專利名稱：一種新生豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)基及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新生豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)基及其使用方法。
背景技術(shù)：
目前的豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)體系就是從動(dòng)物體中取出胰腺分離出胰島細(xì)胞，并將其培養(yǎng)于CMRL1066，RPMI等培養(yǎng)基內(nèi)維持其生長(zhǎng)或誘導(dǎo)其定向分化的過程，培養(yǎng)的胰島細(xì)胞一般用于移植手術(shù)治療糖尿病?，F(xiàn)今有多種新生豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)方法，一般采用1-5天的新生豬，解剖取胰腺，破碎后用膠原酶消化成細(xì)胞團(tuán)，置于細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-5天，但純化獲得的有活性功能胰島細(xì)胞的量各不相同(2000IEQ/g-4000IEQ/g)，培養(yǎng)胰島細(xì)胞的純度也各有差別(70-90%)。胰島細(xì)胞即使在低溫培養(yǎng)中也會(huì)因細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生丟失，尤其是β 細(xì)胞，并且培養(yǎng)過程長(zhǎng)短難于選擇，培養(yǎng)時(shí)間短則β細(xì)胞不能發(fā)育成熟，培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)則會(huì)有大量胰島細(xì)胞因凋亡產(chǎn)生丟失，一般回收率只有60%左右，且由于β細(xì)胞凋亡使得同等量胰島細(xì)胞胰島素分泌量減少(insulin/DNA值為49. 00 ± I. 95mIU/g)。培養(yǎng)過程難于清除污染，易于給后續(xù)的移植過程帶來炎癥反應(yīng)。現(xiàn)今沒有能大量提供高純度有活性并且穩(wěn)定產(chǎn)量的胰島細(xì)胞培養(yǎng)方法，所以如何通過建立優(yōu)化的培養(yǎng)基成分以及培養(yǎng)方式成為胰島細(xì)胞培養(yǎng)最迫切的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在建立一種改良的能大量提供有活性并且有穩(wěn)定產(chǎn)量的新生豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)體系。本發(fā)明的新生豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)基為，向HAM’ S/F-10培養(yǎng)基中添加細(xì)胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMK 10微摩爾 50微摩爾，占培養(yǎng)基體積百分比15% 25%的人血白蛋白和占培養(yǎng)基體積百分比為5% 15%豬血清，以及每升培養(yǎng)基中加入6 IOmmol的丙酮酸鈉。優(yōu)選的是人血白蛋白為20% ;所述的豬血清為10%，所述的丙酮酸鋼為8mmol。本發(fā)明使用過程是，室溫?zé)o菌條件下，將已分離純化的(5000 10000IEQ)豬胰島細(xì)胞懸液加入本發(fā)明所述的培養(yǎng)基中，在37°C、5%C02、95%空氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，制備的細(xì)胞在第一天更換培養(yǎng)皿及培養(yǎng)基，此后每隔一天更換一次。該優(yōu)化培養(yǎng)基降低了細(xì)胞凋亡率，增加了培養(yǎng)細(xì)胞回收率，延長(zhǎng)了細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，使得培養(yǎng)后胰島細(xì)胞較短時(shí)間培養(yǎng)的更為成熟，相同量胰島細(xì)胞的胰島素分泌量顯著提升，建立了穩(wěn)定高效，細(xì)胞獲得量大的長(zhǎng)期胰島細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)體系。細(xì)胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMK，分子式為 Z-Val-Ala-Asp-CH2F,即 C21H28FN3O7,分子量為 453. 5，純度 >95%。與以往技術(shù)相比的有益效果I細(xì)胞凋亡下降，回收率增加。2培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，培養(yǎng)細(xì)胞有敏感葡萄糖刺激應(yīng)答，功能比一般培養(yǎng)的胰島細(xì)胞要成熟。
3相同量的胰島細(xì)胞胰島素分泌量增加。4胰島β細(xì)胞活力增加。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明針對(duì)已分離純化的新生豬胰島細(xì)胞懸液含10000IEQ(IEQ為胰島當(dāng)量，按細(xì)胞團(tuán)大小來計(jì)算)，將所述的懸液加入培養(yǎng)基HAM’ S/F-10 (從thermo公司購(gòu)得)、10%豬血清、0. 1%谷氨酰胺、80U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素，并且添加有Z-VAD-FMK 10微摩爾 50微摩爾(上海碧云天生物技術(shù)有限公司購(gòu)得)、20%人血白蛋白、SmM丙酮酸鈉的培養(yǎng)皿。置于37°C、5%C02、95%空氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，制備的細(xì)胞在第一天更換培養(yǎng)皿及培養(yǎng)基，此后每隔一天更換一次，于培養(yǎng)第10天時(shí)收集細(xì)胞計(jì)數(shù)并做相關(guān)檢測(cè)。細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)方法為 常規(guī)臺(tái)盼藍(lán)(分子式C34H24N6014S4Na4)染色(細(xì)胞懸液同4%臺(tái)盼藍(lán)液體比例為9 :1)，將27 μ I細(xì)胞懸液和3μ I臺(tái)盼藍(lán)溶液混合，滴入市售的細(xì)胞計(jì)數(shù)板顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法為一般光學(xué)顯微鏡下目測(cè)細(xì)胞計(jì)數(shù)板上四個(gè)對(duì)角上四個(gè)大正方形方格(由16個(gè)小正方形方格組成)中的細(xì)胞數(shù)，求平均數(shù)X，總細(xì)胞數(shù)為ΧΧ100000Χ細(xì)胞培養(yǎng)液總數(shù)。本發(fā)明分離純化后胰島獲得量平均值為17805±2171.47IEQ/胰腺，即12187. 41 ±2653. 182IEQ/g胰腺。本發(fā)明通過向HAM’ S/F-10培養(yǎng)基中添加細(xì)胞凋亡抑制劑(Z-VAD-FMK)、20%人血白蛋白、8mM丙酮酸鈉以及10%豬血清，使培養(yǎng)7天的活性胰島細(xì)胞回收率達(dá)到82%，比一般培養(yǎng)的胰島細(xì)胞提高36. 7%。本發(fā)明的方法與一般培養(yǎng)(3-6天)培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)(10天)，培養(yǎng)10天獲得的胰島細(xì)胞對(duì)葡萄糖刺激具有敏感應(yīng)答能力，并且培養(yǎng)10天的胰島細(xì)胞中β細(xì)胞比例為94. 65%，較一般培養(yǎng)的比例高。另外，insulin/DNA值為(66. 45±2. 17mIU/g)也相對(duì)于一般培養(yǎng)的胰島細(xì)胞(49. 00 ± I. 95mIU/g)要高,證明本發(fā)明培養(yǎng)的胰島細(xì)胞胰島素分泌量明顯增多(P〈0. 05)，彌補(bǔ)了一般培養(yǎng)的胰島細(xì)胞因凋亡導(dǎo)致胰島素分泌下降的不足。
權(quán)利要求
1.一種新生豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)基，向HAM’ S/F-10培養(yǎng)基中添加細(xì)胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMKIO微摩爾 50微摩爾，占培養(yǎng)基體積百分比15% 25%的人血白蛋白和占培養(yǎng)基體積百分比為5% 15%豬血清，以及每升培養(yǎng)基中加入6 IOmmol的丙酮酸鈉。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的新生豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)基，所述的人血白蛋白為20%;所述的豬血清為10%,所述的丙酮酸鋼為8mmol。
3.權(quán)利要求I或2所述的培養(yǎng)基的使用，將新生豬胰島細(xì)胞懸液，置于37°C、5%C02、95%空氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，制備的細(xì)胞在第一天更換培養(yǎng)皿及培養(yǎng)基，此后每隔一天更換一次，培養(yǎng)10天。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基的使用，所述的新生豬胰島細(xì)胞懸液為5000 10000IEQ。
全文摘要
一種新生豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)基及其使用方法，所述的培養(yǎng)基是向HAM’S/F-10培養(yǎng)基中添加細(xì)胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMK 10微摩爾～50微摩爾，占培養(yǎng)基體積百分比15%～25%的人血白蛋白和占培養(yǎng)基體積百分比為5%～15%豬血清，以及每升培養(yǎng)基中加入6～10mmol的丙酮酸鈉。本發(fā)明是一種改良的能大量提供有活性并且有穩(wěn)定產(chǎn)量的新生豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)體系。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102816733SQ20121033042
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者王維, 易受南 申請(qǐng)人:王維