一種毛癬菌掃描電鏡樣品的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種毛癬菌掃描電鏡樣品的制備方法，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 樣品的前處理是電鏡觀察的必備過程，其處理效果的好壞直接關系到電鏡觀察的 結果。
[0003] 由于毛癬菌的菌絲均呈團狀，且有些較厚，在樣品處理過程中，存在著與試劑接觸 不充分的現(xiàn)象，導致樣品處理不均勻，結果無法準確判斷。通過多次的重復實驗發(fā)現(xiàn)，電鏡 制樣過程中最重要的一步是固定，若是固定效果不好，后續(xù)處理也不能起到很好地改善作 用。
[0004] 目前最常用的方法為戊二醛-鋨酸（四氧化鋨）雙重固定，但鋨酸是劇毒物品，接 觸或吸入可導致頭痛、呼吸道炎癥、眼病、支氣管病、肺炎等，對實驗人員的健康構成嚴重的 潛在威脅，有必要研究一種低毒的固定方法以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的雙重固定法。也有研究單用戊二 醛固定，但易使菌體皺縮，效果不能使人滿意。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明研究了一種毛癬菌掃描電鏡（SEM)樣品的制備方法，它的精髓在于，樣品 固定時，用至少兩種不同濃度的戊二醛溶液依次處理樣品，且后一次戊二醛的濃度高于前 一次戊二醛的濃度。
[0006] 其中，首次處理的戊二醛濃度為2%。
[0007] 進一步地，第二次處理的戊二醛的濃度為2. 5%。
[0008] 優(yōu)選地，在4°C條件下，2%戊二醛溶液處理lh，然后2. 5%戊二醛溶液處理lh。
[0009] 2. 5%戊二醛溶液處理Ih后，繼續(xù)在4°C條件下過夜處理，進入后續(xù)常規(guī)處理步 驟。
[0010] 此外，在2. 5 %戊二醛溶液處理Ih后，還可以進行第三次固定處理，第三次固定處 理的戊二醛的濃度為3%。
[0011] 優(yōu)選地，在4°C條件下，2%戊二醛溶液處理lh，然后2. 5%戊二醛溶液處理lh，接 著3%戊二醛溶液處理lh。
[0012] 3%戊二醛溶液處理Ih后，繼續(xù)在4°C條件下過夜處理，進入后續(xù)常規(guī)處理步驟。
[0013] 上述處理方法可應用于各種毛癬菌，用于須癬毛癬菌效果更優(yōu)。
[0014] 通常微生物菌絲用于掃描電鏡樣品的制備包括菌絲活化、樣品準備、固定、清洗、 脫水、噴金等各種步驟。
[0015] 本發(fā)明集中于解決其中最核心的問題，即樣品的固定問題，其他各步驟可參照一 般的樣品處理方法。
[0016] 本發(fā)明方法沒有應用劇毒的鋨酸，創(chuàng)新性地應用了梯度濃度戊二醛多次固定，固 定效果好，安全便捷，為毛癬菌的掃描電鏡制樣提供了一種新的方法。
【附圖說明】
[0017] 圖1各不同固定處理SEM觀察結果
【具體實施方式】
[0018] 實施例1 :須癬毛癬菌掃描電鏡樣品的制備
[0019] 1材料與試劑：
[0020] I. 1 實驗材料：須癬毛癬菌（Trichophyton mentagrophytes)
[0021] 1. 2試劑：蛋白胨、葡萄糖、瓊脂、PH7. 2的磷酸緩沖液（PBS)、25%戊二醛、乙醇、丙 酮、叔丁醇
[0022] 1. 3主要實驗儀器：超凈工作臺、培養(yǎng)箱、移液器、冰箱、高壓滅菌鍋，冷凍干燥儀， 離子濺射儀，場發(fā)射掃描電鏡（FESEM)。
[0023] 1.4樣品準備
[0024] L 4. 1菌絲活化
[0025] SDA平板配制：稱取蛋白胨10g、葡萄糖20g、瓊脂18g，定容至1L，121°C、滅菌 30min，在培養(yǎng)基凝固之前倒平板，備用；
[0026] 菌種活化：將菌種接種于平板上，在30°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~7天，備用。
[0027] 1. 4. 2樣品準備：取活化的菌種接種于無菌的SD培養(yǎng)基（除去SDA培養(yǎng)基中的瓊 脂即可）中，30°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~7天，備用。
[0028] 1. 5制樣方法：
[0029] (1)取樣：取適量同一生長周期的菌絲于2mL的EP管中，用純水清洗2~3次，除 去菌絲表面的培養(yǎng)基及其它雜質(zhì)；
[0030] (2)固定：將上述清洗后的菌絲分別按照表1中戊二醛的濃度進行固定處理，A~ C分別加入各自濃度的戊二醛，放到4°C的冰箱過夜即可；J，K和L按表1中的流程處理，即 每一個梯度分別在4°C的冰箱中處理lh，直至處理的終濃度，最后放到4°C的冰箱過夜；
[0031] 操作流程見表1:
[0032] 表1各組固定處理步驟
[0033]
LlN 丄UOlOSO丄(65 A yJ^ rVJ
[0034] (3)清洗：取出固定后的菌絲，用純水清洗3次，除去固定液及固定液中的磷酸 鹽；
[0035] (4)脫水：依次用 30%、50%、70%、80%、90%、95% 的乙醇脫水 15 ~20min，然后 再用100%的乙醇處理三次，30min/次；
[0036] (5)置換：叔丁醇：乙醇=I : 3、2 : 2、3 : 1分別處理10~15min，l次；然后 用100%的叔丁醇處理三次，第三次叔丁醇處理結束時保存于-20°c冰箱；
[0037] (6)冷凍干燥：待叔丁醇凍至雪花狀，即可取出置于預冷的冷凍干燥儀的樣品池 中進行冷凍干燥；
[0038] (7)噴金：將干燥的樣品取出，用導電膠粘到樣品臺上，并用吹風機吹掉未粘好的 多余樣品，防止將樣品臺放到電鏡樣品室中觀察時樣品掉到電鏡中，損壞電鏡，然后利用離 子濺射儀對粘好的樣品進行噴金；
[0039] (8)觀察：將處理完的樣品放到SEM中觀察，并記錄觀察結果。
[0040] 2實驗結果
[0041] 圖中A是未用戊二醛固定的對照組，B、C、D、E分別為用不同濃度的戊二醛固定處 理的樣品所觀察的結果，。由圖可見：A中幾乎所有的菌素都處于皺縮狀態(tài)；B中絕大部分 菌絲為皺縮狀態(tài)，很小一部分呈飽滿狀態(tài)；C中約有一小半的菌絲很飽滿，呈現(xiàn)了其正常狀 態(tài)，約一大半菌絲出現(xiàn)了皺縮現(xiàn)象；D中菌絲飽滿，出現(xiàn)皺縮的比C組要少得多，程度較輕；E 中僅有一部分菌絲比較飽滿，比D中菌絲整體皺縮程度高得的多，且皺縮程度更為嚴重。由 此可見，戊二醛單次固定的濃度不宜過高。
[0042] 由于前面的處理中，均是用戊二醛單次固定，雖然得到了 D組這種效果較好的處 理，但還是不夠理想。
[0043] F、G兩組，即分別用2% -2. 5%、2% -2. 5% -3%戊二醛進行固定處理的組，菌絲 仍僅有小部分皺縮，整體效果較其他各組有明顯的優(yōu)勢；尤其是F組，菌絲明顯飽滿得多；H 中菌絲皺縮比較嚴重，效果反而不如E組（H組與E組終濃度相同）。對各組圖片中飽滿的 菌絲進行統(tǒng)計比較，結果見表2 :
[0044] 表2各處理組菌絲正常形態(tài)的比例
[0045]
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[0046] 由表2可見，2%-2. 5%戊二醛梯度固定（F)、2%-2. 5%-3%戊二醛梯度固定（G) 這兩組處理結果明顯優(yōu)于其他各組，說明2~3個不同濃度梯度的戊二醛固定菌絲的效果 明顯優(yōu)于其他處理，取得了意料不到的技術效果。
[0047] 本發(fā)明方法沒有應用劇毒的鋨酸，創(chuàng)新性地應用了梯度濃度戊二醛多次固定，固 定效果好，安全便捷，為毛癬菌的掃描電鏡制樣提供了一種新的方法。
【主權項】
1. 一種毛癬菌掃描電鏡樣品的制備方法，其特征在于：樣品固定時，用至少兩種不同 濃度的戊二醛溶液依次處理樣品，且后一次戊二醛的濃度高于前一次戊二醛的濃度。2. 根據(jù)權利要求1所述的濃度，其特征在于：首次處理的戊二醛濃度為2%。3. 根據(jù)權利要求2所述的濃度，其特征在于：第二次處理的戊二醛的濃度為2. 5%。4. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于：在4°C條件下，2%戊二醛溶液處理lh，然 后2. 5 %戊二醛溶液處理Ih。5. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于：2. 5 %戊二醛溶液處理Ih之后，繼續(xù)在 4°C條件下過夜處理，進入后續(xù)常規(guī)處理步驟。6. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于：2. 5 %戊二醛溶液處理Ih之后，還可以進 行第三次固定處理，第三次固定處理的戊二醛的濃度為3%。7. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于：在4°C條件下，2%戊二醛溶液處理lh，然 后2. 5 %戊二醛溶液處理Ih，接著3 %戊二醛溶液處理Ih。8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于：3%戊二醛溶液處理Ih后，繼續(xù)在4°C條 件下過夜處理，進入后續(xù)常規(guī)處理步驟。9. 根據(jù)權利要求1~8所述的方法，其特征在于：所述的毛癬菌為須癬毛癬菌。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種毛癬菌掃描電鏡樣品的制備方法：樣品固定時，用至少兩種不同濃度的戊二醛溶液依次處理樣品，且后一次戊二醛的濃度高于前一次戊二醛的濃度。本發(fā)明方法沒有應用劇毒的鋨酸，創(chuàng)新性地應用了梯度濃度戊二醛多次固定，固定效果好，安全便捷，為毛癬菌的掃描電鏡制樣提供了一種新的方法。
【IPC分類】G01Q30/20
【公開號】CN105158518
【申請?zhí)枴緾N201510611888
【發(fā)明人】白波, 曾智, 胡娜, 索有瑞, 徐恒
【申請人】中國科學院西北高原生物研究所
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年9月24日