yùn)樣的實(shí)施方式，若可僅通過(guò)色素樹(shù)脂粒子及生物體分 子識(shí)別分子就能夠?qū)⒁?. O的水中的巧光納米粒子的Zeta電位、或抑6. O~抑8. O的緩沖 液中的巧光納米粒子的Zeta電位設(shè)定為上述范圍，則無(wú)需使用運(yùn)樣的化學(xué)修飾。
[0033] 另一方面，P冊(cè).0~P冊(cè).0的緩沖液中的巧光納米粒子的Zeta電位可通過(guò)相對(duì)于 緩沖液含有指定量蛋白質(zhì)度SA等）、表面活性劑（吐溫20(注冊(cè)商標(biāo)）等）、防腐劑（疊氮 化鋼等）等可調(diào)節(jié)Zeta電位的其它化合物中的1種或2種W上來(lái)進(jìn)行總體的調(diào)節(jié)，使其落 入OmV~-IOmV的范圍。但是，若上述Zeta電位落入OmV~-IOmV的范圍，則無(wú)需使用運(yùn) 樣的化合物。
[0034] <色素樹(shù)脂粒子〉
[0035] 作為構(gòu)成本發(fā)明的巧光納米粒子的要素之一的色素樹(shù)脂粒子是粒子中內(nèi)包有巧 光色素或粒子表面上固定有巧光色素并且直徑為納米級(jí)的樹(shù)脂粒子。
[0036] 作為W色素樹(shù)脂粒子為主而構(gòu)成的樹(shù)脂，可W使用如下所述的熱塑性樹(shù)脂或熱固 性樹(shù)脂。作為熱塑性樹(shù)脂，例如可優(yōu)選使用聚苯乙締、聚丙締臘、聚巧喃、或與其相似的樹(shù) 月旨。作為熱固性樹(shù)脂，例如可W舉出：聚二甲苯、聚乳酸、甲基丙締酸縮水甘油醋、聚=聚氯 胺、聚脈、聚苯并脈胺、聚酷胺、酪醒樹(shù)脂、多糖類(lèi)或與其相似的樹(shù)脂。從通過(guò)使用二甲苯等 有機(jī)溶劑的脫水、澄清、封入等處理，可抑制色素樹(shù)脂中內(nèi)包的色素的溶出方面出發(fā)，熱固 性樹(shù)脂特別優(yōu)選=聚氯胺樹(shù)脂。
[0037] 色素樹(shù)脂粒子需要具備用于使其表面至少直接或間接地與生物體分子識(shí)別分子 結(jié)合的官能團(tuán)；或者具備用于使色素樹(shù)脂粒子與為了進(jìn)一步調(diào)節(jié)PH7.0的水中巧光納米粒 子的Zeta電位或P冊(cè).0~8.0的緩沖液中的Zeta電位的通常的化合物（化學(xué)修飾劑）結(jié) 合的官能團(tuán)。
[0038] 作為運(yùn)樣的指定的官能團(tuán)，可利用與本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域中使各種生物體分子 彼此結(jié)合的情況同樣的官能團(tuán)，但優(yōu)選例如環(huán)氧基及氨基。
[0039] 用于使生物體分子識(shí)別分子結(jié)合的官能團(tuán)和用于調(diào)節(jié)Zeta電位的化合物（化學(xué) 修飾劑）結(jié)合的官能團(tuán)可W為相同的種類(lèi)，也可W為不同的種類(lèi)。
[0040] 具有上述指定的官能團(tuán)的色素樹(shù)脂粒子的制備方法沒(méi)有特別限定，但可W使用如 下方法：例如，可W使用預(yù)先在側(cè)鏈具有上述指定的官能團(tuán)的（共）單體作為用于合成構(gòu)成 色素樹(shù)脂粒子的熱塑性樹(shù)脂或熱固性樹(shù)脂的單體，并進(jìn)行（共）聚合；或者，在合成熱塑性 樹(shù)脂或熱固性樹(shù)脂后，對(duì)構(gòu)成其的樹(shù)脂單體單元所具有的官能團(tuán)進(jìn)行試劑處理而轉(zhuǎn)換成上 述指定的官能團(tuán)的方法。
[0041] 在制造熱塑性的色素樹(shù)脂粒子的情況下，可W舉出下列實(shí)施方式：使用甲基丙締 酸縮水甘油醋作為單體并與苯乙締一起進(jìn)行共聚來(lái)制造在表面上具有環(huán)氧基的聚苯乙締 類(lèi)樹(shù)脂的色素樹(shù)脂粒子；或者，使苯乙締簇酸或苯乙締橫酸與苯乙締一起進(jìn)行共聚來(lái)制造 在表面具有簇酸、橫酸的聚苯乙締類(lèi)樹(shù)脂的色素樹(shù)脂粒子的實(shí)施方式；或者，使氨基橫酸與 苯乙締一起進(jìn)行共聚來(lái)制造在表面具有氨基的聚苯乙締類(lèi)樹(shù)脂的色素樹(shù)脂粒子。另外，上 述甲基丙締酸縮水甘油醋具有的環(huán)氧基可通過(guò)指定的處理轉(zhuǎn)換為氨基。
[0042] 另一方面，在制造熱固性的色素樹(shù)脂粒子的情況下，可W列舉通過(guò)使用=聚氯胺 樹(shù)脂原料（例如S和chemical株式會(huì)社制造的MX035)作為單體并進(jìn)行共聚來(lái)制造在表面 具有氨基的=聚氯胺類(lèi)樹(shù)脂的色素樹(shù)脂粒子的實(shí)施方式。
[0043] (巧光色素）
[0044] 在一邊對(duì)上述樹(shù)脂單體進(jìn)行聚合而攝入巧光色素一邊形成色素樹(shù)脂粒子時(shí)，作 為粒子中內(nèi)包的或固定于粒子的表面的巧光色素，例如可使用W下的羅丹明類(lèi)色素分子、 BODIPY(氣化棚絡(luò)合二化咯甲川，Boron-dipyrromethene)類(lèi)色素分子、方酸類(lèi)色素分子、 芳香族控類(lèi)色素分子、或它們的組合。
[0045]羅丹明類(lèi)色素分子等巧光色素的耐光性較高，故優(yōu)選，其中，優(yōu)選屬于芳香族控類(lèi) 色素分子的巧（pe巧Iene)或巧（Pyrene)、巧二酷亞胺（pe巧Ienediimide)。
[0046] 作為羅丹明類(lèi)色素分子的具體例，可W舉出：5-簇基-羅丹明、6-簇基-羅丹明、 5,6-二簇基-羅丹明、羅丹明6G、四甲基羅丹明、X-羅丹明、德克薩斯紅、Spectrum Ret LD700PERCHL0RATE、它們的衍生物等。
[0047] 作為BODIPY類(lèi)色素分子的具體例，可W舉出：BODIPYFLBODIPYTMR、BODIPY 493/503、B孤IPY530/550、B孤IPY558/568、B孤IPY564/570、B孤IPY576/589、B孤IPY 581/59UB0DIPY630/650、B0DIPY650/665(W上為Invitrogen公司制造）、它們的衍生物 等。