專利名稱：成人睪丸支持細(xì)胞-胰島復(fù)合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明設(shè)計(jì)一種成人胰島移植復(fù)合物的制備方法。
背景技術(shù)：
胰島移植已經(jīng)成為最有希望治愈I型糖尿病的方法，供體短缺和移植物丟失限制了其廣泛應(yīng)用。胰島分離純化過(guò)程中破壞了其內(nèi)部的微循環(huán)系統(tǒng)，導(dǎo)致移植后無(wú)法像胰腺移植那樣立即恢復(fù)血運(yùn)，而是需要相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間重建血運(yùn)系統(tǒng)，從而造成的營(yíng)養(yǎng)缺乏損傷。此外，免疫排斥反應(yīng)仍是困擾胰島移植臨床廣泛開(kāi)展的重要問(wèn)題，采用具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞誘導(dǎo)胰島移植的免疫耐受成為較理想的方法。

發(fā)明內(nèi)容
睪丸支持細(xì)胞(Sertoli cells)同時(shí)具有營(yíng)養(yǎng)支持和免疫調(diào)節(jié)功能。在改良成人胰島分離純化的基礎(chǔ)上，采用睪丸支持細(xì)胞包被體外構(gòu)建胰島-睪丸支持細(xì)胞復(fù)合物，利用睪丸支持細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)支持 作用，延長(zhǎng)胰島體外存活時(shí)間，同時(shí)利用其免疫調(diào)節(jié)功能，抑制排斥反應(yīng)。從減輕胰島缺血缺氧的時(shí)間和抑制排斥反應(yīng)兩個(gè)環(huán)節(jié)上減少胰島移植物的丟失，提高其生存率。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
成人睪丸支持細(xì)胞-胰島復(fù)合物的制備方法，其特征在于，包含如下步驟，
睪丸支持細(xì)胞的分離純化采用兩步消化法分離純化睪丸支持細(xì)胞；
成人胰島的分離純化采用半自動(dòng)灌注過(guò)濾法用1.5 g/L的膠原酶V，本處可以參考李楊、薛武軍、宋煥瑾等.成人睪丸支持細(xì)胞分離方法的建立及在胰島移植中的應(yīng)用.細(xì)胞與分析免疫學(xué)雜志，2010,26 (6) :552-559 ;消化胰腺，采用自動(dòng)細(xì)胞淘洗儀(型號(hào)Cobe2991)，通過(guò)連續(xù)密度梯度離心的方法進(jìn)行胰島的純化，分離和純化的胰島懸浮于含100 ml/L胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基，于37°C、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
睪丸支持細(xì)胞-胰島復(fù)合物的建立首先將睪丸支持細(xì)胞消化，采用PKH-67對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記；紅色熒光細(xì)胞表面交聯(lián)劑(PKH-26)標(biāo)記的睪丸支持細(xì)胞與胰島混合成細(xì)胞懸液O. 5毫升，置于細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)管培養(yǎng)2小時(shí)，隨后轉(zhuǎn)移肝素處理的低吸附培養(yǎng)皿中，加入含100g/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基3 ml培養(yǎng)，使睪丸支持細(xì)胞附著于胰島表面。本發(fā)明進(jìn)一步技術(shù)方案在于在于，所述步驟睪丸支持細(xì)胞的分離純化的兩步消化法為，第一步2. 5 g/L胰蛋白酶、O. 4 g/L DNA酶I，本處可以參考李楊、薛武軍、宋煥瑾等.成人睪丸支持細(xì)胞分離方法的建立及在胰島移植中的應(yīng)用.細(xì)胞與分析免疫學(xué)雜志，2010,26 (6) :552-559 ;于 37°C 消化 30min，第二步 5 g/LU g/L 透明質(zhì)酸酶 37°C 消化20min ;將消化好的細(xì)胞接種于50ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于39°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，用20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7. 2)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行2. 5 min的低滲處理，DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌3次，最后采用含100 g/L FBS的RPMI1640的培養(yǎng)基于37°C、50mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本發(fā)明進(jìn)一步技術(shù)方案在于在于，包含如下步驟，
睪丸支持細(xì)胞的分離純化；用4°C的Hank’ s液沖洗睪丸，去除被膜及血管，置于2. 5g/L胰蛋白酶、O. 4 g/L DNA酶I于37°C恒溫水浴箱消化30 min，含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，離心去上清，5 g/L膠原酶V、1 g/L透明質(zhì)酸酶于37°C恒溫水浴箱中消化20 min，含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，100目的篩網(wǎng)過(guò)濾后，無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌3次后，離心去上清，所得的沉淀物均重懸于含200 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，于39°C、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)，更換培養(yǎng)液，于39°C、50 mL/L 0)2繼續(xù)孵育8小時(shí)后，更換無(wú)血清的培養(yǎng)液，20 mmol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH 7. O)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行5 min的低滲處理，最后采用含100 g/LFBS的RPMI1640的培養(yǎng)基于37°C、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，在睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中于倒置顯微鏡鏡下觀察計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，取細(xì)胞制作細(xì)胞爬片，經(jīng)波形蛋白免疫組化染色，通過(guò)觀察波形蛋白表達(dá)鑒定睪丸支持細(xì)胞；
成人胰島的分離純化；成人胰腺采用冷凝系統(tǒng)將消化液降至4°C，以150 mLmin的流量連續(xù)灌注10 min，然后將采用熱交換器，將管路溫度上升至34°C，以150 ml/min的流量連續(xù)灌注5 min，灌注消化液配 方1. 5 mg/L膠原酶NBl消化液含有共3. 5萬(wàn)U的烏司他丁和2000 U的DNA酶I共350 ml ;胰腺消化將胰腺放入消化罐中，上下分別接硅膠管形成循環(huán)的環(huán)路，保持溫度迅速提升并穩(wěn)定在34°C，開(kāi)始消化胰腺，自消化開(kāi)始Smin時(shí)，每min吸取I ml消化系統(tǒng)中的液體，滴入DTZ染色于顯微鏡下觀察胰島游離的情況和腺泡松散的程度，且觀察到50%的游離胰島時(shí)，可終止消化；胰島收集迅速降低循環(huán)系統(tǒng)中消化液的溫度，接取流出的消化液，以IL為一瓶，每一瓶添加不同量的稀釋液和胎牛血清，接取的消化液也不相同，觀察出口端流出的液體，待其變的清涼后，停止補(bǔ)充液體，將收集到的液體分裝至無(wú)菌的250 ml離心管，并放至低溫離心機(jī)中于4°C，140 g離心I min，取出小心棄去上清液，再加入胰島洗滌液后，輕微震蕩均勻后在進(jìn)行上述離心，反復(fù)洗滌三次；胰島純化洗滌收集的胰島組首先溶解在UW器官保存混勻放置30 min以上，將最終收集的組織離心后棄去上清，沉淀物分成20 ml的等份，每一份加入U(xiǎn)W液，定容至200 ml，啟動(dòng)Cobe2991細(xì)胞淘洗儀，依次導(dǎo)入密度為1. 100的淋巴細(xì)胞分離液液130ml、130 ml，密度為1. 070的淋巴細(xì)胞分離液130毫升、燒杯中導(dǎo)入胰島/UW混合液，使其充分混勻，離心5 min,依次收集8瓶產(chǎn)物，棄去上清液，用冰洗滌液，4 °C, 280 g離心I min，重復(fù)2遍，洗滌期間可根據(jù)取樣檢測(cè)結(jié)果，將純度相近的離心管合并，分離純化的胰島大約每20000胰島當(dāng)量(IEQ)的胰島飼養(yǎng)于I個(gè)面積為175 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，添加30 ml CMRL1066培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件均為于37°C、5%的CO2，每日全量更換培養(yǎng)基；胰島觀察在胰島培養(yǎng)過(guò)程中的吸出少量胰島懸濁液置于培養(yǎng)皿中，經(jīng)DTZ染色后，倒置顯微鏡鏡下觀察計(jì)算胰島數(shù)量，經(jīng)AO-PI染色經(jīng)熒光顯微鏡下觀察，計(jì)算胰島活性；
睪丸支持細(xì)胞-胰島復(fù)合物的建立將培養(yǎng)的睪丸支持細(xì)胞用2. 5 g/L胰酶(含O. 2 g/L乙二胺四乙酸)消化，用含100 g/L小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化收集2 X IO7睪丸支持細(xì)胞，PBS洗一遍,然后1000 r/min離心5 min,棄去上清液,加入I ml PKH-67試劑盒中的緩沖液重懸細(xì)胞，另取Iml緩沖液稀釋O. 4 μ I熒光標(biāo)記液，I ml細(xì)胞懸液與I ml熒光標(biāo)記液混合，吹打均勻，于25°C下顛倒混勻2-5min，加入小牛血清2 ml終止標(biāo)記，混勻放置I min,再加4 ml RPM1-1640培養(yǎng)基,混勻后1000 r/min離心10 min，更換離心管，10ml培養(yǎng)液洗滌3次，每次10 min，最后將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，將分離純化收集的1000 IEQ胰島和5X IO5的PKH-26標(biāo)記睪丸支持細(xì)胞加入肝素處理的4 ml細(xì)胞培養(yǎng)管內(nèi)，加入不超過(guò)O. 5 ml RPMI1640培養(yǎng)基(含100 g/L FBS)中制成懸濁液，然后在37°C中共同孵育2 hr,孵育期間將胰島與睪丸支持細(xì)胞輕輕混合一次，然后移至低吸附預(yù)處理的6孔板中，加入含100 g/L FBS的RPMI1640培養(yǎng)基3 ml繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)DTZ染色，于倒置像差顯微鏡下觀察復(fù)合物構(gòu)建情況，收集復(fù)合物經(jīng)胰島素-波形蛋白免疫組化雙染，通過(guò)觀察波胰島素和形蛋白染色分布鑒定睪丸支持細(xì)胞是否附著于胰島表面構(gòu)成復(fù)合物。成人睪丸支持細(xì)胞-胰島復(fù)合物，其特征在于，該復(fù)合物含有睪丸支持細(xì)胞，它與胰島細(xì)胞共培養(yǎng)后，結(jié)合于胰島細(xì)胞表面，與胰島細(xì)胞形成復(fù)合物，該復(fù)合物的形態(tài)學(xué)特征是胰島表面結(jié)合有大量多角形、有突起的睪丸支持細(xì)胞，該復(fù)合物既有分泌胰島素的功能，同時(shí)具有分泌營(yíng)養(yǎng)支持和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的功能。本發(fā)明通過(guò)特定的培養(yǎng)方法和條件，將睪丸細(xì)胞附著于胰島表面，兩種獨(dú)立的細(xì)胞整合成一種細(xì)胞復(fù)合物，通過(guò)發(fā)揮睪丸支持細(xì)胞的特性，改善胰島營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)和抑制排斥反應(yīng)。采用如上技術(shù)方案的本發(fā)明，具有如下有益效果本發(fā)明利用睪丸支持細(xì)胞包被技術(shù)建立睪丸支持細(xì)胞-胰島復(fù)合物，利用支持細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)支持細(xì)胞延長(zhǎng)胰島存活時(shí)間，改善胰島的活性和功能，同時(shí)利用睪丸支持細(xì)胞的免疫抑制作用抑制免疫應(yīng)答，抑制排斥反應(yīng)。從減輕胰島缺血缺氧的時(shí)間和抑制排斥反應(yīng)兩個(gè)環(huán)節(jié)上減少胰島移植物的丟失，提高其生存率，從而達(dá)到提高胰島移植效果的目的，并為以后治療糖尿病奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。


圖1是本發(fā)明中分離純化成人胰島的DTZ染色200倍光鏡觀察圖2是本發(fā)明中分 離純化成人胰島的AO-PI染色倍光鏡觀察圖3是分離純化的成人睪丸支持細(xì)胞200倍倒置像差顯微鏡觀察圖4是成人睪丸支持細(xì)胞的波形蛋白免疫組化染色200倍光鏡觀圖5是成人睪丸支持細(xì)胞-胰島復(fù)合物的200倍倒置像差顯微鏡觀察圖6是成人睪丸支持細(xì)胞-胰島復(fù)合物胰島素-波形蛋白雙染色200倍光鏡觀圖。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的說(shuō)明。步驟一成人睪丸支持細(xì)胞分離、純化、培養(yǎng)。用4°C的Hank’ s液沖洗睪丸，去除被膜及血管，再以眼科鑷挑出生精小管，盡量剝除生精小管周圍的間質(zhì)組織并剪碎，將睪丸組織置于2. 5 g/L胰蛋白酶、O. 4 g/L DNA酶I于37°C恒溫水浴箱消化30 min，含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，離心去上清，5 g/L膠原酶V、1 g/L透明質(zhì)酸酶于37°C恒溫水浴箱中消化20 min，含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，100目的篩網(wǎng)過(guò)濾后，無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌3次后，離心去上清。所得的沉淀物均重懸于含200 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，于39°C、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h。更換培養(yǎng)液，于相同條件下繼續(xù)孵育8 h后，更換無(wú)血清的培養(yǎng)液。20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 7. O)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行5 min的低滲處理，最后采用含100 g/L FBS的RPMI1640的培養(yǎng)基于37°C、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。在睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中于倒置顯微鏡鏡下觀察計(jì)算細(xì)胞數(shù)量(如圖3所示)，取細(xì)胞制作細(xì)胞爬片，經(jīng)波形蛋白免疫組化染色(如圖4所示)，鑒定睪丸支持細(xì)胞。步驟二 成人胰島分離純化及培養(yǎng)。①胰腺灌注采用冷凝系統(tǒng)將消化液降至4°C，以150 ml/min的流量連續(xù)灌注10 min，然后將采用熱交換器，將管路溫度上升至34°C,以150 ml/min的流量連續(xù)灌注5 min。灌注消化液配方1. 5 mg/L膠原酶NBl消化液含有共3. 5萬(wàn)U的烏司他丁和2000 U的DNA酶I共350 ml。②胰腺消化將胰腺組織放入消化罐中，上下分別接硅膠管形成循環(huán)的環(huán)路，保持溫度迅速提升并穩(wěn)定在34°C，開(kāi)始消化胰腺，自消化開(kāi)始8分鐘時(shí)，每分鐘吸取I ml消化系統(tǒng)中的液體，滴入DTZ染色于顯微鏡下觀察胰島游離的情況和腺泡松散的程度，且觀察到50%的游離胰島時(shí)，可終止消化。④胰島收集迅速降低循環(huán)系統(tǒng)中消化液的溫度，接取流出的消化液，以IL為一瓶，每一瓶添加不同量的稀釋液和胎牛血清，接取的消化液也不相同。觀察出口端流出的液體，待其變的清涼后，停止補(bǔ)充液體。將收集到的液體分裝至無(wú)菌的250 ml離心管，并放至低溫離心機(jī)中于4°C，140 g離心I min，取出小心棄去上清液，再加入胰島洗滌液后，輕微震蕩均勻后在進(jìn)行上述離心，反復(fù)洗滌三次。⑤胰島純化洗滌收集的胰島組首先溶解在UW器官保存混勻放置30 min以上。將最終收集的組織離心后棄去上清，沉淀物分成20 ml的等份，每一份加入U(xiǎn)W液，定容至200 ml。啟動(dòng)Cobe2991細(xì)胞淘洗儀，依次導(dǎo)入密度為1. 100的淋巴細(xì)胞分離液液130ml、130 ml，密度為1. 070的淋巴細(xì)胞分離液130毫升、燒杯中導(dǎo)入胰島/UW混合液，使其充分混勻，離心5 min。依次收集8瓶產(chǎn)物，棄去上清液，用冰洗滌液，4 V，280g離心I min，重復(fù)2遍。洗滌期間可根據(jù)取樣檢測(cè)結(jié)果，將純度相近的離心管合并。分離純化的胰島采用CMRL1066無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)添加了青-鏈霉素雙抗生素液。大約每20000胰島當(dāng)量(IEQ)的胰島飼養(yǎng)于I個(gè)175 cm2，添加30 ml培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)條件均為于37°C、5%的CO2，每日全量更換培養(yǎng)基。⑥胰島觀察在胰島培養(yǎng)過(guò)程中的吸出少量胰島懸濁液置于培養(yǎng)皿中，經(jīng)DTZ染色后，倒置顯微鏡鏡下觀察計(jì)算胰島數(shù)量(如圖1所示)，經(jīng)AO-PI染色經(jīng)熒光顯微鏡下觀 察(如圖2所示)，計(jì)算胰島活性。步驟三睪丸支持細(xì)胞-胰島復(fù)合物的建立將培養(yǎng)的睪丸支持細(xì)胞用2. 5 g/L胰酶(含O. 2 g/L EDTA)消化，用含100 g/L小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化收集2 X IO7睪丸支持細(xì)胞，PBS洗一遍。然后1000 r/min離心5 min，其上清是總體積小于25 μ L·加入I ml PKH-67試劑盒中的C液重懸細(xì)胞。另取Iml C液稀釋O. 4 μ I熒光標(biāo)記液。I ml細(xì)胞懸液與I ml熒光標(biāo)記液混合，吹打均勻。于25°C下顛倒混勻2-5分鐘。加入小牛血清2 ml終止標(biāo)記，混勻放置I min，再加4 ml RPM1-1640培養(yǎng)基，混勻后1000 r/min離心10min。更換離心管，10 ml培養(yǎng)液洗滌3次，每次10 min，最后將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。將分離純化收集的1000 IEQ胰島和5 X IO5的PKH-26標(biāo)記睪丸支持細(xì)胞加入肝素處理的4 ml細(xì)胞培養(yǎng)管內(nèi)，加入不超過(guò)O. 5 ml RPMI1640培養(yǎng)基(含100 g/L FBS)中制成懸濁液，然后在37°C中共同孵育2 hr,孵育期間將胰島與睪丸支持細(xì)胞輕輕混合一次，然后移至低吸附預(yù)處理的6孔板中，加入含100 g/L FBS的RPMI1640培養(yǎng)基3 ml繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)DTZ染色，于倒置像差顯微鏡下觀察復(fù)合物構(gòu)建情況(如圖5所示)，收集復(fù)合物經(jīng)胰島素-波形蛋白免疫組化雙染(如圖6所示)，鑒定復(fù)合物。
經(jīng)過(guò)分析和鑒定，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明具有如下突出效果
該復(fù)合物包含睪丸支持細(xì)胞和胰島細(xì)胞兩種類型的細(xì)胞，復(fù)合物內(nèi)部為胰島細(xì)胞，表面結(jié)合睪丸支持細(xì)胞。該復(fù)合物既有分泌胰島素的功能，同時(shí)具有分泌營(yíng)養(yǎng)支持和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的功能。同現(xiàn)有技術(shù)項(xiàng)目，該復(fù)合物在移植時(shí)能有效改善移植物缺血缺氧狀態(tài)，同時(shí)抑制排斥反應(yīng)，從而延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間。同時(shí)該制備方法操作簡(jiǎn)便，成功率高。本發(fā)明可以采用細(xì)胞培養(yǎng)的方法進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)，重現(xiàn)性百分之百，可以解決目前的技術(shù)難題。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該了解本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的 范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.成人睪丸支持細(xì)胞-胰島復(fù)合物的制備方法，其特征在于，包含如下步驟，睪丸支持細(xì)胞的分離純化采用兩步消化法分離純化睪丸支持細(xì)胞；成人胰島的分離純化采用半自動(dòng)灌注過(guò)濾法用1. 5 g/L的膠原酶V，消化胰腺，采用自動(dòng)細(xì)胞淘洗儀(型號(hào)Cobe2991)，通過(guò)連續(xù)密度梯度離心的方法進(jìn)行胰島的純化，分離和純化的胰島懸浮于含100 ml/L胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基，于37°C、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；睪丸支持細(xì)胞-胰島復(fù)合物的建立首先將睪丸支持細(xì)胞消化，采用PKH-67對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記；紅色熒光細(xì)胞表面交聯(lián)劑(PKH-26)標(biāo)記的睪丸支持細(xì)胞與胰島混合成細(xì)胞懸液O. 5毫升，置于細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)管培養(yǎng)2小時(shí)，隨后轉(zhuǎn)移肝素處理的低吸附培養(yǎng)皿中，加入含100g/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基3 ml培養(yǎng)，使睪丸支持細(xì)胞附著于胰島表面。
2.如權(quán)利要求1所述的成人睪丸支持細(xì)胞-胰島復(fù)合物的制備方法，其特征在于，所述步驟睪丸支持細(xì)胞的分離純化的兩步消化法為，第一步2. 5 g/L胰蛋白酶、O. 4 g/L DNA酶I，于37°C消化30min，第二步5 g/L膠原酶V、1 g/L透明質(zhì)酸酶37°C消化20min ;將消化好的細(xì)胞接種于50ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于39°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，用20mmoI/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7. 2)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行2. 5 min的低滲處理，DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌3次，最后采用含100 g/L FBS的RPMI1640的培養(yǎng)基于37°C、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求1所述的成人睪丸支持細(xì)胞-胰島復(fù)合物的制備方法，其特征在于，包含如下步驟，睪丸支持細(xì)胞的分離純化；用4°C的Hank’ s液沖洗睪丸，去除被膜及血管，置于2. 5g/L胰蛋白酶、O. 4 g/L DNA酶I于37°C恒溫水浴箱消化30 min，含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，離心去上清，5 g/L膠原酶V、1 g/L透明質(zhì)酸酶于37°C恒溫水浴箱中消化20 min，含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，100目的篩網(wǎng)過(guò)濾后，無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌3次后，離心去上清，所得的沉淀物均重懸于含200 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，于39°C、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)，更換培養(yǎng)液，于39°C、50 mL/L 0)2繼續(xù)孵育8小時(shí)后，更換無(wú)血清的培養(yǎng)液，20 mmol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH 7. O)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行5 min的低滲處理，最后采用含100 g/LFBS的RPMI1640的培養(yǎng)基于37°C、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，在睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中于倒置顯微鏡鏡下觀察計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，取細(xì)胞制作細(xì)胞爬片，經(jīng)波形蛋白免疫組化染色，通過(guò)觀察波形蛋白表達(dá)鑒定睪丸支持細(xì)胞；成人胰島的分離純化；成人胰腺采用冷凝系統(tǒng)將消化液降至4°C，以150 mLmin的流量連續(xù)灌注10 min，然后將采用熱交換器，將管路溫度上升至34°C，以150 ml/min的流量連續(xù)灌注5 min，灌注消化液配方1.5 mg/L膠原酶NBl消化液含有共3. 5萬(wàn)U的烏司他丁和`2000 U的DNA酶I共350 ml ;胰腺消化將胰腺放入消化罐中，上下分別接硅膠管形成循環(huán)的環(huán)路，保持溫度迅速提升并穩(wěn)定在34°C，開(kāi)始消化胰腺，自消化開(kāi)始Smin時(shí)，每min吸取I ml消化系統(tǒng)中的液體，滴入DTZ染色于顯微鏡下觀察胰島游離的情況和腺泡松散的程度，且觀察到50%的游離胰島時(shí)，可終止消化；胰島收集迅速降低循環(huán)系統(tǒng)中消化液的溫度，接取流出的消化液，以IL為一瓶，每一瓶添加不同量的稀釋液和胎牛血清，接取的消化液也不相同，觀察出口端流出的液體，待其變的清涼后，停止補(bǔ)充液體，將收集到的液體分裝至無(wú)菌的250 ml離心管，并放至低溫離心機(jī)中于4°C，140 g離心I min，取出小心棄去上清液，再加入胰島洗滌液后，輕微震蕩均勻后在進(jìn)行上述離心，反復(fù)洗滌三次；胰島純化:洗滌收集的胰島組首先溶解在UW器官保存混勻放置30 min以上，將最終收集的組織離心后棄去上清，沉淀物分成20 ml的等份，每一份加入U(xiǎn)W液，定容至200 ml，啟動(dòng)Cobe2991細(xì)胞淘洗儀，依次導(dǎo)入密度為1. 100的淋巴細(xì)胞分離液液130ml、130 ml，密度為1. 070的淋巴細(xì)胞分離液130毫升、燒杯中導(dǎo)入胰島/UW混合液，使其充分混勻，離心5 min,依次收集8瓶產(chǎn)物，棄去上清液，用冰洗滌液，4 °C, 280 g離心I min，重復(fù)2遍，洗滌期間可根據(jù)取樣檢測(cè)結(jié)果，將純度相近的離心管合并，分離純化的胰島大約每20000胰島當(dāng)量(IEQ)的胰島飼養(yǎng)于I個(gè)面積為175 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，添加30 ml CMRL1066培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件均為于37°C、5%的CO2，每日全量更換培養(yǎng)基；胰島觀察在胰島培養(yǎng)過(guò)程中的吸出少量胰島懸濁液置于培養(yǎng)皿中，經(jīng)DTZ染色后，倒置顯微鏡鏡下觀察計(jì)算胰島數(shù)量，經(jīng)AO-PI染色經(jīng)熒光顯微鏡下觀察，計(jì)算胰島活性；睪丸支持細(xì)胞-胰島復(fù)合物的建立將培養(yǎng)的睪丸支持細(xì)胞用2. 5 g/L胰酶(含O. 2 g/L乙二胺四乙酸)消化，用含100 g/L小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化收集2 X IO7睪丸支持細(xì)胞，PBS洗一遍,然后1000 r/min離心5 min,棄去上清液,加入I ml PKH-67試劑盒中的緩沖液重懸細(xì)胞，另取Iml緩沖液稀釋O. 4 μ I熒光標(biāo)記液，I ml細(xì)胞懸液與I ml熒光標(biāo)記液混合，吹打均勻，于25°C下顛倒混勻2-5min，加入小牛血清2 ml終止標(biāo)記，混勻放置I min,再加4 ml RPM1-1640培養(yǎng)基,混勻后1000 r/min離心10 min，更換離心管，10ml培養(yǎng)液洗滌3次，每次10 min，最后將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，將分離純化收集的1000 IEQ胰島和5X IO5的PKH-26標(biāo)記睪丸支持細(xì)胞加入肝素處理的4 ml細(xì)胞培養(yǎng)管內(nèi)，加入不超過(guò)O. 5 ml RPMI1640培養(yǎng)基(含100 g/L FBS)中制成懸濁液，然后在37°C中共同孵育2 hr,孵育期間將胰島與睪丸支持細(xì)胞輕輕混合一次，然后移至低吸附預(yù)處理的6孔板中，加入含100 g/L FBS的RPMI1640培養(yǎng)基3 ml繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)DTZ染色，于倒置像差顯微鏡下觀察復(fù)合物構(gòu)建情況，收集復(fù)合物經(jīng)胰島素-波形蛋白免疫組化雙染，通過(guò)觀察波胰島素和形蛋白染色分布鑒定睪丸支持細(xì)胞是否附著于胰島表面構(gòu)成復(fù)合物。
4.成人睪丸支持細(xì)胞-胰島復(fù)合物，其特征在于，該復(fù)合物含有睪丸支持細(xì)胞，它與胰島細(xì)胞共培養(yǎng)后，結(jié)合于胰島細(xì)胞表面，與胰島細(xì)胞形成復(fù)合物，該復(fù)合物的形態(tài)學(xué)特征是胰島表面結(jié)合有大量多角形、有突起的睪丸支持細(xì)胞，該復(fù)合物既有分泌胰島素的功能，同時(shí)具有分泌營(yíng)養(yǎng)支持和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的功能。
全文摘要
本發(fā)明為成人胰島-睪丸支持細(xì)胞復(fù)合物及其制備方法，解決了目前分離純化的胰島在移植后引缺血缺氧以及免疫排斥反應(yīng)的而喪失功能，導(dǎo)致移植物失功，影響胰島移植效果的難題。制備方法一、采用半自動(dòng)灌注及連續(xù)密度梯度法分離純化成人胰島。二、采用兩步消化法分離純化成人睪丸支持細(xì)胞。三、采用特定的共培養(yǎng)方法構(gòu)建胰島-睪丸支持細(xì)胞復(fù)合物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是將胰島細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞偶聯(lián)成復(fù)合物作為移植物，使睪丸支持細(xì)胞附著于胰島表面，改善胰島的營(yíng)養(yǎng)狀況，抑制排斥反應(yīng)，提高胰島其的存活率，具有操作簡(jiǎn)便、成功率高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/071GK103054903SQ201310013000
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月15日
發(fā)明者李楊, 薛武軍, 丁小明, 馮新順, 田小輝, 田普訓(xùn), 丁晨光 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院