用于從流體樣品中分離細(xì)胞的系統(tǒng)、方法及部件的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于從流體樣品中分離細(xì)胞的系統(tǒng)、方法及部件
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求于2012年5月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/652，690和2012年5月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/652，683的優(yōu)先權(quán)，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。
[0003]背景
1.
技術(shù)領(lǐng)域
[0004]本發(fā)明目前要求保護(hù)的實(shí)施方案的領(lǐng)域涉及用于從流體樣品中分離細(xì)胞的系統(tǒng)、方法及部件。
2.
【背景技術(shù)】
[0005]當(dāng)發(fā)生實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移時(shí)最經(jīng)常導(dǎo)致患者的與癌癥相關(guān)之死亡。然而癌癥轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制在很大程度上仍不為人所知，有相當(dāng)多的證據(jù)表明腫瘤細(xì)胞在惡性進(jìn)展的最早期從原發(fā)性腫瘤塊脫落(Kaiser, J.Medicine.Cancer ' s circulat1n problem.Science327,1072-4 (2010) ；Bernards, R.&ffeinberg, R.A.A progress1n puzzle.Nature 418,823(2002) ；Criscitiello, C., Sotir1u, C.&Ignatiadis, M.Circulating tumor cellsand emerging blood b1markers in breast cancer.Current Opin1n in Oncology 22,552-8(2010))。這些“脫離”的癌細(xì)胞作為轉(zhuǎn)移瘤的細(xì)胞起源進(jìn)入血流并輸送到身體的不同組織(Pantel,K.&BrakenhofT,R.H.Dissecting the metastatic cascade.Nature ReviewsCancer 4,448-56(2004))。從原發(fā)瘤逃脫的細(xì)胞被稱(chēng)為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumor cell, CTC) (Pantel, K.&Alix-Panabieres, C.Circulating tumour cells incancer patients:challenges and perspectives.Trends in Molecular Medicine 16,398-406(2010))。用于確定腫瘤狀態(tài)的黃金標(biāo)準(zhǔn)是通過(guò)對(duì)活組織檢查樣品進(jìn)行的組織病理學(xué)分析。在早期轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)中，難以鑒定活組織檢查的轉(zhuǎn)移/復(fù)發(fā)部位。
[0006]CTC可被認(rèn)為是腫瘤的“液體活組織檢查”，因此提供對(duì)腫瘤細(xì)胞的方便獲取以及對(duì)潛在的致死性轉(zhuǎn)移瘤的較早獲取。然而，CTC的檢測(cè)和表征已經(jīng)因大量血液細(xì)胞(19個(gè)細(xì)胞/mL)中CTC的極低豐度(幾個(gè)至幾百個(gè)/mL)導(dǎo)致了技術(shù)上的挑戰(zhàn)(Racila,E.,Euhus,D., Weiss, A.J., Rao, C, McConnell, J., Terstappen, L.ff.Μ.M.&Uhr, J.ff.Detect1n andcharacterizat1n of carcinoma cells in the blood.Proceedings of the Nat1nalAcademy of Sciences of the United States of America 95,4589-4594 (1998)；Zieglschmid, V., HoIlmann, C.&Bocher, 0.Detect1n of disseminated tumor cellsin peripheral blood.Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 42,155-96 (2005))。已經(jīng)證實(shí)發(fā)現(xiàn)CTC的數(shù)量隨治療期過(guò)程的變化是實(shí)體瘤患者的治療結(jié)果、無(wú)進(jìn)展存活和總體存活的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(Cristofanilli，M.，Budd, G.T.，Ellis,M.J., Stopeck, A., Matera, J., Miller, M.C., Reuben, J.M., Doyle, G.V., Allard, ff.J.,Terstappen, L.ff.&Hayes, D.F.Circulating tumor cells, disease progress1n, andsurvival in metastatic breast cancer.The New England journal of medicine 351，781-91 (2004))。此外，對(duì)見(jiàn)于癌癥患者中的這些CTC進(jìn)行分子分析可獲得可指導(dǎo)癌癥患者之有效治療的關(guān)鍵基因組、蛋白質(zhì)組或代謝物組信息。
[0007]雖然許多技術(shù)可用于固定CTC，但是它們卻不能從非特異性捕獲的白細(xì)胞(WBC)背景分離單個(gè)CTC以用于后續(xù)分子和功能分析(例如，全基因組測(cè)序，RT-PCR)。因此，依然需要改進(jìn)的裝置和方法來(lái)從全血和/或其他體液分離稀有細(xì)胞，例如CTC。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]根據(jù)本發(fā)明之一個(gè)實(shí)施方案的用于從包含多種細(xì)胞類(lèi)型的流體樣品中分離預(yù)選細(xì)胞類(lèi)型的系統(tǒng)，其包含細(xì)胞捕獲流體芯片和芯片保持器(chip holder)，所述保持器配置成用于容納所述細(xì)胞捕獲流體芯片并且維持所述細(xì)胞捕獲流體芯片在運(yùn)行中基本上流體緊密密封。所述芯片保持器還被配置成釋放待從芯片保持器中移出的細(xì)胞捕獲流體芯片以用于進(jìn)一步處理。細(xì)胞捕獲流體芯片包含基底、設(shè)置在所述基底上的激光顯微切割膜和設(shè)置在所述激光顯微切割膜(laser micro-dissect1n membrane)上的通道限定層。所述激光顯微切割膜具有相對(duì)于多種細(xì)胞類(lèi)型中的其他細(xì)胞類(lèi)型適于優(yōu)先捕獲預(yù)選細(xì)胞類(lèi)型的表面。所述通道限定層可從激光顯微切割膜移除來(lái)進(jìn)行細(xì)胞捕獲流體芯片的進(jìn)一步處理。所述細(xì)胞捕獲流體芯片具有適于與流體源相連接的輸入端口和用于排出經(jīng)處理流體的輸出端口，以使得在運(yùn)行中流體樣品從流體源流出并通過(guò)由激光顯微切割膜的至少一部分表面之上的通道限定層所限定的流體通道。根據(jù)本發(fā)明之一個(gè)實(shí)施方案的用于在運(yùn)行中維持細(xì)胞捕獲流體芯片基本上流體緊密密封的芯片保持器，其包含限定凹陷區(qū)的基礎(chǔ)部件以使所述細(xì)胞捕獲流體芯片容納其中；壓力部件，其被配置成放置于細(xì)胞捕獲流體芯片之上；以及夾具組件(clamp assembly),其被配置成用于將所述基礎(chǔ)部件和所述壓力部件夾在一起從而在操作期間維持基本上流體緊密密封。所述夾具組件被進(jìn)一步配置成松開(kāi)以釋放細(xì)胞捕獲流體芯片從而從芯片保持器中移出。
[0009]根據(jù)本發(fā)明之一個(gè)實(shí)施方案的用于從包含多種細(xì)胞類(lèi)型的流體樣品中捕獲預(yù)選細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞捕獲流體芯片，其包含基底、設(shè)置在所述基底上的激光顯微切割膜和設(shè)置在所述激光顯微切割膜上的通道限定層。所述激光顯微切割膜具有相對(duì)于多種細(xì)胞類(lèi)型中的其他細(xì)胞類(lèi)型適于優(yōu)先捕獲預(yù)選細(xì)胞類(lèi)型的表面。所述通道限定層能從激光顯微切割膜上移除以用于進(jìn)一步處理細(xì)胞捕獲流體芯片，并且所述細(xì)胞捕獲流體芯片具有適于與流體源相連接的輸入端口和用于排出經(jīng)處理流體的輸出端口，以使得在運(yùn)行中流體樣品從流體源流出并通過(guò)由激光顯微切割膜的至少一部分表面之上的通道限定層所限定的流體通道。
[0010]根據(jù)本發(fā)明之一個(gè)實(shí)施方案的用于從包含多種細(xì)胞類(lèi)型的流體樣品分離預(yù)選細(xì)胞類(lèi)型的方法，包括提供細(xì)胞捕獲流體芯片，所述細(xì)胞捕獲流體芯片包含基底、設(shè)置在所述基底上的激光顯微切割膜和設(shè)置在所述激光顯微切割膜上的通道限定層。所述激光顯微切割膜具有相對(duì)于多種細(xì)胞類(lèi)型中的其他細(xì)胞類(lèi)型適于優(yōu)先捕獲預(yù)選細(xì)胞類(lèi)型的表面。所述方法還包括提供流體樣品，使得其流動(dòng)通過(guò)由激光顯微切割膜的至少部分表面之上的通道限定層所限定的流體通道以從流體樣品中捕獲預(yù)選細(xì)胞類(lèi)型，在提供流體樣品后，從細(xì)胞捕獲流體芯片的基底和激光顯微切割膜上移除通道限定層，以及在移除通道限定層后，在細(xì)胞捕獲流體芯片的基底和激光顯微切割膜上進(jìn)行激光顯微切割以從流體樣品中收集捕獲的預(yù)選細(xì)胞類(lèi)型。
【附圖說(shuō)明】
[0011 ] 在考慮說(shuō)明書(shū)、附圖和實(shí)施例的情況下，其他目的和優(yōu)點(diǎn)將變得明顯。
[0012]圖1示出根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案用于從具有多種細(xì)胞類(lèi)型的流體樣品分離預(yù)選細(xì)胞類(lèi)型的系統(tǒng)。
[0013]圖2A、圖2B和圖2C分別示出圖1系統(tǒng)的透視圖、正視圖和俯視圖。
[0014]圖3是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的細(xì)胞捕獲流體芯片的示意圖。
[0015]圖4A是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的芯片保持器的圖示。
[0016]圖4B是圖4A的芯片保持器的另一個(gè)圖示，但處于準(zhǔn)備好加載細(xì)胞捕獲流體芯片的配置。
[0017]圖5A至圖5C示出芯片保持器的一些替代實(shí)施方案。
[0018]圖6A至圖6G輔助說(shuō)明了本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施例。a)流過(guò)Nano VelcroCTC芯片的血液樣品。b)所述裝置包含覆蓋微流體混沌混合器和透明Nano Velcro基底(通過(guò)將靜電紡絲PLGA納米纖維沉積在LMD載玻片上制得)。c) SEM圖像示出水平壓縮的超長(zhǎng)PLGA納米纖維的形態(tài)(直徑為約10nm)。d)可將具有固定的CTC的透明Nano Velcro基底與激光顯微切割或激光捕獲激光顯微切割儀器相連接用于單個(gè)細(xì)胞分離。e)具有從采集自轉(zhuǎn)移性癌癥患者的ImL血液分離的45個(gè)CTC的Nano Velcro CTC芯片。f)固定在透明Nano Velcro基底上的CTC。g)通過(guò)使用LMD技術(shù)，在分割的基底上分離單個(gè)CTC(插圖)。
[0019]圖7為概述以下的示意圖:a)用于在嵌入透明Nano Velcro基底中的PLGA納米纖維上引入鏈親和素涂層的共價(jià)綴合方法；以及b)用于將抗生物污損的PEG基團(tuán)引入在NanoVelcro基底上的替代表面改性方法，從而抑制WBC的非特異性捕獲并且增強(qiáng)Nano Velcro基底的穩(wěn)定性以用于長(zhǎng)期儲(chǔ)存和便利運(yùn)輸。
[0020]圖8A示出根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案從患黑素瘤患者的血液樣品捕獲并分離單個(gè)CTC和WBC。在PCR擴(kuò)增后，檢測(cè)到內(nèi)含子中BRAFvkicie突變和NRAS缺失(NRAS外顯子2的3'端37bp ;核苷酸CCCT缺失)。此處采用WBC作為對(duì)照樣品(野生型)。
[0021]圖8B示出使