專(zhuān)利名稱(chēng)：免疫測(cè)定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的免疫測(cè)定用于高度敏感測(cè)量微溶于水的蛋白質(zhì)或處于幾乎不能提取狀態(tài)的蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
隨著分子生物的迅速發(fā)展，對(duì)于免疫測(cè)定試驗(yàn)中更高敏感度的需求漸增。在生命科學(xué)領(lǐng)域，日益證明多種膜結(jié)合細(xì)胞表面蛋白在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮很重要的作用。這些細(xì)胞表面蛋白在動(dòng)物或組織中以多種亞型表達(dá)，它們的時(shí)程和空間表達(dá)模式受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)。因此，在今天的生命科學(xué)領(lǐng)域，高度敏感檢測(cè)細(xì)胞表面蛋白對(duì)于了解各種生命現(xiàn)象是必需的。然而，大部分膜結(jié)合細(xì)胞表面蛋白在沒(méi)有離子表面活性劑的水溶劑中不溶/微溶或幾乎不能提取。
公共衛(wèi)生領(lǐng)域中對(duì)高敏感免疫測(cè)定的需求也漸增。隨著消費(fèi)者越來(lái)越關(guān)心遺傳工程植物、BSE、食物過(guò)敏原等的使用，他們期望食品制造商對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行高度敏感檢測(cè)。特別是，蛋白質(zhì)如食物變應(yīng)原存在于加工食物時(shí)，趨向于和加工食物中的其它成分形成復(fù)雜的復(fù)合體，因此根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，蛋白質(zhì)不易用沒(méi)有離子表面活性劑的水溶劑從加工食物中提取，即使蛋白質(zhì)本質(zhì)上是水溶性的。例如，蛋白質(zhì)趨向于和加工小麥?zhǔn)澄镏衼?lái)自小麥的麩質(zhì)很強(qiáng)結(jié)合，因此水提取溶劑缺乏離子表面活性劑時(shí)幾乎不能提取蛋白質(zhì)。
因而，為通過(guò)免疫測(cè)定實(shí)現(xiàn)高度敏感檢測(cè)微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)，測(cè)定中所用抗體的特異性和親和性應(yīng)改進(jìn)到足以檢測(cè)很少量的這種溶解/提取差的蛋白質(zhì)的存在。然而，特異性和親和性的改進(jìn)有一些限制。
因此，在這種高敏感免疫測(cè)定中，除了改進(jìn)抗體的特異性和親和性，應(yīng)修改測(cè)定的整個(gè)操作。特別考慮能顯著改進(jìn)整個(gè)測(cè)定的敏感性，通過(guò)從樣品中有效提取微溶于水/幾乎不能提取的分析蛋白質(zhì)，為了此目的，用離子表面活性劑如十二烷基硫酸鈉(SDS)溶解/提取微溶于水的蛋白質(zhì)等可以是一種很有力的技術(shù)。然而，離子表面活性劑被認(rèn)為在隨后的免疫測(cè)定中抑制抗原-抗體反應(yīng)，從而避免在高濃度離子表面活性劑存在下的抗原-抗體反應(yīng)。
當(dāng)相對(duì)高濃度的離子表面活性劑如SDS用于有效提取蛋白質(zhì)并因而通過(guò)常規(guī)免疫測(cè)定測(cè)量提取的蛋白質(zhì)時(shí)，離子表面活性劑應(yīng)從提取物中去除或免疫測(cè)定前提取物本身應(yīng)足夠稀釋從而使離子表面活性劑減少至認(rèn)為表面活性劑不對(duì)免疫反應(yīng)施加不利影響的濃度。實(shí)際上，預(yù)處理提取物以減少其中離子表面活性劑濃度，通過(guò)方法如1)用賽璐玢管等透析提取物，2)溶劑通過(guò)離心過(guò)濾等與無(wú)表面活性劑的溶劑交換，3)溶劑通過(guò)凝膠過(guò)濾或離子交換層析與無(wú)表面活性劑的溶劑交換，或4)用化學(xué)物質(zhì)選擇性沉淀表面活性劑。然而，離子表面活性劑易和蛋白質(zhì)形成膠束，因此在很多情況中選擇性去除表面活性劑非常難，意味著上述去除處理可能是所需蛋白質(zhì)的產(chǎn)量顯著減少的原因。此外，首先進(jìn)行去除處理較麻煩。另外，可適當(dāng)稀釋完整提取物以減少離子表面活性劑濃度，然而待測(cè)量的提取蛋白質(zhì)濃度也同時(shí)被稀釋減少，結(jié)果隨后免疫測(cè)定中的檢測(cè)敏感性根本沒(méi)改進(jìn)。一般認(rèn)為由于免疫反應(yīng)的可行性，使用高濃度離子表面活性劑以從樣品中有效提取微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)與隨后的免疫測(cè)定不相容。
日本專(zhuān)利申請(qǐng)待公開(kāi)(Laid-Open)出版號(hào)9-77798(JP 9077798A)描述了離子表面活性劑SDS存在時(shí)的抗原-抗體反應(yīng)(第5頁(yè)，右欄，0030段；第6頁(yè)，左欄，0033段；第10頁(yè)，左欄，0051段)。此參考文獻(xiàn)涉及無(wú)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的血漿蛋白CETP(膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白)的穩(wěn)定和無(wú)交叉反應(yīng)的免疫測(cè)定，在此測(cè)定中，檢測(cè)到用0.001到10％(W/V)SDS預(yù)變性的CETP。在此參考文獻(xiàn)中，也描述了甚至在0.001到0.3％(W/V)SDS存在時(shí)可進(jìn)行CETP和相對(duì)抗體間抗原-抗體反應(yīng)，特別優(yōu)選范圍是0.02到0.03％(W/V)SDS。此外，在本文實(shí)施例中，0.25％SDS預(yù)處理的CETP進(jìn)一步稀釋11倍(通過(guò)加入200μl抗體溶液到20μl預(yù)處理溶液)以調(diào)節(jié)SDS濃度至約0.023％。其后，進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)。
在此參考文獻(xiàn)中，認(rèn)為0.03％或更高濃度的離子表面活性劑如SDS等抑制免疫測(cè)定中的抗原-抗體反應(yīng)。因此參考文獻(xiàn)講授進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)時(shí)，含高濃度SDS的樣品應(yīng)充分稀釋?zhuān)瑥亩鳶DS濃度降至0.03％或更低。
發(fā)明的揭示因此，本發(fā)明的目的是提供一種方法，其中微溶于水的蛋白質(zhì)或處于幾乎不能提取狀態(tài)的蛋白質(zhì)在隨后的免疫反應(yīng)中敏感且容易檢測(cè)，同時(shí)維持從樣品提取的高效率，蛋白質(zhì)需要以很高的敏感度檢測(cè)。
與現(xiàn)有技術(shù)中的普通技術(shù)知識(shí)相反，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)即使存在高濃度離子表面活性劑時(shí)，抗原-抗體反應(yīng)本身不被抑制到不能檢測(cè)的水平。也發(fā)現(xiàn)即使對(duì)于其抗原-抗體反應(yīng)明顯被高濃度離子表面活性劑抑制的某一蛋白，用抗此蛋白的抗體可令人滿意地影響抗原-抗體反應(yīng)，蛋白質(zhì)預(yù)先用離子表面活性劑預(yù)變性。在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了一種高度敏感和容易的免疫測(cè)定，用于微溶于水的蛋白質(zhì)或處于幾乎不能提取狀態(tài)的蛋白質(zhì)。因此根據(jù)本發(fā)明，提供了一種高度敏感和容易的免疫測(cè)定，特征是樣品中所含微溶于水的蛋白質(zhì)或處于幾乎不能提取狀態(tài)的蛋白質(zhì)可用水溶劑提取/溶解，溶劑含相對(duì)高濃度的離子表面活性劑，然后所得提取物中的蛋白質(zhì)能通過(guò)免疫測(cè)定直接檢測(cè)，沒(méi)有提取物溶劑與另一種溶劑的交換，或沒(méi)有顯著稀釋提取物從而蛋白質(zhì)濃度未減少到不能檢測(cè)的水平。
因此，本法提供免疫測(cè)定用于檢測(cè)樣品中微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)，包括步驟(I)用含離子表面活性劑的水溶劑提取和/或溶解樣品中微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)，(II)加入抗體，抗體用微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)作為免疫原獲得，蛋白質(zhì)預(yù)先用步驟(I)中所用離子表面活性劑變性a)上面步驟(I)中所得蛋白質(zhì)溶液沒(méi)有顯著稀釋溶液，或b)稀釋?zhuān)渲猩厦娌襟E(I)中所得蛋白質(zhì)溶液稀釋的范圍使離子表面活性劑濃度不降至0.03％(W/V)或更低，從而微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)和抗體間形成抗原-抗體復(fù)合物，和(III)檢測(cè)形成的抗原-抗體復(fù)合物。
發(fā)現(xiàn)即使步驟(I)的水溶劑中離子表面活性劑濃度高于例如0.03％(W/V)，在用所述水溶劑提取的樣品(蛋白質(zhì))溶液中形成抗原-抗體復(fù)合物不受抑制。即步驟(II)中的抗原-抗體復(fù)合物可在濃度高于0.3％(W/V)的離子表面活性劑存在時(shí)形成，優(yōu)選1％(W/V)或更高。即使樣品溶液應(yīng)稀釋用于定量分析等目的，離子表面活性劑不需要稀釋到0.03％(W/V)或更低濃度，在現(xiàn)有技術(shù)中認(rèn)為極好的抗原-抗體反應(yīng)需要0.03％(W/V)或更低濃度，這意味著可實(shí)踐本發(fā)明方法而不損失離子表面活性劑的高提取力。
本發(fā)明的離子表面活性劑可選自十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鋰、月桂基肌氨酸鈉、溴化十六烷基三甲銨、氯化十六烷基三甲銨、氯化十六烷基吡啶等，如果需要可混合這些表面活性劑。由于其可用性等，生化領(lǐng)域常用的十二烷基硫酸鈉(SDS)尤其能作為較佳例子提及。
已顯示步驟(I)中的水溶劑也可包含還原劑如2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇等，它們能進(jìn)一步變性蛋白質(zhì)。因此，步驟(I)中優(yōu)選水溶劑的非限制例子包括含1％(W/V)十二烷基硫酸鈉和1M 2-巰基乙醇的水溶劑。
為保證測(cè)量的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，蛋白質(zhì)溶液優(yōu)選在步驟(I)中進(jìn)一步煮沸，優(yōu)選在80℃或更高連續(xù)煮沸5分鐘或更長(zhǎng)。
本發(fā)明方法特別有利于高度敏感測(cè)量卵清蛋白、卵類(lèi)粘蛋白、酪蛋白、β-乳球蛋白、蕎麥蛋白、小麥蛋白和花生蛋白，它們處于幾乎不能提取狀態(tài)。卵清蛋白、卵類(lèi)粘蛋白、酪蛋白等本身易溶于水，但存在于加工食物等的復(fù)雜基質(zhì)中時(shí)，蛋白質(zhì)可能用常規(guī)水溶劑幾乎不能提取。本發(fā)明方法可很有效用于高度敏感測(cè)量處于這種不能提取狀態(tài)的蛋白質(zhì)。
因此，由于離子表面活性劑對(duì)蛋白質(zhì)溶解的極好效果和新發(fā)現(xiàn)高濃度離子表面活性劑存在時(shí)的抗原-抗體反應(yīng)性質(zhì)，本發(fā)明方法能很有效用于現(xiàn)在的生命科學(xué)研究和確保食物質(zhì)量，其中需要高度敏感檢測(cè)微溶于水的蛋白質(zhì)或處于幾乎不能提取狀態(tài)的蛋白質(zhì)。
附圖的簡(jiǎn)述

圖1顯示標(biāo)準(zhǔn)卵類(lèi)粘蛋白的測(cè)量結(jié)果(在450nm波長(zhǎng)和630nm副波長(zhǎng)測(cè)量的吸光度)，連續(xù)稀釋標(biāo)準(zhǔn)后用本發(fā)明所述方法(基于EIA原理的固相三明治方法)。
圖2顯示測(cè)量系統(tǒng)中未知濃度的含卵類(lèi)粘蛋白樣品的測(cè)量結(jié)果(樣品a到c)(在450nm波長(zhǎng)和630nm副波長(zhǎng)測(cè)量的吸光度)，用本發(fā)明所述方法(基于EIA原理的固相三明治方法)。
圖3顯示HDTMAB、HDTMAC和HDPC存在時(shí)卵清蛋白的測(cè)量結(jié)果(參考實(shí)施例)。各表面活性劑濃度(％)在橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)吸光度上顯示。
圖4顯示LDS、月桂酰肌氨酸鈉、SDS存在時(shí)卵清蛋白的測(cè)量結(jié)果(參考實(shí)施例)。各表面活性劑濃度(％)在橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)吸光度上顯示。
圖5顯示HDTMAB、HDTMAC和HDPC存在時(shí)卵類(lèi)粘蛋白的測(cè)量結(jié)果。各表面活性劑濃度(％)在橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)吸光度上顯示。
圖6顯示LDS、月桂基肌氨酸鈉、SDS存在時(shí)卵類(lèi)粘蛋白的測(cè)量結(jié)果。各表面活性劑濃度(％)在橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)吸光度上顯示。
圖7顯示吐溫20、Luburol PX、Triton X-100和DOC存在時(shí)卵清蛋白的測(cè)量結(jié)果(參考實(shí)施例)。各表面活性劑濃度(％)在橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)吸光度上顯示。
圖8顯示吐溫20、Luburol PX、Triton X-100和DOC存在時(shí)卵類(lèi)粘蛋白的測(cè)量結(jié)果(參考實(shí)施例)。各表面活性劑濃度(％)在橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)吸光度上顯示。
圖9顯示SDS存在時(shí)酪蛋白的測(cè)量結(jié)果。各表面活性劑(SDS)濃度(％)在橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)吸光度上顯示。(閉合正方形)是存在抗原，(閉合菱形)是缺乏抗原(對(duì)照)。
圖10顯示SDS存在時(shí)β-乳球蛋白的測(cè)量結(jié)果。表面活性劑(SDS)濃度(％)在橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)吸光度上顯示。(閉合正方形)是存在抗原，(閉合菱形)是缺乏抗原(對(duì)照)。
圖11顯示SDS存在時(shí)蕎麥蛋白的測(cè)量結(jié)果。表面活性劑(SDS)濃度(％)在橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)吸光度上顯示。(閉合正方形)是存在抗原，(閉合菱形)是缺乏抗原(對(duì)照)。
圖12顯示SDS存在時(shí)小麥蛋白(麥醇溶蛋白)的測(cè)量結(jié)果。表面活性劑(SDS)濃度(％)在橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)吸光度上顯示。(閉合正方形)是存在抗原，(閉合菱形)是缺乏抗原(對(duì)照)。
圖13顯示SDS存在時(shí)花生蛋白的測(cè)量結(jié)果。表面活性劑(SDS)濃度(％)在橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)吸光度上顯示。(閉合正方形)是存在抗原，(閉合菱形)是缺乏抗原(對(duì)照)。
圖14顯示卵清蛋白的測(cè)量結(jié)果，用根據(jù)本發(fā)明的抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體。
圖15顯示在用根據(jù)本發(fā)明的抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體的方法中，煮沸卵清蛋白樣品溶液隨著時(shí)間對(duì)檢測(cè)敏感度的穩(wěn)定性的效果。參考實(shí)施例顯示測(cè)量結(jié)果，其中使用天然蛋白的抗體，加熱或不加熱樣品溶液。
圖16顯示在用根據(jù)本發(fā)明的抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體的方法中，煮沸卵類(lèi)粘蛋白樣品溶液隨著時(shí)間對(duì)檢測(cè)敏感度的穩(wěn)定性的效果。參考實(shí)施例顯示測(cè)量結(jié)果，其中使用天然蛋白的抗體，加熱或不加熱樣品溶液。
圖17顯示在用根據(jù)本發(fā)明的抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體的方法中，煮沸花生蛋白樣品溶液隨著時(shí)間對(duì)檢測(cè)敏感度的穩(wěn)定性的效果。參考實(shí)施例顯示測(cè)量結(jié)果，其中使用天然蛋白的抗體，加熱或不加熱樣品溶液。
圖18顯示在用根據(jù)本發(fā)明的抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體的方法中，煮沸蕎麥蛋白樣品溶液隨著時(shí)間對(duì)檢測(cè)敏感度的穩(wěn)定性的效果。參考實(shí)施例顯示測(cè)量結(jié)果，其中使用天然蛋白的抗體，加熱或不加熱樣品溶液。
圖19顯示本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選方面的測(cè)定敏感性，其中使用抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體結(jié)合煮沸樣品溶液。例子顯示測(cè)量結(jié)果，其中各濃度的卵清蛋白溶解于緩沖溶液(PBS，pH6.5)以制備樣品溶液，緩沖溶液含1％SDS和1M 2-巰基乙醇，樣品溶液在100℃熱水浴中加熱5分鐘，然后冷卻并用ELISA測(cè)量，而參考例顯示測(cè)量結(jié)果，其中使用天然卵清蛋白的抗體，加熱樣品溶液。
圖20顯示本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選方面的測(cè)定敏感性，其中使用抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體結(jié)合煮沸樣品溶液。例子顯示測(cè)量結(jié)果，其中各濃度的卵類(lèi)粘蛋白溶解于緩沖溶液(PBS，pH6.5)以制備樣品溶液，緩沖溶液含1％SDS和1M 2-巰基乙醇，樣品溶液在100℃熱水浴中加熱5分鐘，然后冷卻并用ELISA測(cè)量，而參考例顯示測(cè)量結(jié)果，其中使用天然卵類(lèi)粘蛋白的抗體，加熱樣品溶液。
圖21顯示本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選方面的測(cè)定敏感性，其中使用抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體結(jié)合煮沸樣品溶液。例子顯示測(cè)量結(jié)果，其中各濃度的花生蛋白溶解于緩沖溶液(PBS，pH6.5)以制備樣品溶液，緩沖溶液含1％SDS和1M 2-巰基乙醇，樣品溶液在100℃熱水浴中加熱5分鐘，然后冷卻并用ELISA測(cè)量，而參考例顯示測(cè)量結(jié)果，其中使用天然花生蛋白的抗體，加熱樣品溶液。
圖22顯示本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選方面的測(cè)定敏感性，其中使用抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體結(jié)合煮沸樣品溶液。例子顯示測(cè)量結(jié)果，其中各濃度的蕎麥蛋白溶解于緩沖溶液(PBS，pH6.5)以制備樣品溶液，緩沖溶液含1％SDS和1M 2-巰基乙醇，樣品溶液在100℃熱水浴中加熱5分鐘，然后冷卻并用ELISA測(cè)量，而參考例顯示測(cè)量結(jié)果，其中使用天然蕎麥蛋白的抗體，加熱樣品溶液。
完成發(fā)明的最佳模式本發(fā)明的主題“微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)”是一種蛋白質(zhì)，在無(wú)離子表面活性劑的純水或一般使用的生理緩沖溶液中不表現(xiàn)出顯著溶解性或不能用這種緩沖溶液從樣品中大量提取，但用含本發(fā)明離子表面活性劑的緩沖溶液等能溶解或提取蛋白質(zhì)到可被隨后免疫測(cè)定檢測(cè)的濃度。換句話說(shuō)，本發(fā)明的“微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)”用含離子表面活性劑的緩沖溶液等顯示的溶解性和/或提取效率顯著高于無(wú)離子表面活性劑的純水或緩沖溶液。通常，本發(fā)明的主題“微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)”在含本發(fā)明離子表面活性劑的緩沖溶液中可表現(xiàn)出溶解性和/或提取效率改進(jìn)，至少是無(wú)離子表面活性劑的純水或緩沖溶液中溶解性和提取效率的5倍，優(yōu)選至少10倍，更優(yōu)選至少50倍。微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)的非限制例子包括結(jié)構(gòu)蛋白和膜結(jié)合細(xì)胞表面蛋白。特別是，有生化重要功能的膜蛋白例如細(xì)胞表面受體和細(xì)胞粘附因子是有趣的。微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)的其它例子包括在加工食物等中存在的食物變應(yīng)原蛋白。例如，卵清蛋白、卵類(lèi)粘蛋白、酪蛋白、β-乳球蛋白、蕎麥蛋白、小麥蛋白和花生蛋白被認(rèn)為是重要的食物變應(yīng)原蛋白。這些蛋白質(zhì)包括本身溶于水的，但當(dāng)與加工食物中其它成分強(qiáng)絡(luò)合且在食物基質(zhì)中整合時(shí)，可處于幾乎不能提取的狀態(tài)。處于這種幾乎不能提取狀態(tài)的水溶性蛋白質(zhì)也在本文所指“微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)”的范圍中，只要它們能通過(guò)本發(fā)明的離子表面活性劑作用第一次提取。
本發(fā)明所指“樣品”可以是液體、半固體或固體、或它們的混合物，懷疑含微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)，且可有利地是樣品，包括的固體基質(zhì)具有整合其中的微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)，固體基質(zhì)包括但不限于細(xì)胞、細(xì)胞膜、組織和器官，也包括食物和材料。
在本發(fā)明方法中，上述微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)用含離子表面活性劑的“水溶劑”溶解/提取?！八軇敝杆畸}溶液如氯化鈉、氯化鉀和碳酸氫鈉；多種緩沖溶液一般用于生化領(lǐng)域，例如磷酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液和檸檬酸緩沖液；堿性或酸性溶液，其pH用氫氧化鈉、鹽酸等調(diào)節(jié)。水溶劑也可包含輔助成分以進(jìn)一步改進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解性和提取效率。例如，螯合化合物如乙二胺四乙酸(EDTA)、酶如磷脂酶、控制HLB的非離子表面活性劑可加入水溶劑。也能加入蛋白酶抑制劑用于在提取和貯存中控制溶液中的蛋白質(zhì)降解，抗微生物劑如疊氮化鈉用于防止微生物繁殖，抗氧化劑如抗壞血酸。此外，極性有機(jī)溶劑如甘油和乙醇也可加入水溶劑，加入范圍使隨后免疫測(cè)定可行。
加入水溶劑的本發(fā)明離子表面活性劑可以是任何已知表面活性劑，因?yàn)樗茱@著改進(jìn)微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)的溶解性和提取。離子表面活性劑優(yōu)選選自十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鋰、月桂基肌氨酸鈉、溴化十六烷基三甲銨、氯化十六烷基三甲銨、氯化十六烷基吡啶和它們的混合物。從可用性和處理觀點(diǎn)看，十二烷基硫酸鈉(SDS)可作為特別優(yōu)選的離子表面活性劑提及。特別是，SDS是廣泛用于電泳如SDS-PAGE的離子表面活性劑，但是用于促進(jìn)電泳與免疫測(cè)定關(guān)聯(lián)的優(yōu)選離子表面活性劑。
加入的離子表面活性劑濃度可以是充分達(dá)到本發(fā)明目的的任何濃度，本發(fā)明目的是溶解和提取微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)，但通常離子表面活性劑以0.1％(W/V)或更高濃度加入，優(yōu)選0.3％(W/V)或更高，或甚至0.5％(W/V)或更高。離子表面活性劑更優(yōu)選以1％(W/V)或更高濃度加入水溶劑，也可使用約10％(W/V)高濃度的離子表面活性劑。在本發(fā)明方法中，用含離子表面活性劑的水溶劑以這種高濃度溶解/提取的蛋白質(zhì)可通過(guò)隨后免疫測(cè)定檢測(cè)，同時(shí)充分維持離子表面活性劑濃度。
除了高濃度離子表面活性劑，優(yōu)選加入還原劑到本發(fā)明特別優(yōu)選的水溶劑，通常是2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)、氰氫硼化鈉(SCBH)、二甲胺硼烷(DMAB)、氫硼化鈉(SBH)或半胱氨酸。這是因?yàn)橥ǔ８鶕?jù)經(jīng)驗(yàn)，隨后免疫測(cè)定的重復(fù)性可通過(guò)加入還原劑來(lái)改進(jìn)，盡管沒(méi)有揭示此改進(jìn)的原理。還原劑優(yōu)選以約1mM到2M的濃度加入水溶劑，通常以約1M的濃度。
如上所述，本發(fā)明特別優(yōu)選的含離子表面活性劑的水溶劑可以是例如含1％(W/V)十二烷基硫酸鈉和1M 2-巰基乙醇的磷酸緩沖液。
如已證明的，本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)用離子表面活性劑溶解/提取，離子表面活性劑有溶解蛋白質(zhì)的強(qiáng)能力，所得提取溶液可經(jīng)受隨后的免疫測(cè)定而沒(méi)有大量稀釋提取物。根據(jù)常規(guī)技術(shù)常識(shí)，認(rèn)為當(dāng)離子表面活性劑如SDS以相對(duì)高濃度(例如0.03％或更高)存在于反應(yīng)溶液時(shí)，不能獲得所需抗原-抗體反應(yīng)。因此在涉及微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)的典型常規(guī)免疫測(cè)定中，抗體加入樣品溶液前需要麻煩的預(yù)處理或大量稀釋樣品溶液，樣品溶液含高濃度離子表面活性劑；即在抗原-抗體反應(yīng)前通過(guò)此預(yù)處理或稀釋?zhuān)瑯悠啡芤褐须x子表面活性劑濃度必須降至約0.03％。因此，例如在抗原-抗體反應(yīng)前，含用10％(W/V)SDS提取的微溶蛋白的樣品溶液應(yīng)稀釋至少300倍(0.03％SDS)，意味著蛋白質(zhì)檢測(cè)敏感性減少到1/300。
另一方面，在本發(fā)明方法中，即使存在高濃度離子表面活性劑，抗原-抗體反應(yīng)可令人滿意地完成，抗原-抗體反應(yīng)的特異性和親和性能用變性蛋白的抗體顯著改進(jìn)，變性蛋白通過(guò)用相同離子表面活性劑變性目標(biāo)蛋白質(zhì)獲得，在此發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上，預(yù)期整個(gè)測(cè)定敏感性用蛋白質(zhì)溶液改進(jìn)，蛋白質(zhì)用含如1％SDS的水溶劑溶解，作為隨后抗原-抗體反應(yīng)中的樣品溶液而沒(méi)有大量稀釋它。在本發(fā)明方法中，用含至少10％(W/V)SDS的溶劑溶解的微溶蛋白可通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)在10％SDS溶液中測(cè)量。為精確定量樣品溶液中的抗原蛋白，通常需要適當(dāng)連續(xù)稀釋的溶液用于確定測(cè)量的線性等。在本發(fā)明中，不需減少如上連續(xù)稀釋中樣品溶液中的SDS濃度，因此避免由于SDS濃度降低的結(jié)果微溶于水的蛋白質(zhì)的可能沉淀。因此在本發(fā)明中，離子表面活性劑濃度不需降至0.03％(W/V)或更低，即使含高濃度離子表面活性劑的樣品溶液視情況稀釋。
如上所述，本發(fā)明的一個(gè)重要特征是以抗原-抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的本免疫測(cè)定用微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)的特異抗體進(jìn)行，蛋白質(zhì)在前面用特定離子表面活性劑變性，其中變性蛋白的特異抗體獲得自施用變性蛋白作為免疫原的免疫動(dòng)物。
具體地，當(dāng)已知樣品中微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)可用含SDS的水溶劑提取時(shí)，蛋白質(zhì)用SDS變性，變性蛋白作為免疫原施用給待免疫動(dòng)物以制備本發(fā)明抗體。能容易完成蛋白變性，通過(guò)溶解或懸浮溶液中微溶于水/幾乎不能提取的分析蛋白質(zhì)并然后置于室溫至少過(guò)夜，溶液含高濃度離子表面活性劑。在本發(fā)明較佳例子中，其中用于溶解/提取蛋白質(zhì)的水溶劑含另外的還原劑如2-巰基乙醇和SDS，免疫原蛋白變性可優(yōu)選在2-巰基乙醇和SDS存在時(shí)進(jìn)行。在這種情況中，微溶于水/幾乎不能提取的分析蛋白質(zhì)可懸浮/溶解于含1％SDS和1M 2-巰基乙醇的水溶劑中，然后置于室溫至少過(guò)夜，可用作變性蛋白免疫原用于制備本發(fā)明抗體。
在施用這樣獲得的變性蛋白到待免疫的動(dòng)物時(shí)，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方案，方案的最優(yōu)化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員也是容易的。作為免疫動(dòng)物，可使用小鼠、大鼠、綿羊、兔等。
特別是，當(dāng)本發(fā)明抗體以多克隆抗體形式使用時(shí)，多克隆抗體制備自免疫動(dòng)物的抗血清。具體地能特定獲得來(lái)自免疫動(dòng)物的抗血清，例如通過(guò)皮下注射含佐劑的免疫原到待免疫動(dòng)物，以適當(dāng)間隔(如1周)預(yù)定次數(shù)(如5次)重復(fù)此皮下施用，最終免疫后收集全血，分離抗血清。這些方法描述于例如《新編免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(Current Protocols in Immunology)，2.4章，John Wiley&Sons，Inc.，NewYork出版。可完成從抗血清純化多克隆抗體，通過(guò)將動(dòng)物免疫所用變性蛋白固定到層析樹(shù)脂上，例如CNBr-活化瓊脂糖或HiTrapNHS-活化(Amersham Pharmacia生產(chǎn))，然后應(yīng)用抗血清到固定樹(shù)脂上以特異吸收抗血清中的抗體到樹(shù)脂上，用合適的緩沖液或離液序列高的離子洗脫來(lái)回收樹(shù)脂上吸附的抗體。多克隆抗體也可通過(guò)任何其它方法純化。
當(dāng)本發(fā)明抗體作為單克隆抗體獲得時(shí)，免疫小鼠的脾細(xì)胞通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)與用于細(xì)胞融合的親代細(xì)胞融合，如骨髓瘤細(xì)胞株，合適的融合細(xì)胞選白所得雜交瘤，然后克隆，體外或體內(nèi)培養(yǎng)，高度特異的單克隆抗體收集自培養(yǎng)混合物。
作為本發(fā)明的抗體，不僅能用上述多克隆/單克隆抗體，也能用酶消化抗體所得的反應(yīng)性抗體片段。抗體片段的例子包括Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、F(v)片段、H-鏈單體、L-鏈單體或二聚體、一條H鏈和一條L鏈組成的二聚體。片段可通過(guò)用蛋白酶如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗體獲得，接著如果需要用還原劑處理。H-或L-鏈單體也可用還原劑如二硫蘇糖醇處理完整抗體獲得，然后分離純化的鏈。
在本發(fā)明中，離子表面活性劑-變性蛋白的抗體優(yōu)選用于測(cè)量，但顯示用于某些蛋白質(zhì)時(shí)，不總是需要其變性蛋白的抗體，其天然蛋白的抗體也可用于獲得容許的檢測(cè)。然而，觀察到在用這種天然蛋白的抗體的檢測(cè)中，檢測(cè)敏感性一般與時(shí)間段成比例減少，其中留下含離子表面活性劑的樣品溶液。即當(dāng)微溶于水/幾乎不能提取的特定蛋白質(zhì)用含離子表面活性劑的水溶劑提取并然后相對(duì)立即進(jìn)行隨后抗原-抗體反應(yīng)時(shí)，意識(shí)到形成相對(duì)穩(wěn)定的抗原-抗體復(fù)合物，但提取后，復(fù)合物形成的速度隨著時(shí)間減少。這意味著在用天然蛋白的抗體的免疫測(cè)定中，在測(cè)定完成前測(cè)定的重復(fù)性能以時(shí)間-依賴(lài)的方式降低。
另一方面，發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用本發(fā)明的變性蛋白的抗體時(shí)，這種隨著時(shí)間的檢測(cè)變化可忽略。也發(fā)現(xiàn)特別是當(dāng)提取物在前面被煮沸時(shí)，能完成高重復(fù)性的測(cè)定。即在本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)選方面中，微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)用含高濃度離子表面活性劑的水溶劑提取，然后煮沸所得蛋白質(zhì)溶液，如在80℃或更高溫度加熱5分鐘或更長(zhǎng)，然后冷卻，離子表面活性劑-變性蛋白的抗體加入溶液以形成抗原-抗體復(fù)合物。
因此，提供了一種高度敏感免疫測(cè)定方案，在有效溶解/提取微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)后能有效完成抗原-抗體反應(yīng)且沒(méi)有通過(guò)稀釋等損失高程度提取。
本發(fā)明免疫測(cè)定包括檢測(cè)以上述方式形成的抗原-抗體復(fù)合物，要理解的是此檢測(cè)能用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法完成。例如，在作為本發(fā)明免疫測(cè)定例子之一的三明治免疫測(cè)定中，本發(fā)明離子表面活性劑-變性蛋白的抗體可用于包被固相如孔底以提供捕獲-側(cè)(capture-side)抗體，而另一種變性蛋白的抗體(可以和捕獲-側(cè)抗體相同或不同)能用放射性物質(zhì)、有色顆?；蛎笜?biāo)記以提供檢測(cè)-側(cè)抗體。含離子表面活性劑的樣品溶液加入有捕獲-側(cè)抗體的孔并孵育一段預(yù)定時(shí)間后，樣品提取物從各孔中取出，孔用合適的緩沖溶液充分洗滌，檢測(cè)-側(cè)的抗體加入孔。孵育一段預(yù)定時(shí)間后，洗孔，然后檢測(cè)到捕獲-側(cè)抗體/分析物/檢測(cè)-側(cè)抗體復(fù)合物的形成。此檢測(cè)取決于標(biāo)記檢測(cè)-側(cè)抗體的標(biāo)記物質(zhì)的性質(zhì)。當(dāng)標(biāo)記是放射性物質(zhì)時(shí)檢測(cè)到放射量，或當(dāng)標(biāo)記是有色顆粒時(shí)檢測(cè)到著色強(qiáng)度或吸光度，當(dāng)標(biāo)記是酶時(shí)檢測(cè)到合適的底物加入孔并預(yù)定孵育后的吸光度(ELISA方法)。ELISA方法中酶標(biāo)記所用的酶沒(méi)有特別限制，酶如辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶可有利地使用。在辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的情況中，3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺等能用作酶的底物。當(dāng)使用堿性磷酸酶時(shí)，p-硝基苯基磷酸作為底物提及。在免疫測(cè)定的測(cè)量結(jié)果的基礎(chǔ)上，可檢測(cè)到本發(fā)明主題微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)上面描述可充分利用本發(fā)明而不需更多描述。在下文中，給出實(shí)施例僅用于解釋。以下除非另有說(shuō)明，濃度(％)表示為重量/體積(W/V)％。
實(shí)施例1通過(guò)固相三明治方法測(cè)量含SDS樣品中的卵類(lèi)粘蛋白(用天然卵類(lèi)粘蛋白的抗體)(1)抗卵類(lèi)粘蛋白抗體的固定兔抗(天然)卵類(lèi)粘蛋白多克隆抗體以lμg/ml溶于碳酸鹽緩沖液(pH9.6)。此溶液以100μl/孔體積吸入微量滴定板(Nunc生產(chǎn)的微型平板Maxsorp-F8)并置于環(huán)境溫度中2小時(shí)。
(2)封閉微量滴定板抗體溶液從各孔去除后，300μl封閉溶液(20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，含150mM NaCl、0.05％吐溫20、0.1％牛血清清蛋白)加入各孔并置于環(huán)境溫度中2小時(shí)。
(3)測(cè)量卵類(lèi)粘蛋白封閉溶液從各孔去除后，100μl卵類(lèi)粘蛋白標(biāo)準(zhǔn)(商品名蛋胰蛋白酶抑制劑，Nacalai Tesque生產(chǎn))溶液用樣品稀釋液(20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，含0.1％牛血清清蛋白、150mM NaCl、0.05％吐溫20和0％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％或1％SDS)連續(xù)稀釋?zhuān)尤敫骺撞⒅糜诃h(huán)境溫度中2小時(shí)。(在測(cè)量下示多種樣品中，當(dāng)樣品中所含卵類(lèi)粘蛋白的量在上面系統(tǒng)測(cè)量范圍以外時(shí)，用樣品稀釋液測(cè)量前進(jìn)一步稀釋樣品以致卵類(lèi)粘蛋白的量在系統(tǒng)測(cè)量范圍內(nèi)。)然后，各孔用300μl洗滌溶液洗6次，100μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗卵類(lèi)粘蛋白多克隆抗體溶液加入各孔并置于環(huán)境溫度中30分鐘，抗體溶液預(yù)先用20mMTris-HCl緩沖液(pH7.4)稀釋?zhuān)彌_液含0.1％BSA、150mM NaCl和0.05％吐溫20。然后，各孔用300μl洗滌溶液洗5次，TMB(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)溶液以100μl/孔體積加入，然后在環(huán)境溫度中暗處反應(yīng)10分鐘。之后，100μl 1N硫酸加入各孔以終止反應(yīng)。用微量滴定板讀數(shù)器在450nm主波長(zhǎng)和630nm副波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光度。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線示于圖1。
如從圖1可見(jiàn)，確定在此測(cè)量系統(tǒng)中，即使存在SDS時(shí)也能定量卵類(lèi)粘蛋白，因?yàn)?.01到1.0％SDS溶液中樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線幾乎與無(wú)SDS溶液中樣品的曲線相同。
實(shí)際測(cè)量多種樣品中卵類(lèi)粘蛋白的量時(shí)，在以此方式獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線基礎(chǔ)上確定樣品中卵類(lèi)粘蛋白的量。
(4)樣品的免疫測(cè)定根據(jù)上述測(cè)試，實(shí)際進(jìn)行樣品的免疫測(cè)定。來(lái)自3種商業(yè)購(gòu)買(mǎi)mayonnaise產(chǎn)品的樣品溶液通過(guò)用含1％SDS的樣品稀釋液3倍連續(xù)稀釋mayonnaise樣品來(lái)制備，在制備自同時(shí)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)卵類(lèi)粘蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線基礎(chǔ)上，確定樣品的卵類(lèi)粘蛋白濃度。如圖2中的結(jié)果所示，獲得經(jīng)過(guò)坐標(biāo)原點(diǎn)的極佳線性。
(5)回收測(cè)試根據(jù)上述測(cè)試方法進(jìn)行抗原回收測(cè)試。
3種商業(yè)購(gòu)買(mǎi)的餅干產(chǎn)品用作樣品以制備含1％SDS的提取物。即各餅干均一壓成粉末，稱(chēng)重2g粉末并收集。含1％SDS的38ml樣品稀釋液加入粉末并用勻漿器攪勻30秒兩次，所得混合物以3,000xg離心20分鐘。所得上清用5A濾紙過(guò)濾，過(guò)濾物在測(cè)量中用作食物提取物(含1％SDS的提取物)。然后，標(biāo)準(zhǔn)卵類(lèi)粘蛋白加入提取物且進(jìn)行免疫測(cè)定，從測(cè)量中確定加入的卵類(lèi)粘蛋白的回收。回收表示為(進(jìn)一步加入抗原的樣品中檢測(cè)的抗原量-原始樣品中檢測(cè)的抗原量)/(加入的抗原量[％])的比例。
如表1所示，回收高達(dá)88.7到96.1％，表明食物中的卵類(lèi)粘蛋白可通過(guò)本發(fā)明的方法準(zhǔn)確和敏捷測(cè)量。
表1.回收測(cè)試的結(jié)果

實(shí)施例2通過(guò)固相三明治方法測(cè)量含多種離子表面活性劑或非離子表面活性劑的樣品中的卵類(lèi)粘蛋白和卵清蛋白(用抗天然蛋白的抗體)SDS、十二烷基硫酸鋰(LDS)和月桂基)肌氨酸鈉作為本發(fā)明的陰離子表面活性劑，溴化十六烷基三甲銨(HDTMAB)、氯化十六烷基三甲銨(HDTMAC)和氯化十六烷基吡啶(HDPC)作為陽(yáng)離子表面活性劑，吐溫20、Luburol PX和Triton X-100作為參考的非離子表面活性劑，脫氧膽酸(DOC)作為具類(lèi)固醇骨架的表面活性劑，在與實(shí)施例1相同條件下檢測(cè)它們對(duì)卵類(lèi)粘蛋白和卵清蛋白的免疫測(cè)定系統(tǒng)(參考實(shí)施例)的影響。
即在上述各表面活性劑以不同濃度存在時(shí)，測(cè)量免疫測(cè)定中含64ng/ml卵清蛋白和64ng/ml卵類(lèi)粘蛋白的樣品，確定吸光度。結(jié)果示于表2到5和圖3到8。
表2.卵清蛋白測(cè)量系統(tǒng)中離子表面活性劑的影響

表3.卵類(lèi)粘蛋白測(cè)量系統(tǒng)中離子表面活性劑的影響

表4.卵清蛋白測(cè)量系統(tǒng)中非離子表面活性劑的影響

表5.卵類(lèi)粘蛋白測(cè)量系統(tǒng)中非離子表面活性劑的影響

此測(cè)試結(jié)果顯示在卵清蛋白測(cè)量系統(tǒng)中，測(cè)量敏感性顯著降低且免疫測(cè)定被相對(duì)高濃度(如0.1％或更高)離子表面活性劑抑制，而在卵類(lèi)粘蛋白測(cè)量系統(tǒng)中，即使存在很高濃度約10％離子表面活性劑時(shí)測(cè)量也是充分可行的。因此證明除了抗(天然)卵清蛋白抗體即使抗天然蛋白抗體，也可用于使免疫測(cè)定系統(tǒng)達(dá)到極佳檢測(cè)敏感性和準(zhǔn)確性，結(jié)合本發(fā)明離子表面活性劑的高蛋白提取能力。參考的非離子表面活性劑和脫氧膽酸在卵清蛋白或卵類(lèi)粘蛋白測(cè)量系統(tǒng)中不施加影響。
實(shí)施例3測(cè)量酪蛋白和β-乳球蛋白(用抗天然蛋白的抗體)酪蛋白或β-乳球蛋白在與實(shí)施例1幾乎相同的流程中測(cè)量，除了使用抗(天然)酪蛋白抗體或抗(天然)β-乳球蛋白抗體取代抗(天然)卵類(lèi)粘蛋白抗體。即乳蛋白質(zhì)以64ng/ml的量加入樣品稀釋液，連續(xù)稀釋至10％到0.156％SDS濃度，產(chǎn)生測(cè)量的樣品溶液。樣品中的酪蛋白和β-乳球蛋白分別通過(guò)商業(yè)購(gòu)買(mǎi)的酪蛋白牛奶免疫測(cè)定試劑盒和β-乳球蛋白牛奶免疫測(cè)定試劑盒測(cè)量，都用來(lái)自MorinagaInsutitute of Biological Science Co.，Ltd.，的天然蛋白的抗體(商品名，用于特殊物質(zhì)的Morinaga免疫測(cè)定試劑盒，牛奶測(cè)量試劑盒(酪蛋白)；用于特殊物質(zhì)的Morinaga免疫測(cè)定試劑盒，牛奶測(cè)量試劑盒(β-乳球蛋白))。結(jié)果示于圖9和10。
圖9和10顯示即使使用天然蛋白的抗體，免疫測(cè)定酪蛋白和β-乳球蛋白也可在高濃度離子表面活性劑SDS存在時(shí)令人滿意地完成。
實(shí)施例4測(cè)量蕎麥蛋白、小麥蛋白和花生蛋白(用抗天然蛋白的抗體)離子表面活性劑對(duì)測(cè)量蕎麥蛋白、小麥蛋白(麥醇溶蛋白)和花生蛋白的影響以和實(shí)施例3相同的方式證明?；厥諏?shí)驗(yàn)所用蕎麥蛋白制備如下碾磨蕎麥谷粒，然后用緩沖溶液(Tris-HCl緩沖液等)提取，緩沖溶液含鹽類(lèi)如氯化鈉，然后離心所得提取物以回收其上清，上清應(yīng)用于凝膠過(guò)濾柱SuperdexG-200或Superose6(都由Amersham Pharmacia生產(chǎn))，回收洗脫范圍在70到500kD分子量的部分。
所用小麥蛋白(麥醇溶蛋白)是獲得自Asama Kasei Co.，Ltd.的商業(yè)購(gòu)買(mǎi)產(chǎn)品。花生蛋白制備如下碾磨花生，然后用緩沖溶液(Tris-HCl緩沖液等)提取，緩沖溶液含鹽類(lèi)如氯化鈉，然后離心所得提取物以回收其上清，上清應(yīng)用于凝膠過(guò)濾柱SuperdexG-200或Superose6(都由Amersham Pharmacia生產(chǎn))，回收洗脫范圍在30到100kD分子量的部分作為花生蛋白。用這些樣品的免疫測(cè)定通過(guò)來(lái)自Morinaga Insutitute of Biological Science Co.，Ltd.，的商業(yè)購(gòu)買(mǎi)免疫測(cè)定試劑盒(用于特殊物質(zhì)的Morinaga免疫測(cè)定試劑盒，蕎麥測(cè)量試劑盒；用于特殊物質(zhì)的Morinaga免疫測(cè)定試劑盒，小麥測(cè)量試劑盒(麥醇溶蛋白)；用于特殊物質(zhì)的Morinaga免疫測(cè)定試劑盒，花生測(cè)量試劑盒，任何一種都使用天然蛋白的抗體)。結(jié)果示于圖11到13。
圖11到13顯示在高濃度離子表面活性劑存在時(shí)，免疫測(cè)定蕎麥蛋白、小麥蛋白和花生蛋白可用天然蛋白的抗體令人滿意地完成。
實(shí)施例5制備抗離子表面活性劑-變性蛋白的抗體實(shí)施例1到4顯示在免疫測(cè)定卵類(lèi)粘蛋白、酪蛋白、β-乳球蛋白、蕎麥蛋白、小麥蛋白和花生蛋白中特異抗原-抗體反應(yīng)可在高濃度離子表面活性劑存在時(shí)完成，即使使用抗天然蛋白的抗體，但這種抗原-抗體反應(yīng)不能在卵清蛋白的免疫測(cè)定中完成。因此，用蛋白抗體的方法以下列方式檢測(cè)，蛋白質(zhì)預(yù)先用離子表面活性劑處理變性。
(1)蛋白的變性下列蛋白質(zhì)以0.1到10mg/ml濃度溶解于含1％SDS和1M 2-巰基乙醇的溶液，然后仍在室溫過(guò)夜。
1.卵清蛋白(商品名蛋清蛋白，5x Cryst.(雞)，購(gòu)自Seikagaku Corporation)2.卵類(lèi)粘蛋白(商品名胰蛋白酶抑制劑(來(lái)自雞蛋白)，購(gòu)自Nacalai Tesque)3.花生蛋白以下列方式制備。
1)碾磨花生，然后用緩沖溶液(Tris-HCl緩沖液等)提取，緩沖溶液含鹽類(lèi)如氯化鈉。
2)離心提取物以回收上清。
3)上清應(yīng)用于凝膠過(guò)濾柱SuperdexG-200或Superose6(都由AmershamPharmacia生產(chǎn))，回收洗脫范圍在30到100kD分子量的部分。
4.蕎麥蛋白以下列方式制備。
1)碾磨蕎麥谷粒，然后用緩沖液(Tris-HCl緩沖液等)提取，緩沖液含鹽類(lèi)如氯化鈉。
2)離心提取物以回收上清。
3)上清應(yīng)用于凝膠過(guò)濾柱SuperdexG-200或Superose6(都由AmershamPharmacia生產(chǎn))，回收洗脫范圍在70到500kD分子量的部分。
(2)制備兔多克隆抗體使用弗氏佐劑，如上所述變性的各蛋白質(zhì)被乳化，所得乳劑皮下注射到待免疫的兔。各免疫施用1mg變性蛋白，此施用以1周間隔進(jìn)行5次。最終免疫后1周，收集免疫兔的全血以制備抗血清。從抗血清中制備本發(fā)明抗體根據(jù)下列流程完成。即免疫兔所用變性蛋白經(jīng)共價(jià)鍵固定到樹(shù)脂HiTrapNHS-活化(AmershamPharmacia生產(chǎn))，抗血清應(yīng)用到此固定樹(shù)脂。然后，結(jié)合固定樹(shù)脂上蛋白部分的抗體用0.1M Gly-HCl調(diào)至pH2.7，產(chǎn)生本發(fā)明抗體。
實(shí)施例6通過(guò)抗離子表面活性劑-變性蛋白的抗體的測(cè)量免疫測(cè)定(ELISA)用根據(jù)本發(fā)明的離子表面活性劑-變性蛋白的抗體，在下列規(guī)程基礎(chǔ)上評(píng)估。
1.制備1μg/mL離子表面活性劑-變性蛋白的兔多克隆抗體溶液，如上在碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中。
2.溶液以100μl/孔體積吸入微量滴定板(Nunc生產(chǎn)的微型平板Maxsorp-F8)然后置于環(huán)境溫度中2小時(shí)。
1.固定抗體后，去除抗體溶液，300μl封閉溶液(20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，含150mM NaCl、0.05％吐溫20、0.1％牛血清清蛋白)加入各孔并置于環(huán)境溫度中2小時(shí)。
1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶解于緩沖溶液(PBS，pH6.5)以制備樣品溶液，緩沖溶液含1％SDS和1M 2-巰基乙醇，然后通過(guò)在100℃熱水浴中煮沸加熱1到10分鐘。
2.加熱后，標(biāo)準(zhǔn)蛋白用上面相同的緩沖溶液稀釋至1到64ng/ml。
1.封閉后，各濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液以100μl/孔體積加入抗體-固定的平板，然后在環(huán)境溫度中進(jìn)行靜止反應(yīng)1小時(shí)。
2.反應(yīng)后，各孔用300μl洗滌溶液洗6次，20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.4)中辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體溶液以100μl/孔體積加入，緩沖液含0.1％BSA、150mM NaCl和0.05％吐溫20，然后在環(huán)境溫度中進(jìn)行靜止反應(yīng)30分鐘。
3.各孔用300μl洗滌溶液洗6次，TMB(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)溶液以100μl/孔體積加入，然后在環(huán)境溫度中暗處反應(yīng)10分鐘。
4.100μl 1N硫酸加入各孔以終止反應(yīng)。用微量滴定板讀數(shù)器在450nm主波長(zhǎng)和630nm副波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光度。所示結(jié)果是一式兩份測(cè)量的平均值。
(1)測(cè)量卵清蛋白卵清蛋白不能用天然蛋白的抗體測(cè)量(參見(jiàn)圖3和4)，用根據(jù)本發(fā)明的抗離子表面活性劑-變性蛋白的抗體測(cè)量。測(cè)量結(jié)果示于圖14。在此實(shí)驗(yàn)中，含1％SDS和1M 2-巰基乙醇的緩沖溶液(PBS，pH6.5)中各濃度卵清蛋白溶液在100℃熱水浴中加熱5分鐘，然后冷卻，通過(guò)上述ELISA檢測(cè)。
如從圖14可見(jiàn)，即使在高濃度離子表面活性劑存在時(shí)幾乎不能用天然蛋白的抗體測(cè)量的蛋白質(zhì)可用抗離子表面活性劑-變性蛋白的抗體以很高敏感性測(cè)量。
(2)煮沸樣品溶液的效果顯示使用根據(jù)本發(fā)明的抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體的方法，能通過(guò)預(yù)先煮沸樣品溶液來(lái)顯著改進(jìn)測(cè)量穩(wěn)定性和敏感性。結(jié)果示于圖15到18。
例子顯示測(cè)量結(jié)果，其中各蛋白質(zhì)以64ng/ml濃度溶解于緩沖溶液(PBS，pH6.5)以制備樣品溶液，緩沖溶液含1％SDS和1M 2-巰基乙醇，樣品溶液在100℃熱水浴中加熱5分鐘，然后置于室溫0到6小時(shí)，用根據(jù)本發(fā)明的抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體進(jìn)行ELISA測(cè)量。一方面，參考例顯示測(cè)量結(jié)果，其中使用天然蛋白的抗體，加熱或不加熱樣品溶液，然后用于測(cè)量。結(jié)果表明當(dāng)使用天然蛋白的抗體且不加熱樣品溶液時(shí)，能維持相對(duì)短時(shí)間的高檢測(cè)敏感性，但敏感性隨著時(shí)間減少。進(jìn)一步顯示當(dāng)使用天然蛋白的抗體且加熱樣品溶液時(shí)，檢測(cè)敏感性比開(kāi)始時(shí)顯著減少。
另一方面，顯示當(dāng)使用本發(fā)明的抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體且預(yù)先煮沸樣品溶液時(shí)，維持長(zhǎng)時(shí)間的高檢測(cè)敏感性，測(cè)定可以相當(dāng)高的重復(fù)性和敏感性完成。
(3)測(cè)定敏感性本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選方面中的測(cè)定敏感性示于圖19到22，其中使用抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體結(jié)合煮沸樣品溶液。例子顯示測(cè)量結(jié)果，各蛋白以各種濃度溶解于緩沖溶液(PBS，pH6.5)以制備樣品溶液，緩沖溶液含1％SDS和1M 2-巰基乙醇，樣品溶液在100℃熱水浴中加熱5分鐘，然后冷卻并用ELISA測(cè)量。圖中的參考例顯示測(cè)量結(jié)果，其中使用天然蛋白的抗體且加熱樣品溶液。如從這些圖中可見(jiàn)，本發(fā)明方法有很高的重復(fù)性和敏感性。
工業(yè)可應(yīng)用性通過(guò)使用本發(fā)明的抗離子表面活性劑-變性蛋白抗體，即使在高濃度離子表面活性劑存在時(shí)能令人滿意地完成蛋白質(zhì)的免疫測(cè)定，如實(shí)施例6所特別證明。因此，微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)通過(guò)離子表面活性劑對(duì)溶解蛋白質(zhì)的極佳效果來(lái)溶解/提取，可用免疫測(cè)定直接檢測(cè)，本發(fā)明方法能很有效地用于生命科學(xué)研究和確保食物質(zhì)量，它們需要這種高敏感性檢測(cè)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)樣品中微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)存在的免疫測(cè)定，其特征在于，所述方法包括步驟(1)用含離子表面活性劑的水溶劑提取和/或溶解樣品中微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)，(2)加入抗體，抗體用微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)作為免疫原獲得，蛋白質(zhì)預(yù)先用步驟(1)中所用離子表面活性劑變性a)上面步驟(1)中所得蛋白質(zhì)溶液沒(méi)有顯著稀釋溶液，或b)稀釋?zhuān)渲猩厦娌襟E(1)中所得蛋白質(zhì)溶液稀釋的范圍使離子表面活性劑濃度不降至0.03％(W/V)或更低，從而微溶于水/幾乎不能提取的蛋白質(zhì)和抗體間形成抗原-抗體復(fù)合物，(3)檢測(cè)形成的抗原-抗體復(fù)合物。
2.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定，其特征在于，步驟(1)中水溶劑的離子表面活性劑濃度高于0.3％(W/V)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的測(cè)定，其特征在于，步驟(2)中抗原-抗體復(fù)合物的形成在濃度高于0.3％(W/V)的離子表面活性劑存在時(shí)完成。
4.如權(quán)利要求1到3所述的測(cè)定，其特征在于，離子表面活性劑選自十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鋰、月桂基肌氨酸鈉、溴化十六烷基三甲銨、氯化十六烷基三甲銨、氯化十六烷基吡啶和它們的混合物。
5.如權(quán)利要求4所述的測(cè)定，其特征在于，離子表面活性劑是十二烷基硫酸鈉。
6.如權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)所述的測(cè)定，其特征在于，步驟(1)中的水溶劑進(jìn)一步包括還原劑。
7.如權(quán)利要求6所述的測(cè)定，其特征在于，還原劑是2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇或它們的混合物。
8.如權(quán)利要求7所述的測(cè)定，其特征在于，步驟(1)中的水溶劑包括1％(W/V)十二烷基硫酸鈉和1M 2-巰基乙醇。
9.如權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的測(cè)定，其特征在于，步驟(1)中進(jìn)一步煮沸蛋白質(zhì)溶液。
10.如權(quán)利要求9所述的測(cè)定，其特征在于，煮沸至少在80℃連續(xù)5分鐘。
11.如權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)所述的測(cè)定，其特征在于，蛋白質(zhì)選自卵清蛋白、卵類(lèi)粘蛋白、酪蛋白、β-乳球蛋白、蕎麥蛋白、小麥蛋白和花生蛋白，它們處于幾乎不能提取的狀態(tài)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種方法，其中微溶于水的蛋白質(zhì)或處于幾乎不能提取狀態(tài)的蛋白質(zhì)在隨后的免疫反應(yīng)中敏捷銳且容易檢測(cè)，同時(shí)維持從樣品提取的高效率。揭示了一種高度敏感和容易的免疫測(cè)定，特征是樣品中微溶于水的蛋白質(zhì)或處于幾乎不能提取狀態(tài)的蛋白質(zhì)用水溶劑提取/溶解，水溶劑含相對(duì)高濃度的離子表面活性劑，然后提取物中的蛋白質(zhì)通過(guò)抗蛋白質(zhì)的抗體直接檢測(cè)，蛋白質(zhì)預(yù)先用離子表面活性劑變性。
文檔編號(hào)C07K16/16GK1697973SQ20048000002
公開(kāi)日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2004年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月30日
發(fā)明者村岡嗣朗, 渡邊由美子, 境雅壽, 本莊勉 申請(qǐng)人:森永制果株式會(huì)社