用于檢測(cè)細(xì)胞樣品中的活細(xì)胞的方法
【專利說明】用于檢測(cè)細(xì)胞樣品中的活細(xì)胞的方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年5月2日提交的共同未決的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/641，809 和2013年3月14日提交的共同未決的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/784, 789的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益， 將各申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過引用結(jié)合在此。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明大體上涉及一種用于確定液體樣品中的活細(xì)胞的存在和/或量的系統(tǒng)和 方法。
[0004] 背景
[0005] 例如由革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、以及真菌（例如酵母菌和霉菌）造成的微生 物污染可以導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，并且在一些情況下甚至導(dǎo)致人類和動(dòng)物受試者中的死亡。在 某些產(chǎn)業(yè)例如食品、水、化妝品、制藥、以及醫(yī)療器械產(chǎn)業(yè)中的生產(chǎn)商必須符合嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn) 驗(yàn)證他們的產(chǎn)品不包含一定水平的微生物污染物，否則會(huì)損害消費(fèi)者或接受者的健康。這 些產(chǎn)業(yè)需要針對(duì)微生物污染物的存在進(jìn)行頻繁的、準(zhǔn)確的、靈敏的測(cè)試，以符合某些標(biāo)準(zhǔn)， 例如由美國(guó)食品與藥品管理局或環(huán)境保護(hù)局規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。
[0006] 取決于情況，區(qū)分活細(xì)胞與非活細(xì)胞的能力還可以是重要的。例如，在藥物制劑和 生物制劑的生產(chǎn)期間，重要的是在生產(chǎn)過程中使用的水是無菌的并且不含污染物。并且，重 要的是在藥物（例如，液體藥物制劑和生物劑型，例如可注射的劑型）中包含的水以及例如 經(jīng)由非腸胃外途徑給予至受試者的液體（例如，鹽水）也是無菌的并且不含污染物。在另一 方面，在飲用水中一些活微生物的存在可以被接受為直到達(dá)到一個(gè)點(diǎn)。為了適于飲用，飲用 水必須符合嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)。即使微生物可以存在于供水中，該水可依然對(duì)于人類消費(fèi)來說是可 接受的。然而，一旦細(xì)胞數(shù)超過一個(gè)閾值水平，該水可能不再被視為對(duì)人類消費(fèi)是安全的。 并且，在某些食物產(chǎn)品（例如，生鮮產(chǎn)品）和飲品（例如，牛奶）中某些預(yù)定水平的微生物 的存在可以是可接受的。然而，一旦已經(jīng)超過那些水平，食物或飲品可被視為已經(jīng)變質(zhì)并且 對(duì)于人類消費(fèi)不再安全。
[0007] 用于評(píng)估微生物污染的存在和/或微生物污染的程度的傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法可 以耗費(fèi)幾天來進(jìn)行，這取決于測(cè)試針對(duì)的微生物。在此期間，存在懷疑的產(chǎn)品（例如，食物、 飲品、或醫(yī)療產(chǎn)品）可以被檢疫隔離，直至結(jié)果獲得并且產(chǎn)品可以釋放。因此，存在一種快 速檢測(cè)（例如，在數(shù)小時(shí)之內(nèi)或更短）樣品中的微生物污染物特別是活的微生物污染物的 存在和/或量的系統(tǒng)和方法的需求。
[0008] 概述
[0009] 本發(fā)明部分地是基于檢測(cè)液體樣品中的活細(xì)胞（例如，原核細(xì)胞或真核細(xì)胞）的 存在和/或數(shù)量的方法的發(fā)現(xiàn)。該方法可以與一種細(xì)胞捕獲系統(tǒng)和/或光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)組合 使用以檢測(cè)細(xì)胞樣品中活細(xì)胞的存在。該方法可以用于一種用以測(cè)量感興趣的特定樣品的 生物負(fù)載（例如，用以測(cè)量活細(xì)胞（例如，活的微生物，如細(xì)菌、酵母菌、以及真菌）的數(shù)目 和/或百分比和/或分?jǐn)?shù)）的方法中。
[0010] 在一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)液體樣品中的活細(xì)胞的存在和/或數(shù)量的方 法。該方法包括：(a)在將有待測(cè)試的該液體樣品通過一種基本上平面的多孔膜之后，對(duì)由 該基本上平面的多孔膜的至少一部分保留的任何活細(xì)胞用一種熒光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記；(b) 通過相對(duì)于一個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)該多孔膜對(duì)該多孔膜的該部分進(jìn)行掃描，該檢測(cè)系統(tǒng)包括 (i) 一個(gè)光源，該光源發(fā)射一束具有一個(gè)波長(zhǎng)的光，該波長(zhǎng)被適配為激發(fā)該熒光標(biāo)記物產(chǎn)生 一個(gè)發(fā)射事件，以及（ii)至少一個(gè)檢測(cè)器，該至少一個(gè)檢測(cè)器能夠檢測(cè)該發(fā)射事件，由此 查詢?cè)撈矫娑嗫啄さ亩鄠€(gè)區(qū)域，并且檢測(cè)通過與任何活細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的熒光標(biāo)記物的激發(fā)而 產(chǎn)生的發(fā)射事件；并且（c)通過基于步驟（b)中檢測(cè)的發(fā)射事件確定由該膜捕獲的活細(xì)胞 的存在和/或數(shù)量。
[0011] 該掃描步驟可以包括用該束光示蹤該多孔膜上的嵌套圓形圖案和螺旋圖案中的 至少一個(gè)。應(yīng)理解的是在該掃描步驟期間，該多孔膜可以移動(dòng)（例如，經(jīng)由直線平移和/或 圍繞一個(gè)旋轉(zhuǎn)軸旋轉(zhuǎn)），同時(shí)該檢測(cè)系統(tǒng)保持靜止。可替代地，該檢測(cè)系統(tǒng)可以移動(dòng)（例如， 經(jīng)由直線平移），同時(shí)該多孔膜圍繞單個(gè)點(diǎn)旋轉(zhuǎn)（例如該多孔膜圍繞旋轉(zhuǎn)軸在單個(gè)位置處 旋轉(zhuǎn)）?？商娲兀赡艿氖嵌嗫啄ず蜋z測(cè)兩者可以移動(dòng)并且它們的相對(duì)位置可以相對(duì)于彼 此來測(cè)量。
[0012] 在某些實(shí)施例中，在步驟（a)中，將這些細(xì)胞使用下文更詳細(xì)描述的活細(xì)胞染色 劑和/或活細(xì)胞染色系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)記。
[0013] 檢測(cè)方法可以在單一的細(xì)胞、細(xì)胞簇或細(xì)胞集落上進(jìn)行。在某些情況下，例如，為 了增加測(cè)定的靈敏度，可以希望的是在將細(xì)胞暴露于熒光染料和熒光淬滅劑之前和/或期 間和/或之后，在允許細(xì)胞增殖的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。包括生長(zhǎng)培養(yǎng)基、溫度、培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間 的選擇的培養(yǎng)條件可以被選擇為允許樣品中的至少一種細(xì)胞具有一次或多次細(xì)胞分裂。
[0014] 在某些實(shí)施例中，用于激發(fā)該熒光染料或這些熒光染料的該束光具有在以下的范 圍內(nèi)的波長(zhǎng)：從大約350nm至大約lOOOnm、從大約350nm至大約900nm、從大約350nm至大 約800nm、從大約350nm至大約700nm、或從大約350nm至大約600nm。例如，激發(fā)光的波長(zhǎng) 是至少處于以下的一個(gè)范圍內(nèi)：從大約350nm至大約500nm、從大約350nm至大約500nm、從 大約350nm至大約600nm、從大約400nm至大約550nm、從大約400nm至大約600nm、從大約 400nm至大約650nm、從大約450nm至大約600nm、從大約450nm至大約650nm、從大約450nm 至大約7〇〇nm、從大約500nm至大約650nm、從大約500nm至大約700nm、從大約500nm至大 約750nm、從大約550nm至大約700nm、從大約550nm至大約750nm、從大約550nm至大約 800nm、從大約600nm至大約750nm、從大約600nm至大約800nm、從大約600nm至大約850nm、 從大約650nm至大約800nm、從大約650nm至大約850nm、從大約650nm至大約900nm、從大 約700nm至大約850nm、從大約700nm至大約900nm、從大約700nm至大約950nm、從大約750 至大約900nm、從大約750至大約950nm或從大約750至大約lOOOnm。某些范圍包括從大 約350nm至大約600nm以及從大約600nm至大約750nm。
[0015] 取決于采用的一種或多種熒光標(biāo)記物，光學(xué)檢測(cè)器可以檢測(cè)處于以下范圍內(nèi)的 發(fā)射光：從大約350nm至大約lOOOnrn、從大約350nm至大約900nm、從大約350nm至大約 800nm、從大約350nm至大約700nm、或從大約350nm至大約600nm。例如，可以檢測(cè)處于以 下范圍內(nèi)的焚光發(fā)射：從大約350nm至550nm、從大約450nm至大約650nm、從大約550nm 至大約750nm、從大約650nm至大約850nm、或從大約750nm至大約950nm、從大約350nm至 大約450nm、從大約450nm至大約550nm、從大約550nm至大約650nm、從大約650nm至大約 750nm、從大約750nm至大約850nm、從大約850nm至大約950nm、從大約350nm至大約400nm、 從大約400nm至大約450nm、從大約450nm至大約500nm、從大約500nm至大約550nm、從大 約550nm至大約600nm、從大約600nm至大約650nm、從大約650nm至700nm、從大約700nm 至大約750nm、從大約750nm至大約800nm、從大約800nm至大約850nm、從大約850nm至大 約900nm、從大約900nm至大約950nm、或從大約950nm至大約lOOOnm。在某些實(shí)施例中，檢 測(cè)到處于以下范圍的發(fā)射光：從大約660nm至大約690nm、從大約690nm至大約720nm、和/ 或從大約720nm至大約850nm。
[0016] 該膜可以具有多種形狀的任何一種，例如，圓形、環(huán)形、卵形、方形、矩形、橢圓形 等，并且可以使一側(cè)的一些部分或全部暴露以用于細(xì)胞截留。并且，該膜可以在其中形成 一個(gè)或多個(gè)孔以適應(yīng)一個(gè)掩罩，并且可以從若干分離的與該掩罩或其他結(jié)構(gòu)元件組裝在一 起的膜形成。在一個(gè)實(shí)施例中，該膜可以處于圓盤的形狀，例如基本上呈平面的圓盤。取 決于所采用的檢測(cè)系統(tǒng)，多孔膜當(dāng)暴露于具有一個(gè)處于從大約350nm至大約lOOOnm范圍內(nèi) 的波長(zhǎng)的光時(shí)基本上是非自發(fā)熒光的。并且，該多孔膜可以具有高達(dá)大約100Um的平面度 公差。并且，該多孔膜可以限定具有一個(gè)平均直徑的多個(gè)孔，該平均直徑小于大約lum從 而允許流體穿過該多孔膜同時(shí)將細(xì)胞保留在其上。該多孔膜可以具有一個(gè)處于選自下組的 范圍內(nèi)的厚度，該組由以下各項(xiàng)組成：從1um至3, 000ym、從10ym至2, 000ym、以及從 100ym至 1，000ym。
[0017] 在某些實(shí)施例中，該細(xì)胞捕獲系統(tǒng)進(jìn)一步包括一個(gè)流體可滲透支撐構(gòu)件，該構(gòu)件 與該膜的第二相對(duì)表面的至少一部分相鄰近。例如處于多孔塑料熔塊形式的流體可滲透支 撐物保留足夠的流體以將水分保留在布置于該可滲透支撐物鄰近處的多孔膜內(nèi)，在某些實(shí) 施例中這對(duì)維持由多孔膜保留的細(xì)胞的活性而言可以是重要的。該支撐構(gòu)件可以具有一個(gè) 處于選自下組的范圍內(nèi)的厚度，該組由以下各項(xiàng)組成：從〇? 1mm至l〇mm、從〇? 5mm至5mm、以 及從1mm至3mm。
[0018] 此外，可能的是對(duì)于該檢測(cè)系統(tǒng)而言包括一種陽性對(duì)照。因此，該方法可以進(jìn)一步 包括將該樣品中的細(xì)胞與多種熒光顆粒組合，這些熒光顆粒在由具有處于從大約350nm至 大約lOOOnm的范圍內(nèi)的波長(zhǎng)的光激活時(shí)發(fā)射一種熒光信號(hào)。此后，由熒光顆粒中的一個(gè)或 多個(gè)產(chǎn)生的熒光信號(hào)可以在由檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到任何活細(xì)胞的同時(shí)得以檢測(cè)到。
[0019] 該方法可以用于在該液體樣品的至少一部分中確定活細(xì)胞的數(shù)量。并且，該檢測(cè) 系統(tǒng)可以用于確定可滲透膜上的活細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)位置。為了測(cè)量并確定細(xì)胞的位置， 該細(xì)胞捕獲系統(tǒng)可任選地進(jìn)一步包括一個(gè)登記器（register)(例如，線、點(diǎn)、或其他標(biāo)記， 標(biāo)戳或結(jié)構(gòu)特征），該登記器與該膜關(guān)聯(lián)從而允許對(duì)保留在該平面膜的至少一部分上的細(xì) 胞的位置進(jìn)行確定。對(duì)于圓盤形膜，極坐標(biāo)（即，徑向"r"，以及角度" 0 "坐標(biāo)定位）可以 是適合的。
[0020] 在檢測(cè)步驟之后，可以在允許由多孔膜捕獲的活細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或增殖的條件下 培養(yǎng)活細(xì)胞?；畹纳锏膶俸?或種可以通過標(biāo)準(zhǔn)程序（例如，微生物染色和可視化程序） 或分子生物學(xué)程序（例如，擴(kuò)增程序，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、滾環(huán)復(fù)制等） 以及通過核酸測(cè)序來確定。
[0021] 通過參考以下說明書、附圖以及權(quán)利要求書，這些和其他對(duì)象連同在此披露的本 發(fā)明的實(shí)施