專利名稱：G蛋白偶連受體拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域趨化因子也即intecrines，是細胞因子家族中可溶的、低分子量的一種，具有趨化吸引功能。趨化因子能夠選擇性誘導(dǎo)血液中有形部分的趨化性(除紅細胞外)，包括白細胞，如單核細胞、巨噬細胞、嗜伊紅粒細胞、嗜堿細胞、乳突細胞和淋巴細胞如T細胞、B細胞、多形核細胞(中性細胞)。除激發(fā)趨化性外，趨化因子還在應(yīng)答細胞中選擇性誘導(dǎo)其他變化，包括細胞形狀的改變、胞內(nèi)自由鈣離子濃度的瞬間升高、粒物質(zhì)細胞外滲、整合蛋白調(diào)高、伴隨白細胞激活的生物活性脂類(例如白三烯)的形成和呼吸困難。因此，趨化因子是炎癥反應(yīng)的早期誘因，它引起炎癥介質(zhì)的釋放、趨化反應(yīng)、和向炎癥部位或感染部位的細胞外滲作用。
迄今為止，對趨化因子的了解都僅限于一級結(jié)構(gòu)，它們都保留有四個半胱氨酸殘基以形成二硫鍵。對幾種趨化因子進行cDNA克隆和生化鑒定顯示，此類蛋白有一個長約20-25個氨基酸殘基的前導(dǎo)序列，在分泌過程中被切除，生成一條長約92-99個氨基酸殘基的成熟多肽?；诒Ａ舻陌腚装彼峤Y(jié)構(gòu)域，可將趨化因子家族劃分為兩類，即C-C趨化因子(β趨化因子)和C-X-C趨化因子(α趨化因子)，前兩個保留半胱氨酸要么相連，要么被別的氨基酸殘基分隔[Baggiolini,M.and C.A.Dahinden,Immunology Today,15:127-133(1994)]。
C-X-C趨化因子包括大量能夠趨化吸引并激活中性白細胞的趨化吸引物，如白介素8(IL-8)、PF4、中性細胞激活多肽2(NAP-2)。C-C趨化因子包括人單核細胞趨化因子蛋白1-3(MCP-1,MCP-2,MCP-3)、RANTES(調(diào)節(jié)活化，正常T細胞表達和分泌)、巨噬細胞炎癥蛋白1α和1β(MIP-1α和MIP-1β)，是單核細胞和淋巴細胞的趨化吸引物和激活劑，但不是中性細胞的趨化吸引物。例如，離體培養(yǎng)中，重組RANTES不僅是記憶T細胞的趨化吸引物，而且是單核細胞的趨化吸引物[Schall,T.J.et al.,Nature,347:669-671(1990)]。最近，還鑒定出一種能吸引淋巴細胞、帶有單一半胱氨酸對的，稱為淋巴細胞趨化因子(lymphotactin)的趨化因子[Kelner,G.S.,et al.,Science,266:1359-1395(1994)]。
C-C趨化因子由于其在變應(yīng)性炎癥中的潛在的作用而具有重要性。例如，MCP-1誘導(dǎo)人嗜堿細胞的細胞外滲，導(dǎo)致大量炎癥介導(dǎo)物的釋放，如組胺和白三烯C4。同樣，C-C趨化因子的受體也具有重要性，它們結(jié)合趨化因子后引起這些細胞事件。最近有人克隆了一個C-C趨化因子的受體，報道稱它結(jié)合MIP-1α和RANTES。因此，該MIP-1α/RANTES的受體被稱為C-C趨化因子受體1[CKR-1；Neote,K.et.al.,Cell,72:415-425(1993),Horuk,R.et al.,WO94/11504,1994年5月26日發(fā)表；Gao,J.-I.et al.,J.Exp.Med.,177:1421-1427(1993)]。一個MCP-1受體也被克隆出來[Charo,I.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:2752(1994)]。據(jù)報道這個被稱為CKR-2的受體與MCP-1有高親合力，與MCP-3有低親合力[Charo,I.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:2752-2756(1994)]。CKR-2有兩種存在形式，因為在異型A上引入不同的剪接位點而導(dǎo)致不同的細胞質(zhì)尾部。異型B的此區(qū)域不被剪接，結(jié)合及信號傳導(dǎo)實驗顯示它是MCP-1和MCP-3的功能性受體[Charo,I.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:2752-2756(1994)；Myers,S.J.,et al.,J.Biol.Chem.,270:5786-5792(1995)]。最近，有人描述了一種稱為CKR-4的新型受體，根據(jù)報道，將其注入X.Laevis (Power,C.A.et al.,J Biol.Chem.270:19495-19500(1995))的卵細胞中，作為對MCP-1、MCP-1α和RANTES的應(yīng)答，該受體cRNA會產(chǎn)生一個鈣離子激活的氯離子流。
MCP-1受體(CKR-2)和C-C趨化因子受體1被預(yù)言屬于具有七個跨膜G蛋白偶連受體的一個超家族[Gerard C.,and Gerard,N.P.,Annu.Rev.Immunol.,12:775-808(1994)；Gerard C.,andGerard N.P.,Curr.Opin.Immunol.,6:140-145(1994)]。G蛋白偶連(蛇根堿)受體的家族包括一大群膜內(nèi)蛋白，含有七個跨膜區(qū)域。這些受體的配體包括多種不同分子，包括小的生物胺分子，如腎上腺素、去甲腎上腺素、多肽，如P物質(zhì)、神經(jīng)激肽，以及大的蛋白質(zhì)，如趨化因子。受體和G蛋白相連，G蛋白是異源三聚體調(diào)節(jié)蛋白，能結(jié)合GTP并能通過偶連受體來介導(dǎo)信號的傳導(dǎo)，例如，通過產(chǎn)生細胞內(nèi)介導(dǎo)物。
兩個IL-8受體的cDNA的克隆和測序研究顯示，C-X-C趨化因子受體蛋白與七跨膜G蛋白偶連受體蛋白也有序列同源性[Mruphy P.M.and H.L.Tiffany,Science,253:1280-1283(1991)；Murphy et al.,WO93/06299；Holmes,W.E.et al.,Science,253:1278-1280(1991)]。通過克隆鑒明了其他一些趨化性蛋白受體如C5a和細菌甲基化三肽fMLP，他們所編碼的蛋白與這些七跨膜G蛋白偶連受體蛋白也有序列同源性[Gerard,N.P.and C.Gerard,Nature,349:614-617(1991)；Boulay,F.et al.,Biochemistry,29:11123-11133(1990)]。盡管已經(jīng)鑒定并克隆了許多其他的與這種趨化因子受體有顯著序列同源、相同組織和淋巴細胞亞群分布的蛋白質(zhì)，然而這些受體的配體確依然不明。因此，這些受體被稱為嬰兒期受體。
對其它的基因及其編碼的受體的分離和鑒定，以及相應(yīng)配體的鑒定，都對于理解趨化因子和靶細胞相作用及其引發(fā)的細胞事件是十分必要，包括理解白細胞的趨化性和細胞激活。本發(fā)明的概述本發(fā)明涉及編碼一種稱為C-C趨化因子受體3(CKR-3或CCR3)的哺乳動物(如人)受體蛋白的分離和/或重組核酸。本發(fā)明也關(guān)于重組核酸結(jié)構(gòu)體，例如質(zhì)?；蛘吣孓D(zhuǎn)錄病毒載體，它們包含編碼本發(fā)明中受體蛋白的整體或其一部分的核酸。這些核酸和結(jié)構(gòu)體被用來制備重組受體蛋白。在另一個實施方案中，核酸編碼一個反義核酸，其能夠與第二個編碼本發(fā)明受體蛋白的核酸雜交，若導(dǎo)入細胞，能夠抑制受體的表達。
另一方面，本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)和多肽，在本文中稱為分離的，重組的哺乳動物CKR-3受體蛋白。根據(jù)本文的描述，可以在宿主細胞中制備重組CKR-3受體蛋白或多肽。在一個實施方案中，受體蛋白被認定為以高親合力結(jié)合一個或多個趨化因子如趨紅素(eotaxin)、RANTES和/或MCP3，和/或能夠刺激一種或多種細胞反應(yīng)(例如，趨化反應(yīng)、細胞外滲、釋放一種或多種炎癥介導(dǎo)物)。
利用受體或其部分作為免疫原，或利用表達受體蛋白的細胞，能夠制備與受體作用的抗體。這些抗體及其片段在治療上、診斷和研究上都十分有用，包括受體蛋白的純化和研究、表達表面受體細胞的鑒定、以及細胞分類或計數(shù)。
本發(fā)明還涉及鑒定受體配體的方法，以及受體功能的抑制劑(拮抗劑)和增強劑(刺激劑)。在一個實施例中，適宜的宿主細胞是將一個核酸導(dǎo)入細胞使其成為一種合適的工程細胞，能夠表達該核酸所編碼的受體蛋白或多肽，該宿主細胞被用來鑒定和評價受體功能的配體、抑制劑或促進劑的效力。這樣的細胞也可用來評價所表達的受體蛋白或多肽的功能。
根據(jù)本發(fā)明，能夠鑒定受體功能的配體、抑制劑和促進劑并進一步評價它們的治療效果。如果需要的話，配體和促進劑可以用來刺激通常的受體功能，抑制劑卻可以用來減輕或防止受體活性。因此本發(fā)明提供了一種全新的抗炎癥治療策略，對于多種炎癥疾病或自身免疫疾病很有用，包括為某一個體(例如哺乳動物)給予受體功能的抑制劑。相反，將受體功能的配體或促進劑提供給某一個體來刺激受體活性，提供了一種選擇性激活淋巴細胞功能的新途徑，對于治療例如寄生蟲感染疾病十分有用。附圖的簡要說明

圖1A-1C說明基因克隆上的一個核苷酸序列，其編碼人CKR-3蛋白也叫Eos L2受體(SEQ ID NO:1)，以及通過開放閱讀框預(yù)測所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
圖2A-2B說明編碼人CKR-3受體(SEQ ID NO:3)的cDNA所決定的一個核苷酸序列，以及通過開放閱讀框預(yù)測所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
圖3說明一種透內(nèi)皮趨化實驗。一個培養(yǎng)插入子置于容器中，例如24孔板，在孔里形成了第一室和第二室。ECV304內(nèi)皮細胞生長于插入子內(nèi)側(cè)的多糖膜上形成單細胞層。對某種物質(zhì)(例如，趨化因子)應(yīng)答的待測細胞置于上室，所述的物質(zhì)置于下室。移去插入子，用適宜的方法檢查和計數(shù)細胞，就可以通過檢測穿過內(nèi)皮細胞層遷移到下室的細胞來評價趨化性。例如可以用細胞流計收集、檢測下室中的細胞(例如，F(xiàn)ACS分析，光散射)。
圖4是一柱形圖，說明人嗜伊紅粒細胞應(yīng)答于不同趨化因子的趨化特性。用標準方法純化人嗜伊紅粒細胞，在24孔透內(nèi)皮趨化性實驗中用顯微鏡分析其對不同趨化因子的應(yīng)答。
圖5說明用Eos L2轉(zhuǎn)染的多種克隆L1-2前B細胞的FACS實驗。來自多于200個克隆的細胞用M2抗-FLAG Mab染色，然后用抗-鼠Ig-FITC(Y軸，細胞數(shù)；X軸，熒光強度)。在陰性對照(PAUL001)中，轉(zhuǎn)染細胞用非相關(guān)的抗體染色。
圖6是一柱形圖，說明RANTES和MIP-1α與人嗜伊紅粒細胞的結(jié)合。在存在或不存在250nM不同的冷趨化因子(MIP-1α、RANTES、IL-8、MCP-1、MCP-3)情況下，純化的正常人嗜伊紅粒細胞與0.1nM125Ⅰ-標記MIP-1α或RANTES(“熱”)溫育。
圖7說明不同的冷趨化因子(RANTES、MIP-1α、MCP-1、MCP-3)抑制125Ⅰ標記RANTES與人嗜伊紅粒細胞的結(jié)合。人嗜伊紅粒細胞與0.1nM放射性標記的RANTES以及明確濃度的冷趨化因子一起溫育，每個點的數(shù)據(jù)是每一個樣品測量數(shù)據(jù)的平均值和標準偏差。
圖8是一個柱形圖，說明0.1nM125Ⅰ-標記的MIP-3(“熱”)或0.1nM125Ⅰ-標記的RANTES(“熱”)結(jié)合Eos L2轉(zhuǎn)染SF9細胞(cpm，每分鐘計數(shù))。(從左至右熱Rantes自身；熱Rantes+冷Rantes；熱MCP-3自身；熱MCP-3+冷MCP-3。)圖9A-9D說明用MAb LS26-5H12和細胞流計測定在白細胞上對CKR-3的表達。白細胞亞單元用抗CKR-3 MAb LS26-5H12(實線)或者IgG1同型匹配對照抗體(MOPC-21)(陰影面)染色。圖9A，嗜伊紅粒細胞；圖9B,T細胞；圖9C，單核細胞；圖9D，中性細胞。死細胞用碘化丙啶染色而排除。
圖10A-10C說明CKR-3受體快速轉(zhuǎn)染L1.2細胞的細胞表面染色(圖10A)，不成功轉(zhuǎn)染L1.2對照細胞的染色(圖10B)，或者細胞株E5(一個穩(wěn)定的L1.2CKR-3轉(zhuǎn)染子)的染色(圖10C)，染色用了抗CKR-3單克隆抗體(LS26-5H12，實線)。背景染色用對照單克隆抗體MOPC-21(陰影面)。
圖11A-11D說明放射性標記人趨紅素對E5細胞系(一個穩(wěn)定的用CKR-3受體轉(zhuǎn)染的L1-2細胞系，圖11A)或?qū)θ耸纫良t粒細胞(圖11B)的競爭性配體結(jié)合。細胞與0.6nM125Ⅰ-標記的趨紅素以及不同濃度的未標記的趨紅素(0),RANTES(▲)，或MCP-3(□)一起溫育。室溫下60分鐘后，洗滌細胞層并計數(shù)，根據(jù)數(shù)據(jù)計算未標記趨紅素各點的競爭值(圖11C,E5細胞系；圖11D，嗜伊紅粒細胞)。
圖12是一個矩形圖，說明不同趨化因子對人趨紅素與E5細胞系結(jié)合的抑制作用。E5細胞系(穩(wěn)定的L1-2/CKR-3轉(zhuǎn)染子)與0.6nM放射性標記的趨紅素和250nM未標記趨化因子的一起溫育，或沒有競爭試劑。
圖13A-13C是一個矩形圖，說明L1.2細胞和L1.2受體轉(zhuǎn)染子的趨化性。1×106E5細胞(穩(wěn)定的L1-2/CKR-3轉(zhuǎn)染子)(圖13A)，親代L1.2細胞(圖13B)，或IL-8 RB L1.2受體轉(zhuǎn)染子細胞系LSLW-2(圖13C)，被置于上室，各種給定濃度的趨化因子被置于下室。遷移四個小時，并對遷移到下室的細胞進行計數(shù)。全部實驗都重復(fù)進行，結(jié)果代表至少三次獨立實驗。X軸是趨化因子，Y軸是遷移細胞的數(shù)目，Z軸是趨化因子的濃度。
圖14A-14B說明兩個不同個體的嗜伊紅粒細胞趨化性反應(yīng)。類似于CKR-3 L1.2轉(zhuǎn)染子的應(yīng)答反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)了嗜伊紅粒細胞對趨紅素、RANTES、MCP-3和MCP-1作出趨化性應(yīng)答的供體-供體的變化。從血中純化嗜伊紅粒細胞，然后評價其對各種不同濃度趨化因子的趨化性應(yīng)答。各數(shù)值來自于至少四次具有代表性的實驗，使用的是相同的兩個血液供體。
圖15說明125Ⅰ-標記的RANTES與穩(wěn)定的細胞系(A31-293-20)細胞膜的結(jié)合，該細胞系由A31cDNA克隆(以中間點積分)轉(zhuǎn)染293細胞得來，其結(jié)合結(jié)果與結(jié)合于未轉(zhuǎn)染293細胞(實心圈)的細胞膜實驗進行比較。
圖16是一個矩形圖，說明125Ⅰ-標記的MCP-3與穩(wěn)定的細胞系(A31-293-20)細胞膜的結(jié)合，該細胞系由A31cDNA克隆轉(zhuǎn)染293細胞得來，其結(jié)合結(jié)果與結(jié)合于未轉(zhuǎn)染293細胞的細胞膜實驗進行比較。分別在沒有冷MCP-3(0nM)或者在有冷MCP-3(100nM)條件下，測定標記的MCP-3與轉(zhuǎn)染細胞(A31-20)或未轉(zhuǎn)染細胞(UT293)的細胞膜的結(jié)合。
圖17是一個矩形圖，說明結(jié)合的特異性，通過測定125Ⅰ-標記的MCP-3的結(jié)合量來評價，也可以用取自轉(zhuǎn)染細胞(A31-20)或未轉(zhuǎn)染細胞(UT293)的細胞膜的冷MCP-3代替。
圖18A是穩(wěn)定的L1.2轉(zhuǎn)染子熒光密度的FACs圖譜，能夠表達CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CXCR1(IL-8RA)，或者CXCR2(IL-8RB)，用抗-CCR3 mAb 7B11染色。全部L1.2轉(zhuǎn)染子染色的陰性對照(未給出)類似于7B11對CCR1轉(zhuǎn)染子的染色。
圖18B是人嗜伊紅粒細胞、淋巴細胞、T胚細胞、單核細胞、和粒細胞的FACs圖譜，用mAb 7B11染色，染色圖譜代表至少四次實驗結(jié)果。
圖18C是一個矩形圖，說明放射性標記人趨紅素、RANTES、MCP-2、或MCP-3與L1.2CCR3或CCR1轉(zhuǎn)染子的結(jié)合，以及用mAb 7B11或冷趨化因子抑制。細胞與下列物質(zhì)進行溫育0.1nM125Ⅰ-標記的趨紅素、RANTES、MCP-3、以及50μl或100μg/ml不相關(guān)mAb(MOPC21)、mAb 7B11、或250nM冷趨化因子。室溫60分鐘后，洗滌細胞層并計數(shù)。
圖19說明mAb 7B11抑制放射性標記趨紅素，RANTES和MCP-3與人嗜伊紅粒細胞的結(jié)合。人嗜伊紅粒細胞與0.1nM125Ⅰ-標記的趨紅素、-RANTES、-MCP-3、和不同濃度mAb 7B11一起溫育。室溫60分鐘后，洗滌細胞層并計數(shù)。用KaleidaGraph分析數(shù)據(jù)，計算出趨紅素的IC50為25.7ng/ml，對RANTES為13.7ng/ml，對MCP-3為18.8ng/ml。圖的左下方示出250nM冷趨化因子的抑制水平。
圖20A說明mAb 7B11抑制嗜伊紅粒細胞趨向趨紅素的劑量效果。細胞遷移的背景水平(沒有趨化因子)以圖標田表示(左下方)。
圖20B是一個矩形圖，說明5μg或20μg/ml的7B11 mAb抑制嗜伊紅粒細胞趨向不同趨化因子。在圖20A和圖20B的實驗中，1×106人嗜伊紅粒細胞被置于上室，10nM的趨化因子被置于下室，不同濃度7B11 mAb被置于上室，細胞向下室遷移1.5個小時，用細胞流計測定，結(jié)果代表至少四次獨立的實驗。
圖21是一系列軌跡，說明7B11 mAb抑制人嗜伊紅粒細胞應(yīng)答趨紅素、RANTES、MCP-2、MCP-3、MCP-4時[Ca2+]i的改變，人嗜伊紅粒細胞用Fura-2標記，被下列物質(zhì)依次激活(A)mAb,40秒后(B)趨化因子，100秒后(C)C5a。使用熒光光譜儀記錄[Ca2+]i的熒光改變。該軌跡代表至少五次獨立的實驗，分別用來自于不同供體的嗜伊紅粒細胞。上面的各圖使用了非相關(guān)對照mAb(MOPC-21)，下面各圖中使用了mAb 7B11。所用的抗體終濃度為6.4μg/ml，所使用的趨化因子為趨紅素10nM,RANTES 20nM,MCP-2200nM,MCP-3200nM,MCP-410nM,CSa為400pM。
圖22A是一個FACs圖譜，說明新鮮分離于一個健康對象的嗜伊紅粒細胞上IL-8受體的表達。嗜伊紅粒細胞用mAb染色，CXCR1(實線)，CXCR2(點標線)，或者對照mAb(陰影)，用細胞流計分析。
圖22B是一個FACs圖譜，說明用IL-5處理過的嗜伊紅粒細胞上IL-8受體的表達。嗜伊紅粒細胞和IL-5一起培養(yǎng)5天，如圖22A用mAb染色。
圖22C是一個FACs圖譜，說明分離于一個嗜伊紅粒細胞性對象的嗜伊紅粒細胞上IL-8受體的表達。如圖22A和圖22B用mAb染色。
圖22D說明mAb 7B11對和IL-5一起培養(yǎng)了5天的嗜伊紅粒細胞應(yīng)答于不同趨化因子發(fā)生[Ca2+]i改變的抑制。方法同圖21所述，所使用的mAb的和趨化因子為1．對照mAb，趨紅素，C5a；2．7B11，趨紅素，C5a；3．對照mAb,RANTES,C5a；4．7B11,RANTES,C5a；5．對照mAb,IL-8,C5a；6．7B11,IL-8,C5a。實驗結(jié)果代表至少三次獨立的實驗。
圖23A是一個矩形圖，說明單克隆抗體7B11對趨紅素、RANTES、和MCP-3所誘導(dǎo)的嗜伊紅粒細胞過氧化物酶(EPO)釋放的抑制作用，淺色柱顯示分別由10nM趨紅素，100nM趨紅素，100nM RANTES,100nM MCP-3所誘導(dǎo)的EPO釋放量。黑柱顯示當10μg/ml 7B11存在于嗜伊紅粒細胞脫粒實驗中時，EPO的釋放量。標記為“空白”的柱對應(yīng)于一個無趨化因子、無抗體(緩沖液)的對照。
圖23B是一個矩形圖，說明mAb 7B11對C5a誘導(dǎo)的嗜伊紅粒細胞過氧化物酶(EPO)釋放的影響效果。淺色柱顯示1nM C5a所誘導(dǎo)的EPO釋放量，黑柱顯示當10μg/ml 7B11存在于嗜伊紅粒細胞脫粒實驗中時，EPO的釋放量。
圖24A說明通過測定嗜伊紅粒細胞過氧化物酶(EPO)和嗜伊紅粒細胞陽離子蛋白質(zhì)(ECP)的釋放，了解趨紅素所誘導(dǎo)的嗜伊紅粒細胞脫粒過程。
圖24B說明通過測定嗜伊紅粒細胞過氧化物酶(EPO)和嗜伊紅粒細胞陽離子蛋白質(zhì)(ECP)的釋放，了解C5a所誘導(dǎo)的嗜伊紅粒細胞脫粒過程。
圖25說明趨紅素刺激嗜伊紅粒細胞釋放過氧化物酶。
圖26說明趨紅素刺激嗜伊紅粒細胞釋放葡萄糖醛酸酶。
圖27說明趨紅素刺激人嗜伊紅粒細胞釋放芳香硫酸酯酶。
圖28說明在全血中嗜伊紅粒細胞和嗜堿性細胞上CCR3的表達。全血用7B11-FITC染色，再如實施例12用鏈霉素量紅染色，細胞流計分析。
圖29是一個矩形圖，說明為應(yīng)答趨化因子人嗜伊紅粒細胞釋放組胺。
圖30A說明為應(yīng)答趨紅素和MCP-4，嗜堿性細胞的趨化性。
圖30B是一個矩形圖，說明抗-CCR3 mAb 7B11對應(yīng)答于趨紅素和MCP-4嗜堿性細胞的趨化性的阻滯作用。本發(fā)明的詳細描述這里將要詳細說明的是，編碼一種全新的、被稱為Eos L2或者C-C趨化因子受體3(CKR-3)、也即“CCR3”的人受體的核酸，已經(jīng)被分離出。已經(jīng)鑒定該核酸片段的人體基因和cDNA克隆。從一名患有高嗜伊紅粒細胞綜合癥病人采集嗜伊紅粒細胞，由此構(gòu)件嗜伊紅粒細胞的cDNA文庫，從中分離到cDNA克隆。對此克隆的序列分析揭示了基因內(nèi)包含一個長1065個核苷酸的開放閱讀框，其編碼推測的長355個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(圖1A-1C和2A-2B；SEQ ID NOS:2和4)，其和別的C-C趨化因子受體有氨基酸序列同源，該蛋白被認為是一種G蛋白偶連受體，有一個類似的七跨膜區(qū)域的結(jié)構(gòu)。
這個由CKR-3基因或者cDNA克隆編碼的推測的蛋白質(zhì)包含四個半胱氨酸殘基，在每一個胞外區(qū)域都有一個，位置分別是24、106、183、273(SEQ ID NOS:2和4)。所有的趨化因子受體在這些位點都保留了半胱氨酸，包括CKR-1、CKR-2、CKR-4、IL8-RA和IL8-RB。此外，該受體還包含一個氨基酸結(jié)構(gòu)域，DRYLAIVHA(殘基130-138)(SEQ ID NOS:2和4)，在其他C-X-C和C-C趨化因子受體也高度保留，推測屬于一種細胞內(nèi)蛋白。有兩個一致的蛋白激酶C磷酸化位點[Kishimoto,A.,et al.,J.Biol.Chem.,260:12492-12499(1985)；Woodgett,J.R.,Eur.J.Biochem.,161:177-184(1986)]，其中一個在第三個細胞內(nèi)環(huán)上，氨基酸位點為231，另一個在細胞質(zhì)尾部的333位點。另外，在細胞質(zhì)尾上有八個絲氨酸/蘇氨酸殘基，作為G-蛋白偶連受體激酶的磷酸化位點，例如從中性細胞分離的激酶[Haribabu,B.and R.Snyderman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:9398(1993)]或者別的相關(guān)家族成員[Benovic,J.L.and Gomez,J.,J.Biol.Chem.,268:19521-19527(1993)；Kunapuli,P.,and Benovic,J.L,.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5588-5594(1993)]。絲氨酸/蘇氨酸富集的細胞質(zhì)尾也是趨化因子受體的共同特點。不象CKR-1、CKR-2、CKR-4、IL-8RA和IL-8RB受體，CKR-3在任何一個細胞外區(qū)域都不包含N-連接的糖基化位點。CKR-3受體完全不同于C-C趨化因子受體1，也被稱為MIP-1α/RANTES受體。
從基因組和cDNA文庫獲得的核酸序列都是線狀的，但有如下不同之處，兩種序列在啟始密碼子的上游發(fā)生分歧(圖2A的位點78)。基因組克隆有一個內(nèi)涵子，分隔開啟動子和編碼區(qū)域中絕大多數(shù)5’端未翻譯區(qū)。這種基因組排列方式類似于在其他七跨膜趨化因子受體[Gerard,N.P.,et al.,Biochemistry,32:1243-1250(1993)；Murphy,P.M.,et al.,Gene,133:285-290(1993)]，包括IL-8RA和RB[Ahuja,S.K.,et al.,J.Biol.Chem.,269:26381-89(1994)；Sprenger,H.,et al.,J.Biol.Chem.,269:11065-11072(1994)；Sprenger,H.,et al.,J.Immunol.,153:2524-2532(1994)]以及CKR-1[Gao,J.L.,et al.,J.Exp.Med.,177:1421-1427(1993)]。除此之外，檢查基因組在分歧點附近的序列，發(fā)現(xiàn)規(guī)范的剪接受體序列。
啟始序列信息揭示，兩個區(qū)域里的cDNA序列存在邊框漂移，其原因是，先發(fā)生一個堿基的插入，再發(fā)生一個堿基的缺失，或者先發(fā)生一個堿基的缺失而后再發(fā)生一個堿基的插入。這種替換導(dǎo)致了預(yù)測蛋白質(zhì)分別在位點263-266和276-279出現(xiàn)四個相鄰氨基酸的差異。其他不同導(dǎo)致了在預(yù)測蛋白質(zhì)位點182、196、197、315的氨基酸差異。SEQ ID NOS:5中的核苷酸序列是一相同序列，包括兩個克隆中都有的區(qū)域，用啟始核苷酸序列簡單排列(堿基連堿基)就可以構(gòu)建該結(jié)構(gòu)。SEQ ID NOS:6中存在于基因組和cDNA克隆之間的啟始氨基酸差異，用Xaa標出，代表SEQID NOS:5的預(yù)期蛋白質(zhì)。然而，進一步的序列分析發(fā)現(xiàn)，開放閱讀框的核苷酸序列僅僅在對應(yīng)于圖2B核苷酸918-919的位點有所不同?；蚪M克隆在此位點是一個CG，而cDNA克隆是GC。因此，基因組克隆在位點276編碼蘇氨酸(ACG),cDNA克隆則編碼絲氨酸(AGC)。這種差異是由于序列的不確定性，或者是在逆轉(zhuǎn)錄過程中在cDNA導(dǎo)入了錯誤。也有可能，這種保留的替換(絲氨酸/蘇氨酸)是由于個體之間的多態(tài)性。另一種解釋是，病人嗜伊紅粒細胞的受體基因發(fā)生突變，而制備cDNA文庫的RNA又取自于此。
利用受體N端合成多肽技術(shù)，制備了對人源C-C趨化因子受體3有特異性的單克隆抗體和多克隆抗體。利用一種單克隆抗體(LS26-5H12)進行FACS(熒光激活細胞分類)，發(fā)現(xiàn)人嗜伊紅粒細胞上此受體的顯著表達，而不是白細胞上面的表達，如單核細胞，中性細胞，淋巴細胞，T細胞，T胚細胞(通過CD3 MAb激活來制備)(圖9A-9D)。用來源于高度純化的白細胞亞單元RNA的Northern雜交可以證實這種表達方式。然而在一些實驗里，T淋巴細胞中可以檢測到CKR-3mRNA或者受體，因此，有可能的是CKR-3在T淋巴細胞亞單元進行表達(實施例5)。此外，如本文所述，還產(chǎn)生了特異于人源C-C趨化因子受體3的單克隆抗體(實施例10)。該mAb也叫7B11，是一種人源C-C趨化因子受體3的抗體拮抗物，執(zhí)行受體的功能。7B11雜交細胞系依據(jù)Budapest條款于1996年9月25日存放于美國典型培養(yǎng)物中心(American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,20852，保藏號HB-12195，保藏人LeukoSite,Inc.,215 First Street,Cambridge MA02142,U.S.A.)。
基因組和cDNA克隆也在多種系統(tǒng)上進行過表達?？贵w被用來檢測已轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞和桿狀病毒轉(zhuǎn)染的昆蟲細胞上基因組克隆抗體的表達。構(gòu)建出表達CKR-3的哺乳動物細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子，結(jié)果顯示所編碼的受體高親合力地特異結(jié)合放射性標記的趨紅素，能夠與在嗜伊紅粒細胞發(fā)現(xiàn)的結(jié)合力相比較。用轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞進行的研究，顯示此受體同樣也能高親合力地特異結(jié)合RANTES和MCP-3，然而別的供試CC或CXC趨化因子就不是這個樣子了。下面的實驗結(jié)果與這個結(jié)合數(shù)據(jù)相吻合，鼠B淋巴細胞系產(chǎn)生的受體轉(zhuǎn)染子在趨化性實驗中，應(yīng)答趨紅素、RANTES和MCP-3，作出遷移反應(yīng)，但對其他供試趨化因子沒有反應(yīng)。在幾種異源系統(tǒng)中表達時，所用條件下人受體不顯著結(jié)合MIP-1α。除此之外，用嗜伊紅粒細胞做的趨化性和配體結(jié)合實驗，顯示RANTES和MCP-3通過一個受體與嗜伊紅粒細胞結(jié)合，該受體不同于C-C趨化因子受體、MIP-1α/RANTES受體。
MIP-1α作為一種嗜伊紅粒細胞趨化因子的作用一直就是有爭議的。一些研究人員檢測到了趨化反應(yīng)[Rot,A.,et al.,J.Exp.Med.,176:1489-1495(1995)]，而另一些卻沒有檢測到[圖4，實施例1；Ebisawa,M.,et al.,J.Immunol.,153:2153-2160(1994)；andPonath,P.D.,et al.,J.Clin.Invest.,(1996)]。十分有趣的是，MIP-1α是老鼠的一種嗜伊紅粒細胞趨化因子，并且表現(xiàn)為通過鼠CKR-3同系物介導(dǎo)，其也能夠結(jié)合趨紅素并發(fā)生信號[Post,T.W.,et al.,J.Immunol.,155:5299-5305(1995)；該文獻的教導(dǎo)都通過在此引述而全文合并于本文]。
利用本發(fā)明的蛋白質(zhì)和抗體，不僅能夠鑒定更多表達CKR-3受體的細胞類型(例如，白細胞，嗜堿性細胞)，而且能夠鑒定更多配體。例如，如同本文所述，利用7B11已經(jīng)證實嗜堿性細胞表達CCR3。根據(jù)本發(fā)明，可以評估其他趨化因子結(jié)合哺乳動物CKR-3受體的能力。
編碼一種新受體的克隆的基因克隆和鑒別實驗，可證明在諸如趨紅素，RANTES,MCP-3等誘導(dǎo)下能夠作出結(jié)合反應(yīng)與介導(dǎo)趨化性反應(yīng)的CKR-3受體的分離與鑒別實驗，都暗示了這種受體屬于七跨膜G蛋白偶連受體家族中的一員，參與應(yīng)答趨化因子時作出的選擇性白細胞趨化過程和激活過程。CKR-3受體或CCR3受體及其哺乳動物同系物不同于MIP-1α/RANTES受體和MCP-1受體[即，它們是不同于C-C趨化因子1(CKR-1)和MCP-1受體(CKR-2)及其類似物的受體]。
因為趨化因子受體在應(yīng)答于趨化因子選擇性誘導(dǎo)白細胞趨化作用和白細胞激活中的作用，所以趨化因子受體在白細胞遷移作用中扮演重要角色，尤其是伴隨炎癥發(fā)生的遷移作用。在炎癥和感染位點產(chǎn)生的趨化因子，將特異性地從循環(huán)系統(tǒng)吸引某種白細胞亞類型富集到炎癥部位。接下來，趨化因子結(jié)合到白細胞趨化因子受體上，激活整合蛋白，通過白細胞整合蛋白和內(nèi)皮細胞黏附分子，白細胞緊密黏附到內(nèi)皮細胞上。白細胞變得扁平，穿過內(nèi)皮遷向炎癥部位。在某些場合，白細胞對于組織和炎癥部位的特異性，決定于趨化因子-受體相互作用的水平，而不是整合蛋白與細胞黏附分子之間黏附作用的水平。
對于嗜堿性細胞和嗜伊紅粒細胞，RANTES和MCP-3都屬于最強有力的趨化性細胞因子。另據(jù)報道，RANTES是一種T淋巴細胞亞類-記憶T淋巴細胞的趨化因子。如本文所述，RANTES和MCP-3可以誘導(dǎo)嗜伊紅粒細胞的趨化反應(yīng)。CKR-3受體蛋白質(zhì)也能夠高親合力地與RANTES和MCP-3結(jié)合。
如本文進一步所述，CKR-3以高親合力特異性結(jié)合趨紅素(可與嗜伊紅粒細胞的結(jié)合親合力相比)，CKR-3受體在其表達上被嚴格限制。盡管已經(jīng)鑒別出許多嗜伊紅粒細胞的趨化因子，例如RANTES和MCP-3[Baggiolini,M.and Dahinden,C.A.,Immunol.Today,15:127-133(1994)；Dahinden,C.A.,et al.,J.Exp.Med.,179:751-756(1994)；Kameyoshi,Y,et al.,J.Exp.Med.,176:587-592(1992)；Rot,A.,et al.,J.Exp.Med.,176:1489-1495(1995)]，以及PAF、C5a、IL-16[Wardlaw,A.J.et al.,J.Clin.Invest.,78:1701-1706(1986)；Gerard,N.P.,et al.,J.Biol.Chem.,264:1760-1765(1989)；Rand,T.H.,et al.,J.Exp.Med.,173:1521-1528(1991)]，這些趨化因子也能夠誘導(dǎo)其他白細胞類型的遷移作用。相比之下，趨化因子中的趨紅素，最初發(fā)現(xiàn)于豚鼠接著在鼠和人都有發(fā)現(xiàn)的一種強有力的嗜伊紅粒細胞趨化因子，對于嗜伊紅粒細胞是有選擇性的趨化作用[Jose,P.J.,et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,205:788-794(1994)；Jose,P.J.,et al.,J.Exp.Med.,179:881-887(1994)；Rothenburg,M.E.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,92:8960-8964(1995)；Ponath,P.D.,et al.,J.Clin.Invest.,97(3):604-612(1996)]。另外，趨紅素結(jié)合于CKR-3并通過他高度可信地傳遞信號，相比之下，趨化因子例如MCP-3除了結(jié)合CKR-3外還結(jié)合CKR-1和CKR-2[Ben-Baruch,A.,et al.,J.Biol.Chem.,270:22123-22128(1995)]，或者MIP-1α，其結(jié)合CKR-1和CKR-4[Neote,K.,et al.,Cell,72:415-425(1993)；Power,C.A.,et al.,J.Biol.Chem.,270:19495-19500(1995)]。CKR-3在嗜伊紅粒細胞上受限制的表達，以及趨紅素結(jié)合CKR-3的可信度，為嗜伊紅粒細胞在組織里選擇性地富集和遷移提供了一種機制。從這個角度來看，組織內(nèi)趨紅素的生成將導(dǎo)致選擇性的嗜伊紅粒細胞富集；把趨紅素注入到恒河猴的皮膚內(nèi)，引起選擇性的嗜伊紅粒細胞遷移。另外，在體內(nèi)培養(yǎng)時，趨紅素以低于RANTES十倍的量富集嗜伊紅粒細胞，類似于體外培養(yǎng)實驗中CKR-3轉(zhuǎn)染子的趨化作用[Ponath,P.D.,et al.,J.Clin.Invest.,97(3):604-612(1996)]。
根據(jù)本發(fā)明，通過抑制或者促進受體功能，例如結(jié)合，信號或刺激細胞應(yīng)答，能夠調(diào)整哺乳動物CKR-3受體的功能，如此便提供了一種抑制或促進白細胞介導(dǎo)炎癥作用的行之有效的和選擇性的途徑，尤其是嗜伊紅粒細胞、嗜堿性細胞和/或T細胞。例如那些在這里已經(jīng)鑒定并被說明過的CKR-3受體功能的配體、抑制劑、促進劑、都能夠為了醫(yī)療目的用來調(diào)整白細胞功能。
嗜伊紅粒細胞不表達MIP-1α受體，也不表達顯著量的MCP-1受體。此外，如上所述，趨紅素和RANTES屬于嗜伊紅粒細胞最強有力的趨化因子，趨紅素和RANTES特異性地、高親合力地與CKR-3受體結(jié)合。作為嗜伊紅粒細胞和淋巴細胞的一種主要的趨化因子受體，CKR-3受體是干涉或促進嗜伊紅粒細胞、嗜堿性細胞和/或T淋巴細胞功能過程的重要靶物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的方法，已經(jīng)鑒別的能夠抑制或促進CKR-3受體功能的物質(zhì)，例如配體、抑制劑或促進劑，對于為醫(yī)療目的調(diào)整嗜伊紅粒細胞、嗜堿性細胞和/或T淋巴細胞功能的過程尤其實用。
例如，如同本文中所述，抗-CCR3抗體7B11抑制趨紅素和CCR3結(jié)合所誘導(dǎo)的嗜伊紅粒細胞脫粒作用(實施例11)。這里同樣也證實了，7B11不僅抑制嗜堿性細胞應(yīng)答趨化因子時組胺的釋放，還抑制嗜堿性細胞趨向趨紅素和MCP-4(實施例13)。趨化因子 其它名稱 已經(jīng)鑒定的配體受體CCR1 CCCKR1 MIP-1α,RANTES,MCP-3CCR2a,b MCP-1Ra,b MCP-1,MCP-3,MCP-4CCR3 CKR-3 趨紅素，RANTES,MCP-2,3,4CCR4 RANTES,MIP-1α,MIP-1CCR5 CCCKR5 RANTES,MIP-1α,MIP-1βCXCR1IL-8RA,IL-8R1 IL-8CXCR2IL-8RB,IL-8R2 IL-8,GROα,NAP-2,ENA-78CXCR3無 IP-10,MigCXCR4Fusin/humstr/Lestr SDF-1核酸，結(jié)構(gòu)體和載體本發(fā)明涉及分離的和/或重組的(包括相當高純度的)核酸，其所含序列能夠編碼被標為Eos L2或C-C趨化因子受體3(CKR-3，在這里也稱CCR3)的哺乳動物(如人)受體蛋白或者他的一部分。在一個實施例里，該核酸或其一部分編碼一個蛋白質(zhì)或多肽，它們具有至少一個哺乳動物C-C趨化因子受體(例如哺乳動物CKR-3受體)的功能特征，例如結(jié)合活性(例如，配體、抑制劑和/或促進劑結(jié)合)，信號活性(激活哺乳動物G蛋白，誘導(dǎo)細胞質(zhì)自由鈣離子[Ca2+]i濃度的迅速及短暫升高)，和/或刺激細胞應(yīng)答(例如，刺激趨化反應(yīng)、細胞外滲或白細胞釋放炎癥介導(dǎo)物、整合蛋白活化)。本發(fā)明還特別涉及分離的和/或重組的核酸或其一部分，所含片段編碼哺乳動物CKR-3受體或其一部分。
本發(fā)明更進一步涉及分離的和/或重組的核酸，其特征為(1)能夠和下列物質(zhì)雜交(a)含有序列SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5的核酸，(b)SEQ ID NO:1或3或5的互補物，(c)包含編碼區(qū)(SEQ ID NO:1的核苷酸181-1245,SEQID NO:3的核苷酸92-1156,SEQ ID NO:5的核苷酸15-1079)的前述物質(zhì)的一部分，或者(d)任意一個前述部分的RNA對應(yīng)物，其中U替換T；或者(2)編碼多肽的能力，所編碼的多肽含有氨基酸序列SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6或者功能相似物(即，具有受體的一個或多個天然的或生理的配體結(jié)合活性)，和/或應(yīng)答于配體結(jié)合的激活功能的多肽(例如，趨化因子，白細胞所引起的細胞外滲，或釋放炎癥介導(dǎo)物)；或(3)兼有兩種活性。
在一個實施方案里，SEQ ID NO:2、4或6及其功能相似物之間的氨基酸相同序列百分比為70％(≥70％)。在一個更好的實施方案里，SEQ ID NO:2、4或6功能相似物與SEQ ID NO:2、4或6之間有80％的序列同源。優(yōu)選地，SEQ ID NO:2、4或6功能相似物與SEQ ID NO:2、4或6之間有90％的氨基酸系列同源，或者更優(yōu)選地，至少95％。符合此標準的分離的和/或重組的核酸包括有與天然存在的哺乳動物CKR-3受體或一部分、或與天然存在的序列的變體序列有同源性的序列。這些變體包括由于一個或多個殘基添加、缺失或替換所產(chǎn)生的突變體，一個或多個殘基被修飾了的被修飾核酸(例如，DNA或RNA類似物)，以及含有一個或多個修飾殘基的突變體。
在高度嚴緊或中度嚴緊條件下用雜交手段可以檢測或分離到這種核酸。例如，核酸雜交的“高度嚴緊條件”和“中度嚴緊條件”解釋于現(xiàn)代分子生物學(xué)手冊2.10.12-2.10.16各頁(尤其2.10.8-11各頁)和6.3.1-6各頁(Ausubel,F.M.et al.,eds.,Vol.1,Suppl.26,1991)，其中的教導(dǎo)通過在此引述而合并于本文中(還可見實施例2)。一些因素例如探針長度，堿基組成，雜交序列間錯配百分比，溫度和離子強度都將影響核酸的雜交。因此，可以根據(jù)經(jīng)驗決定高度和中等嚴緊條件，部分依賴用于與未知的核酸進行同源性比較的已知的DNA的特征。
根據(jù)與核酸序列SEQ ID NO:1、3、5或其中任何一個的互補物的雜交能力而定性的分離的和/或重組的核酸(在高度嚴緊或中度嚴緊條件下)，可以進一步編碼至少有一個哺乳動物C-C趨化因子受體的功能(如哺乳動物CKR-3受體)的蛋白質(zhì)或多肽，所述的功能包括例如結(jié)合活性(例如，與配體、抑制劑和/或促進劑結(jié)合)，信號活性(例如，激活哺乳動物G蛋白，誘導(dǎo)細胞質(zhì)自由鈣離子[Ca2+]i濃度的迅速及短暫升高)，和/或刺激細胞反應(yīng)(例如，刺激趨化反應(yīng)、胞外滲透、白細胞對炎癥介導(dǎo)物的釋放、整合蛋白的活化)。
利用應(yīng)答于受體結(jié)合G蛋白質(zhì)活性的酶學(xué)實驗可以檢測雜交核酸編碼的蛋白或多肽的信號功能(利用膜碎片，G蛋白質(zhì)的α亞基上GTP與GDP的交換)。能夠進一步檢測G蛋白質(zhì)的偶連，在所用的檢測中，G蛋白的刺激被用G蛋白質(zhì)特有的抑制劑(例如Bordetella pertussis毒素)對細胞或適宜的細胞組分(例如，膜)進行處理或預(yù)處理所封閉[Bischoff,S.C.et al.,Eur.J.Immunol.23:761-767(1993)；Sozzani,S.et al.,J.Immunol.147:2215-2221(1991)]。
通過趨化性或介質(zhì)釋放的標準實驗可以檢測雜交核酸編碼的蛋白質(zhì)或多肽的刺激功能，使用的是表達這種蛋白或多肽的細胞，監(jiān)測趨化性，細胞外滲(例如嗜伊紅粒細胞過氧化物酶，β-葡萄糖醛酸酶之類的酶)，或應(yīng)答于配體或促進劑的介導(dǎo)物釋放(如趨紅素，RANTES,MCP-3之類的趨化因子)。
通過結(jié)合檢測或結(jié)合抑制實驗可以檢測雜交核酸編碼的蛋白質(zhì)或多肽的結(jié)合功能，所用的膜片含有受體或者細胞表達受體[見實施例9；Van Riper et al.,J.Exp.Med.,177:851-856(1993)；Sledziewski et al.,U.S.Patent No.5,284,746(Feb.8,1994)]。因此，所編碼的蛋白或多肽結(jié)合配體的能力，如結(jié)合趨紅素、RANTES、MCP-3、抑制劑和/或促進劑的能力都可以被檢測。用其他適當方法也能夠檢測哺乳動物CKR-3受體特有的功能。
這些方法自己或與其他合適方法相結(jié)合，也能夠用于對具有SEQ ID NO:2,4,6或功能相似物的氨基酸序列的、并具有可被檢測的活性的多肽的編碼核酸的鑒別和/或分離的程序中。編碼SEQ ID NO:2,4,6的具有特定功能的多肽部分的分離核酸的部分，也能夠用該法鑒定或分離。
本發(fā)明的核酸可以用來制備蛋白質(zhì)或多肽。例如，擁有編碼哺乳動物CKR-3受體的全部或部分核酸，與SEQ ID NO:1,3,5序列雜交的DNA，或SEQ ID NO:1,3,5中任意一個的互補物，都能夠整合到不同結(jié)構(gòu)體和載體中，進一步進行序列操作或在適當宿主細胞中制備所編碼的蛋白質(zhì)。
這里所指的“分離”的核酸是指從基因組DNA及其來源的細胞RNA中分離的核酸(存在于細胞內(nèi)或核酸混合物中，如基因文庫)，也可以經(jīng)過進一步的加工?！胺蛛x”的核酸包括使用這里所描述方法、類似方法或其他合適方法而獲得的核酸，包括化學(xué)合成的核酸與高純度核酸，聯(lián)合使用化學(xué)的和生物的方法獲得的核酸，以及分離的重組核酸。這里所指的“重組”核酸是指利用重組DNA方法學(xué)制備的核酸，包括依賴于人工重組過程得到的核酸，例如多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)和/或用限制性內(nèi)切酶克隆到載體中。“重組”核酸也指在細胞里由天然機理發(fā)生的重組事件形成的核酸，但是在細胞導(dǎo)入了核酸后需要篩選，得到理想的重組體。反義結(jié)構(gòu)在另一個實施方案里，所用核酸是一段反義核酸，與包含有意義鏈的目標分子完全或部分互補，能夠與目標分子雜交。靶可以是DNA或他的RNA對應(yīng)物(在DNA中的T堿基換成RNA中U)。用已知的方法或其他合適方法導(dǎo)入細胞后，反義核酸能夠封閉有意義鏈基因的表達。反義核酸可用標準技術(shù)制備。
在一個實施方案里，反義核酸能夠完全或部分與靶核酸互補以及雜交，其中的靶核酸能夠與互補于SEQ ID NO:1、3、5的序列或其RNA對應(yīng)物進行雜交。例如，反義核酸能夠與靶核酸雜交，后者含有序列SEQ ID NO:5或其足夠進行雜交的一部分。在另一個實施方案里，反義核酸能夠完全或部分互補于編碼哺乳動物CKR-3受體(例如，人Eos L2受體)的靶核酸，并雜交。
反義核酸可以用于多種目的，包括研究和治療。例如，包含反義核酸的一個結(jié)構(gòu)體能夠被導(dǎo)入合適的細胞中抑制受體的表達。這種細胞提供了一種有價值的對照細胞，例如，在用母代細胞或其他相關(guān)細胞類型評估受體-配體結(jié)合特異性。另一方面，該結(jié)構(gòu)體被導(dǎo)入一些或全部的哺乳動物細胞。反義核酸抑制受體的表達，含有這種結(jié)構(gòu)體的細胞中的CKR-3受體介導(dǎo)的炎癥過程同樣也被抑制了。因此，利用本發(fā)明的反義核酸可以用來治療炎癥疾病。合適的含有這種反義核酸的實驗動物為缺少白細胞功能提供了一個有用的模型，尤其是缺少嗜伊紅粒細胞的模型，也為評價CKR-3受體功能提供了更進一步的信息。這種動物為感染性疾病提供了一種十分有價值的模型，便于研究白細胞的功能，例如在宿主防衛(wèi)中嗜伊紅粒細胞和/或T淋巴細胞的作用。哺乳動物核酸由于在理解和治療炎癥和自體免疫疾病以及寄生蟲感染方面的長足進展將給人們帶來巨大利益，人CKR-3或CCR3是本發(fā)明的實驗中使用最多的種類。然而，在分離和控制人CKR-3的基因組以及cDNA中所使用的，用來構(gòu)建載體和宿主細胞株的，以及制備并使用受體和片段的方法，都能夠用在別的哺乳動物上，包括但不限于靈長目(除人之外的靈長目動物，如猴子，比如cynomolgus猴)，?？?如乳牛)，綿羊科(如綿羊)，馬(如馬)，犬科(如狗)，貓科(如家貓)，和嚙齒類(如豚鼠，鼠類如家鼠，大鼠)。這里所描述的人CKR-3cDNA或基因組克隆，或者充足的局部，不論是分離的和/或重組的或合成的，包括PCR制備的編碼序列片段，都能夠作為探針來檢測和/或回收相似的CKR-3基因或別的從其他哺乳動物來的相關(guān)受體基因(如新的C-C趨化因子受體基因)(通過雜交，PCR或別的方法)。用這里所描述的技術(shù)或別的方法都能夠?qū)崿F(xiàn)上述目標。蛋白質(zhì)和多肽本發(fā)明也涉及由本發(fā)明的核酸所編碼的蛋白質(zhì)和多肽。本發(fā)明的蛋白質(zhì)和多肽可以是分離和/或重組的。這里所說“分離”的蛋白質(zhì)或多肽是指純度超過在哺乳動物細胞內(nèi)的水平的純化的蛋白質(zhì)或多肽?！胺蛛x”的蛋白質(zhì)或多肽包括用這里所述方法，相似方法或其他合適方法制備的蛋白質(zhì)或多肽，包括高純度蛋白質(zhì)或多肽，化學(xué)合成制備的蛋白質(zhì)或多肽，化學(xué)以及生物的聯(lián)合方法制備的蛋白質(zhì)或多肽，以及分離的重組蛋白質(zhì)或多肽。這里所指的“重組”的蛋白質(zhì)或多肽是利用重組核酸表達的蛋白質(zhì)或多肽。
在一個優(yōu)選的實施方案里，蛋白質(zhì)或多肽有哺乳動物CKR-3受體的至少一個特性，例如結(jié)合特性(配體、抑制劑和/或促進劑的結(jié)合)，信號活性(激活哺乳動物G蛋白，誘導(dǎo)細胞質(zhì)自由鈣離子[Ca2+]i濃度的迅速及短暫升高)，和/或刺激細胞反應(yīng)(刺激趨化反應(yīng)，細胞外滲或白細胞釋放炎癥介導(dǎo)物，整合蛋白活化)。這些蛋白質(zhì)被稱為哺乳動物源的CKR-3蛋白或者哺乳動物趨化因子受體3蛋白，包括天然存在的哺乳動物CKR-3受體，這些蛋白的變體和/或其局部。變體包括多形態(tài)變種和天然或人為的突變體，通過一個或多個氨基酸殘基的添加，缺失或替換，或者一個或多個殘基修飾的被修飾多肽，以及包括一個或多個修飾殘基的突變體。一個例子是結(jié)合趨紅素的哺乳動物CKR-3受體蛋白。
在一個特別優(yōu)選的實施方案里，類似天然發(fā)生的哺乳動物CKR-3受體蛋白或多肽，本發(fā)明的哺乳動物CKR-3受體蛋白對一個或多個天然的或生理的配體有結(jié)合功能，和/或應(yīng)答于配體結(jié)合的激活性能，以便能夠刺激細胞反應(yīng)(刺激趨化反應(yīng)，細胞外滲或白細胞釋放炎癥介導(dǎo)物，整合蛋白活化)。例如，在人趨化因子受體3蛋白的情況，分離的CKR-3受體蛋白能夠結(jié)合一個或多個天然或生理的配體。如本文所示，分離的人CKR-3受體蛋白特異性高親合力地結(jié)合RANTES和趨紅素，特別是結(jié)合MCP-3。在一個實施方案中，人CKR-3受體蛋白或多肽也能夠刺激白細胞對配體結(jié)合作出應(yīng)答，啟動趨化反應(yīng)，細胞外滲，或者白細胞釋放炎癥介導(dǎo)物。
本發(fā)明更進一步涉及融合蛋白，其包含哺乳動物CKR-3受體蛋白或多肽(如上所述)作為第一基團，與第二基團相連，第二基團并非是自然狀態(tài)下哺乳動物CKR-3受體所有。因此，這個第二基團可能是氨基酸或者多肽。第一基團可能在N端位置，C端位置，或在融合蛋白的內(nèi)部。在一個實施方案里，融合蛋白包含人CKR-3受體作為第一基團，第二基團包含連接序列和親合配體(例如，酶，抗原，附加表位)。
融合蛋白可以用許多不同的方法來制備。例如，一些實施例里將CKR-3基因或其一部分插入一個合適的表達載體，例如BluescriptⅡSK+/-(Stratagene),pGEX-4T-2(Pharmacia),pET-15b(Novagen)。得到的結(jié)構(gòu)體再導(dǎo)入合適的宿主細胞進行表達。表達后，用合適的親合基質(zhì)從細胞裂解液中分離純化融合蛋白[參見，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel,F.M.et al.,eds.Vol.2,Suppl.26,pp.16.4.1-16.7.8(1991))]。另外，親合標記提供了在融合蛋白中檢測CKR-3受體蛋白或多肽的方法。例如，帶有抗原或表位親合標記的融合蛋白在細胞表面表達或者存在于細胞特定部位，能夠用適當?shù)目贵w檢測(見實施例3)。
本發(fā)明也涉及哺乳動物CKR-3受體的分離的和/或重組部分，例如人CKR-3受體的一部分。如在下面詳細描述的那樣，哺乳動物CKR-3受體的部分能夠被制備(合成多肽)，并用來制備抗體。在一個實施方案里，某個哺乳動物CKR-3受體的分離的和/或重組部分(如多肽)，至少有一個免疫特征。如本文中，對受體的一部分而言，所述的免疫特征包括免疫反應(yīng)性(由本發(fā)明中哺乳動物CKR-3受體蛋白或一部分刺激生成的抗體的結(jié)合)，免疫原性(在一個適當免疫方法里誘導(dǎo)抗體反應(yīng))，和/或交叉反應(yīng)性(誘導(dǎo)生成與特定的哺乳動物受體反應(yīng)的抗體)。還可以產(chǎn)生CKR-3受體的帶有哺乳動物的至少一個特有功能的部分，例如結(jié)合活性，信號活性或刺激功能(刺激細胞反應(yīng))。對哺乳動物G蛋白偶連受體的結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，使我們能夠?qū)⒉溉閯游顲KR-3受體劃分為多個功能區(qū)域[參見，Lefkowitz etal.,J.Biol.Chem.,263:4993-4996(2988)；Panayotouand Waterfield,Curr.Opinion Cell Biol.,1:167-176(1989)]。能夠生成帶有受體的全部或部分功能的部分體，或者是這樣的部分體，當其在與另外的第二受體部分結(jié)合(其全部，部分，或本身無功能)時，組建的功能蛋白帶有一個哺乳動物CKR-3特有的功能(配體、抑制劑或促進劑的結(jié)合功能)。[參見，例如，Sledziewski et al.，U.S.Patent No.5,284,746中關(guān)于在檢測某待測樣品配體的存在時，構(gòu)建該結(jié)構(gòu)體并使用雜交G蛋白偶連受體)。制備重組哺乳動物CKR-3受體的方法本發(fā)明另一方面涉及哺乳動物CKR-3受體或其部分體的制備方法。也提供了適于哺乳動物CKR-3受體或其部分體的表達的結(jié)構(gòu)體。該結(jié)構(gòu)體可以被導(dǎo)入適當?shù)乃拗骷毎校磉_重組哺乳動物CKR-3受體的細胞能夠被分離出來，并在培養(yǎng)基中生長。這種細胞有多種用途，例如制備特異蛋白，分離和/或純化，在結(jié)合實驗中用來檢測配體、抑制劑或促進劑。合適的宿主細胞可以是原核細胞，包括細菌如E.coli,B.subtilis，和其他合適的細菌，或真核細胞，如真菌和酵母細胞(例如，Pichia pastoris,Aspergillu species,Saccharomyces cerevisiae,Schizosaccharomyces pombe,Neurospora crassa)，或其他低等真核生物和再高一點的真核細胞如昆蟲細胞(Sf9昆蟲細胞)或哺乳動物細胞[293細胞，中國倉鼠卵巢細胞(CHO)]。[參見，例如，Ausubel,F.M.et al.,eds.Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons Inc.,(1993)]。也還提供了制備哺乳動物趨化因子受體3蛋白或其局部的方法，該方法包括在適于核酸表達的條件下，培養(yǎng)帶有編碼所述受體及其功能局部的重組核酸的宿主細胞，表達編碼的蛋白質(zhì)，制備所述受體或局部。
產(chǎn)生重組哺乳動物CKR-3受體、其局部、或融合蛋白的宿主細胞也能制備。編碼全部或局部重組哺乳動物CKR-3受體或融合蛋白的核酸，能夠被插入到核酸載體中，例如DNA載體，例如質(zhì)粒，病毒或其他適于表達的復(fù)制子。許多載體都是能夠獲得的，包括以單拷貝或多拷貝存在的載體，或者整合到宿主細胞染色體中的載體。
某種CKR-3受體的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯信號，可以被用來指導(dǎo)表達。另外，合適的表達載體能夠獲得到。適于表達全部或局部哺乳動物CKR-3受體或融合蛋白的載體，可包含一些額外的組件，包括但不限于下列的一種或多種復(fù)制起點，可選擇的標志基因，一個或多個表達控制元件，如轉(zhuǎn)錄控制元件(啟動子，增強子，終止子)和/或一個或更多的翻譯信號；一個信號序列或前導(dǎo)序列(由載體、受體或其他來源編碼的膜靶向分子)。
在合適的宿主細胞中可以提供用于表達的啟動子。啟動子可以是組成型的也可以是誘導(dǎo)型的。例如，啟動子可以與編碼受體蛋白全部或局部或融合蛋白的核酸可工作地相連，以便能夠指導(dǎo)所編碼多肽的表達?？梢垣@得的適宜的啟動子有各種原核細胞啟動子(E.coli的lac,tac,T3,T7等啟動子)和真核細胞的啟動子[酵母乙醇脫氫酶(ADH1),SV40,CMV]。
另外，典型的表達載體帶有可選擇的標記，以篩選含有可復(fù)制表達載體的宿主細胞。編碼抗生素或藥物抗性物質(zhì)的基因是經(jīng)常使用的可選擇標記，原核細胞常用(β內(nèi)酰胺酶基因(青霉素抗性)，四環(huán)素抗性的Tet基因)，真核細胞常用(新霉素(G418或基因霉素)，gpt(霉酚酸)，青霉素或潮霉素抗性基因)。二氫葉酸還原酶基因是能夠在多種宿主細胞中用氨甲喋呤進行篩選的。在酵母細胞中經(jīng)常使用營養(yǎng)缺陷型基因為篩選標記(LEU2,URA3,HIS3)。也可使用病毒(桿狀病毒)或噬菌體載體，以及能夠整合到宿主細胞基因組的載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒。本發(fā)明也涉及帶有這些表達載體的細胞。
當編碼受體蛋白或多肽的核酸插入到載體中，與這些元件中一個或多個可工作地相連，所得結(jié)構(gòu)體再導(dǎo)入宿主細胞，在適于表達的條件下生長，則產(chǎn)生受體蛋白或多肽。用適合選定的宿主細胞的方法導(dǎo)入結(jié)構(gòu)體(轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染，電滲透，傳染)。為產(chǎn)生受體，在適于表達的條件下培養(yǎng)帶有結(jié)構(gòu)體的宿主細胞，例如存在誘導(dǎo)劑，補充有適當鹽、生長因子、抗生素、營養(yǎng)補充劑的培養(yǎng)基等?？贵w本發(fā)明進一步涉及與CKR-3受體或其局部反應(yīng)的抗體。在一個實施方案里，對抗于分離的和/或重組的哺乳動物CKR-3受體蛋白或其局部(例如，一個肽)而產(chǎn)生抗體。在一個更好的實施方案里，抗體特異性結(jié)合CKR-3受體(CCR3)或其部分。本發(fā)明也包括能夠抑制哺乳動物特有的一個或多個功能的抗體，如結(jié)合活性、信號活性、和/或細胞反應(yīng)的激活，例如，抗體能夠抑制配體(一個或多個配體)與CKR-3(CCR3)的結(jié)合和/或一個或多個應(yīng)答于配體由CKR-3(CCR3)介導(dǎo)的功能。例如，單克隆抗體7B11能夠抑制趨紅素、RANTES、MCP-2、MCP-3、MCP-4與人CKR-3(CCR3)的結(jié)合。7B11能夠進一步抑制人CKR-3(CCR3)介導(dǎo)的功能，包括趨化因子誘導(dǎo)的鈣離子流、嗜伊紅粒細胞和嗜堿細胞的趨化性、組胺及其他粒物質(zhì)的釋放。因此本發(fā)明一個實施方案中的抗體，具有與哺乳動物趨化因子受體3蛋白或其局部的結(jié)合特異性，此抗體抑制配體與受體的結(jié)合，抑制伴隨配體結(jié)合受體出現(xiàn)的功能。
在一個特別優(yōu)選的實施方案里，本發(fā)明的抗體具有針對人CKR-3(CCR3)的特異性，以及類似于鼠7B11單克隆抗體的抗原表位特異性。帶有類似于鼠7B11單克隆抗體的抗原表位特異性的抗體，能夠根據(jù)其與鼠7B11競爭結(jié)合人CCR3(例如，人CCR3攜帶細胞，如嗜伊紅粒細胞、嗜堿細胞、本發(fā)明核酸轉(zhuǎn)染的細胞)的能力來鑒定。
本發(fā)明的抗體可以是多克隆的或單克隆的(參見實施例5)，術(shù)語抗體一詞的意思指的是包括單克隆和多克隆二者。本發(fā)明的抗體可以對抗于適當免疫原而產(chǎn)生，免疫原包括本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽，如分離和/或重組的人CKR-3受體蛋白或其局部，或者合成分子，如合成多肽。另外，受體表達細胞，如轉(zhuǎn)染細胞能夠用做免疫原或用來篩選結(jié)合受體的抗體[參見例如，Chuntharapai et al.,J.Immunol.152:1783-1789(1994)]。
用適當?shù)募夹g(shù)能夠制備免疫抗原、多克隆和多克隆抗體。已經(jīng)介紹了多種方法[參見，例如，Kohler et al.,Nature,256:495-497(1975)and Eur.J.Immunol.6:511-519(1976)；Milstein etal.,Nature 266:550-552(1977)；Koprowski et al.,U.S.Patent No.4,172,124；Harlow,E.and D.Lane,1988,Antibodies:A LaboratoryManual,(Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY)；Current Protocols In Molecular Biology,Vol.2(Supplement27,Summer＇94),Ausubel,F.M.et al.,Eds.,(John Wiley&Sons:NewYork,NY),Chapter11,(1991)]。通常，將一永生細胞株(如骨髓瘤細胞株SP2/0)和產(chǎn)生的抗體細胞相融合而生成雜合子。抗體產(chǎn)生細胞，尤其是脾臟和淋巴結(jié)的抗體產(chǎn)生細胞，是從用目標抗原免疫過的動物獲得的，用選擇性培養(yǎng)條件可以分離融合細胞(雜合子)，通過限制稀釋度來克隆。用適當?shù)姆椒?例如，ELISA)能夠篩選預(yù)期特異性的抗體產(chǎn)生細胞。
本發(fā)明和術(shù)語“抗體”也包括單鏈抗體、嵌合的、人化的或靈長目化(CDR-移植)的抗體，以及嵌合的或CDR-移植的單鏈抗體。這些抗體的不同部分能夠用常規(guī)技術(shù)化學(xué)性地相互連接起來，或者用基因工程技術(shù)制備成鄰接蛋白。例如，編碼嵌合的或人化鏈的核酸能夠表達產(chǎn)生一種鄰接蛋白[參見，例如，Cabilly etal.,U.S.Patent No.4,816,567；Cabilly et al.,European Patent No.0,125,023B1；Boss et al.,U.S.Patent No.4,816,397；Boss et al.,European Patent No.0,120,694 B1；Neuberger,M.S.et al.,WO86/01533；Neuberger,M.S.et al.,European Patent No.0,194,276B1；Winter,U.S.Patent No.5,225,539；and Winter,European Patent No.0,239,400B1.參見Newman,R.et al.,BioTechnology,10:1455-1460(1992)，涉及靈長化的抗體，and Ladner et al.,U.S.Patent No.4,946,778and Bird,R.E.et al.,Science,242:423-426(1988)關(guān)于單鏈抗體]。
另外，也能夠制備抗體的功能片段，包括嵌合的、人化的、靈長目化的或單鏈抗體。上述抗體的功能片段保留他們起源的完整長度抗體的至少一個結(jié)合功能和/或調(diào)節(jié)功能。較好的功能片段保留了對應(yīng)全長抗體的抗原結(jié)合功能[例如，對哺乳動物CKR-3(CCR3)特異性]。更好的功能片段保留了對一個或多個哺乳動物CKR-3(CCR3)特有功能的抑制作用，如結(jié)合活性、信號活性、和/或細胞反應(yīng)刺激活性。例如，在一個實施例里，一個功能片段能夠抑制CKR-3(CCR3)與他的一個或多個配體(趨紅素、RANTES、MCP-2、MCP-3、MCP-4)相作用和/或能夠抑制一個或多個受體-介導(dǎo)的功能，如趨化因子結(jié)合CKR-3(CCR3)所誘導(dǎo)的嗜伊紅粒細胞、嗜堿細胞趨化反應(yīng)和/或脫粒作用。例如，本發(fā)明中能夠結(jié)合哺乳動物CKR-3受體或其局部的抗體片段，包括但不僅僅局限于Fv,Fab,Fab’,F(ab’)2片段。這種片段能夠用酶切或重組技術(shù)生成。例如，胰蛋白酶或木瓜蛋白酶切分別能夠生成Fab,F(ab’)2片段。也可以多種截斷方式生成抗體，所用的抗體基因在天然終止位點的上游導(dǎo)入了一個或多個終止密碼子。例如，一個編碼F(ab’)2重鏈的嵌合基因能被設(shè)計成帶有編碼重鏈CH1區(qū)和鉸鏈區(qū)的DNA。
這里所用的術(shù)語“人化免疫球蛋白”是指包含不同來源免疫球蛋白部分的免疫球蛋白，其中至少一個部分是人源的。本發(fā)明涉及一個具有哺乳動物CCR3結(jié)合特異性(人CCR3)的人化免疫球蛋白，所指免疫球蛋白包括一個非人源(嚙齒類)抗原結(jié)合區(qū)和至少一部分人源免疫球蛋白(人框架區(qū)、人恒定區(qū)或其局部)。例如，人化抗體包括帶有所需特異性的非人源免疫球蛋白部分，如鼠，包括人源免疫球蛋白部分(嵌合的免疫球蛋白)，用常規(guī)化學(xué)方法使相連(合成)，或用基因工程技術(shù)(編碼嵌合抗體蛋白質(zhì)部分的DNA能表達產(chǎn)生鄰接多肽鏈)制備成鄰接多肽。本發(fā)明人化免疫球蛋白的另一個例子是包含有一或多個非人源CDR免疫球蛋白鏈(一個或多個非人源抗體的CDR)和一人源輕和/或重鏈框架區(qū)(有或沒有框架區(qū)改變的CDR-移植抗體)。在一個實施例中，人化免疫球蛋白能夠與鼠7B11單克隆抗體競爭結(jié)合人CCR3(人CCR3產(chǎn)生細胞，如嗜伊紅粒細胞、嗜堿細胞或用本發(fā)明中核酸轉(zhuǎn)染的細胞)。在一個更好的實施例里，人化免疫球蛋白的抗原結(jié)合區(qū)來源于7B11單克隆抗體。人化免疫球蛋白也包括嵌合的或CDR-移植的單鏈抗體[參見，例如，Cabilly et al.,U.S.Patent No.4,816,567；Cabilly et al.,EuropeanPatent No.0,125,023B1；Queen et al.,European Patent No.0,451,216B1；Boss et al.,U.S.Patent No.4,816,397；Boss et al.,European Patent No.0,120,694 B1；Neuberger,M.S.et al.,WO86/01533；Neuberger,M.S.et al.,European Patent No.0,194,276 B1；Winter,U.S.Patent No.5,225,539；and Winter,European Patent No.0,239,400B1.(參見Newman,R.et al.,BioTechnology,10:1455-1460(1992))，涉及靈長化的抗體，and Ladner et al.,U.S.PatentNo.4,946,778and Bird,R.E.et al.,Science,242:423-426(1988)關(guān)于單鏈抗體]。
本發(fā)明的抗體有多種用途，包括研究、診斷和治療。在一個實施例里，抗體用合適的標記物標記(熒光標記，化學(xué)發(fā)光標記，同位素標記，或酶標記)。例如，能夠用來分離和/純化受體或其局部，以及研究受體結(jié)構(gòu)(構(gòu)型)和功能。
本發(fā)明的抗體也能夠用來在研究和治療中調(diào)節(jié)受體功能。例如，抗體能作為抑制劑來抑制(減輕或防止)(a)與受體結(jié)合(配體，第二個抑制劑或促進劑)，(b)受體信號，(c)和/或刺激功能。作為受體功能抑制劑的抗體能夠直接或間接阻止配體或促進劑的結(jié)合(通過構(gòu)型改變)。例如，通過抑制配體的結(jié)合或通過去敏感作用(聯(lián)合或不聯(lián)合配體結(jié)合的抑制)抗體能夠抑制受體功能。
結(jié)合受體的抗體也能夠作為受體功能的配合劑，引起或刺激受體功能，例如結(jié)合受體后信號和/或刺激受體功能(趨化作用，細胞外滲作用或釋放原炎癥介質(zhì))。
另外，本發(fā)明的多種抗體也能夠用來檢測或測量受體的表達，例如，在白細胞上，如嗜伊紅粒細胞、嗜堿細胞和淋巴細胞，或在受體基因轉(zhuǎn)染的細胞上。如此，他們也能夠用于為診斷或研究目的的細胞分類(細胞流計，熒光激活的細胞分類)。
也提供了抗獨特型抗體，抗獨特型抗體能夠識別另一個抗體的抗原結(jié)合位點的抗原決定簇。通過免疫一個相同種類動物能夠制備對抗第二個抗體的抗獨特型抗體，最好使用與產(chǎn)生第二個抗體的動物相同種的動物。還提供了抗獨特型抗體。抗-獨特型抗體識別與另外抗體的抗原結(jié)合位點相關(guān)的抗原決定族?？梢栽谕N動物中免疫制備針對第二抗體的獨特型抗體，優(yōu)選與產(chǎn)生第二抗體的動物相同的動物。參見美國專利第4,699,880號。
在一個實施例里，對抗受體或其局部而產(chǎn)生抗體，然后用這些抗體來制備抗獨特型抗體。因此抗獨特型抗體能夠與可結(jié)合受體的物質(zhì)相結(jié)合，例如，受體功能的配體、抑制劑、促進劑，能夠在免疫實驗中用來檢測或鑒別或定量這些物質(zhì)。盡管他本身不結(jié)合受體，這種抗獨特型抗體也能夠作為受體功能的抑制劑。
抗獨特型抗體(抗-Id)本身還可以用來生成另一個抗獨特型抗體(抗-抗-Id)。這樣的一個抗體在特異性上相同或相似于起始用來免疫的抗體。在一個實施例里，阻止抗體結(jié)合受體的抗體拮抗物能夠用來生成抗-Id，抗-Id再用來生成抗-抗-Id，后者具有相同或類似于抗體拮抗物的特異性。能夠評估這些抗-抗-Id對受體功能的抑制效果，以判別是否拮抗物。
除嵌合的或CDR-移植的單鏈抗獨特型抗體，也能夠制備單鏈，和嵌合的，人化或靈長目化(CDR-移植)的單鏈抗獨特型抗體，也包括在抗獨特型抗體的范圍之內(nèi)，這種抗體的抗體片段也能夠制備。受體功能的配體、抑制劑、促進劑的鑒定正如這里所用的，配體是結(jié)合受體蛋白質(zhì)的物質(zhì)。某種哺乳動物CKR-3受體的配體是結(jié)合該哺乳動物受體的物質(zhì)。在一個實施例里，配體能夠選擇性地結(jié)合兩個或更多哺乳動物趨化因子受體，包括CKR-3。在一個更好的實施例里，配體以高親合力結(jié)合哺乳動物CKR-3受體的配體。所謂配體實質(zhì)是這樣一些物質(zhì)，包括但不僅僅局限于，天然配體，分離的和/或純化的，合成的，和/或重組的，天然配體的類似物(來自其他哺乳動物)，抗體，這些分子的局部，以及結(jié)合受體的其他物質(zhì)。特定哺乳動物受體的天然配體能夠在生理條件下結(jié)合受體，和哺乳動物CKR-3受體的配體相類似。所謂配體除了包括結(jié)合受體但沒有抑制劑或促進劑功能的物質(zhì)外，還包括受體活性的抑制劑或促進劑。
這里所用的抑制劑是指至少抑制哺乳動物C-C趨化因子受體(哺乳動物CKR-3受體)特有的一種功能的抑制劑，例如結(jié)合活性(配體、抑制劑、促進劑的結(jié)合)，信號活性(活化哺乳動物G蛋白，誘導(dǎo)細胞質(zhì)中自由鈣離子濃度[Ca2+]i在瞬間迅速升高)，和/或刺激細胞反應(yīng)。所謂抑制劑是指這樣一些物質(zhì)，包括結(jié)合受體的拮抗物(一個抗體或其局部，天然配體的突變體，配體結(jié)合的別的競爭性抑制劑)，以及不結(jié)合受體但能夠抑制受體功能的物質(zhì)(抗獨特型抗體)。
這里所用的促進劑是指至少促進哺乳動物C-C趨化因子受體(哺乳動物CKR-3受體)特有的一種功能的促進劑，例如結(jié)合活性(配體、抑制劑、促進劑的結(jié)合)，信號活性(活化哺乳動物G蛋白，誘導(dǎo)細胞質(zhì)中自由鈣離子濃度[Ca2+]i在瞬間迅速升高)，和/或刺激細胞反應(yīng)。所謂抑制劑是指這樣一些物質(zhì)，包括結(jié)合受體的加強物(一個抗體，其他種類天然配體的類似物)，以及不結(jié)合受體但能夠促進受體功能的物質(zhì)(通過活化一個伴隨蛋白質(zhì))。
下面將要介紹的，依賴于本發(fā)明核酸或蛋白質(zhì)的實驗，能夠單獨使用或者聯(lián)合其他方法一起使用，用來鑒定哺乳動物CKR-3受體蛋白或多肽的配體、抑制劑、促進劑。人CKR-3在細胞內(nèi)的水平不適于高通量的檢測；因此，含有并表達本發(fā)明中核酸的細胞，十分有利于鑒定人CKR-3受體蛋白或多肽的配體、抑制劑、促進劑。
從一個哺乳動物分離CKR-3受體基因，再整合到表達系統(tǒng)內(nèi)，生成上述的受體蛋白或多肽。分離和/或重組的受體蛋白或多肽，例如帶有本發(fā)明核酸的結(jié)構(gòu)體穩(wěn)定或瞬間轉(zhuǎn)染的細胞所表達的受體，或者包含受體的細胞片段(轉(zhuǎn)染細胞的膜片段)，能夠用在受體功能的檢測實驗中。如果需要，受體還能夠進一步純化，受體功能的檢測實驗可以在離體培養(yǎng)或在活體培養(yǎng)中進行。
分離的、重組的哺乳動物CKR-3受體蛋白，例如圖1A-1C所示人CKR-3受體蛋白(SEQ ID NO:2)，圖2A-2B(SEQ IDNO:4)或SEQ ID NO:6，都能夠用在本方法中，用此法或其他技術(shù)監(jiān)測受體功能來評估一個化合物的效果。例如，穩(wěn)定或瞬間的轉(zhuǎn)染子，A31/293/#20穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子(見例9)，鼠L1-2前B細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子(見實施例3)，桿狀病毒感染的Sf9細胞(見實施例4)，能夠用于結(jié)合實驗。鼠L1-2前B細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子或其他有趨化性的細胞能夠用于趨化性實驗(實施例3)。
根據(jù)本發(fā)明的方法，化合物可以單個的篩選，一個或多個化合物的實驗可以同時進行。檢測化合物的混合物時，用此法選擇出化合物、分離并用合適的方法鑒定(PCR、測序、色譜法)。待測樣品中若含有一個或多個化合物(配體、抑制劑、促進劑)，也能夠用此法測定。
用結(jié)合的化學(xué)合成或別的方法生成的大的連接的化合物文庫(有機物，重組或合成的多肽、“類多肽”，核酸)也能夠被檢測[參見，例如，Zuckerman,R.N.et al.,J.Med.Chem.,37:2678-2685(1994)and references cited therein；Ohlmeyer,M.H.J.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10922-10926(1993)and DeWitt,S.H.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6909-6913(1993)；relating to tagged compounds；Rutter,W.J.et al.U.S.Patent No.5,010,175；Huebner,V.D.et al.,U.S.Patent No.5,182,366；andGeysen,H.M.,U.S.Patent No.4,833,092]。用本法從連接文庫中篩選的化合物帶有獨特的標記，用色譜法鑒定個別化合物是可能的。
在于一個實施例里，運用了噬菌體顯示法，例如受體與噬菌體接觸(一個噬菌體或文庫這種的噬菌體群落)，在適于受體結(jié)合(在合適的結(jié)合緩沖液)的條件下顯示多肽。用標準技術(shù)或其他合適的方法選擇出與受體結(jié)合的噬菌體。用洗脫液將噬菌體從受體分離開。例如離子強度或pH的改變能夠引起噬菌體的釋放。洗脫液或者也可以含有釋放組分，或?qū)⒔M分設(shè)計成能夠破壞化合物的結(jié)合(一個或多個能夠破壞顯示多肽與受體結(jié)合的化合物，如競爭性抑制結(jié)合的配體、抑制劑、促進劑)。篩選過程可以重復(fù)進行，另一個篩選步驟可以用來進一步富集結(jié)合受體的噬菌體。鑒定被顯示的多肽(通過噬菌體DNA測序)，所鑒定的多肽能夠被制備并進一步檢測其配體結(jié)合功能，抑制劑和/或促進劑功能。能夠生成這種多肽的類似物，具有提高的穩(wěn)定性或別的性能。
在另一個實施例里，可以生成一種可表達并顯示融合蛋白的噬菌體，這種融合蛋白含有一個隨機序列核酸編碼N端肽的外被蛋白。表達本發(fā)明受體蛋白或多肽的宿主細胞，與噬菌體接觸，篩選、回收并鑒定被結(jié)合的噬菌體。[參見，例如，Doorbar,J.and G.Winter,J.Mol.Biol.,244:361(1994)討論了與G蛋白-偶聯(lián)受體一起使用的噬菌體顯示方法]。
哺乳動物CKR-3受體的配體、抑制劑、促進劑的其他潛在的來源，包括但不僅僅局限于，別的趨化因子類物質(zhì)；其他趨化因子(趨紅素)，如作為受體的來自于同中哺乳動物的哺乳動物趨化因子，來自其他哺乳動物的趨化因子(對于人受體，非人來源的人趨化因子類似物)；其他趨化因子的變體，如天然發(fā)生的，合成的或重組的變體；其他哺乳動物CKR-3受體的配體、抑制劑、促進劑(抗體，拮抗物，支持物)，及其變體；其他G-蛋白偶連的受體配體、抑制劑和/或促進劑(拮抗物或支持物)；哺乳動物CKR-3受體的可溶解部分，例如合適受體多肽或能夠抑制受體功能的類似物(參見，例如，Murphy,R.B.,WO94/05695)。
本發(fā)明的體外培養(yǎng)方法能夠用于高通量篩選，這些實驗適于大批量的樣品(96孔模式)。對于這種篩選，由于分離嗜伊紅粒細胞的困難性，采用表達受體的宿主細胞而不是分離的嗜伊紅粒細胞。
對于結(jié)合實驗，優(yōu)選宿主細胞有高水平的受體表達。能夠用多種方法監(jiān)測受體表達，利用本發(fā)明中結(jié)合受體或其局部的抗體監(jiān)測表達。也有可供商品抗體用來檢測抗原的表達，或帶有受體蛋白或多肽的表位標記融合蛋白(FLAG標記的受體；見實施例3)。結(jié)合實驗分離和/或重組的受體蛋白，其局部，或本發(fā)明融合蛋白，可用來選擇和鑒定結(jié)合(一個或多個)哺乳動物CKR-3受體蛋白的化合物，如人CKR-3受體蛋白，和配體或受體活性潛在的抑制劑或促進劑。該法篩選的化合物包括配體、抑制劑、促進劑，能夠進一步評估其對受體功能和/或治療用途的抑制或刺激效果。
在一個實施例里，結(jié)合一個有活性的，分離的和/或重組的哺乳動物CKR-3受體蛋白或多肽的化合物，可以用該法鑒定。在本實施例里，所用受體蛋白或多肽至少帶有一個CKR-3受體特有的功能，例如信號功能(哺乳動物G蛋白的活化)，刺激功能(刺激趨化因子或釋放炎癥介質(zhì))，和/或結(jié)合功能(配體、抑制劑、促進劑的結(jié)合)。在更好的實施例里，分離和/或重組的哺乳動物CKR-3受體蛋白或多肽具有配體結(jié)合功能，以便結(jié)合受體的天然配體。
例如，分離的和/或重組的哺乳動物CKR-3受體蛋白或多肽能夠在適于結(jié)合的條件下保存，受體與待測化合物結(jié)合，結(jié)合是可檢測可度量的。因此提供了一種檢測哺乳動物趨化因子受體3蛋白或其局部的配體的方法，包括在適于結(jié)合配體的條件下將待測化合物與有活性的、分離的哺乳動物趨化因子受體3蛋白結(jié)合，并檢測或度量所謂化合物和活性分離的蛋白質(zhì)的復(fù)合物的構(gòu)型。在一個實施例里，受體蛋白質(zhì)表達于穩(wěn)定或瞬間轉(zhuǎn)染的細胞，用包含編碼本發(fā)明受體的核酸序列的結(jié)構(gòu)體轉(zhuǎn)染。在適于受體表達的條件下培養(yǎng)細胞。在適于結(jié)合的條件下(在合適的結(jié)合緩沖液里)細胞與化合物接觸，用標準技術(shù)檢測這種結(jié)合。相應(yīng)的，提供了一種鑒定哺乳動物趨化因子受體3蛋白或其局部的配體的方法，包括步驟(a)在適于結(jié)合配體的條件下將待測化合物與有活性的、分離的哺乳動物趨化因子受體3蛋白結(jié)合，(b)檢測或度量所謂化合物和活性分離的蛋白質(zhì)的復(fù)合物的構(gòu)型。為測量結(jié)合，結(jié)合的意義范圍有所用對照決定(在沒有化合物存在下由于背景比較，與第二化合物(標準)的結(jié)合進行比較，與化合物結(jié)合未轉(zhuǎn)染細胞進行比較)。帶有受體的細胞片段如膜碎片可用來代替完整細胞(見實施例9)。
在一個實施例里，用合適的標記物標記化合物(熒光標記，同位素標記)，通過檢測標記來決定結(jié)合。結(jié)合特異性可以用競爭或替換實驗來評價，例如用未標記化合物或第二配體作為競爭劑。
哺乳動物受體的配體包括來自同種哺乳動物或其他種類哺乳動物的天然配體，用這種方法可以鑒定。用這種配體結(jié)合實驗也能夠評價促進劑或抑制劑的結(jié)合活性。
結(jié)合抑制實驗也能夠用來鑒定配體、抑制劑、促進劑，都是結(jié)合受體并阻止別的化合物如配體的結(jié)合。在一個實施例里，本發(fā)明涉及一種鑒定哺乳動物趨化因子受體3蛋白或其局部的抑制劑的方法，包括步驟(a)在存在配體適于配體結(jié)合的條件下將待測化合物和表達活性重組哺乳動物趨化因子受體3蛋白的宿主細胞結(jié)合；和(b)檢測或度量所謂化合物和活性分離的蛋白質(zhì)的復(fù)合物的構(gòu)型。例如，在結(jié)合實驗里檢測或測量，與第二化合物存在下第一化合物的結(jié)合相比較，(沒有第二化合物存在下)第一化合物的結(jié)合的減少。受體可以和第一化合物第二化合物同時接觸，或者一個接一個，不論先后。第二化合物存在下，第一化合物的結(jié)合范圍的減少說明第二化合物對結(jié)合的抑制。例如，第一化合物的結(jié)合可能被減少或取消。
在一個實施例里，用第二化合物直接抑制第一化合物(一種趨化因子如RANTES)與人CKR-3受體的結(jié)合。例如可以指示某種化合物去抑制125I-標記的MCP-3或125Ⅰ-標記的RANTES結(jié)合人CKR-3。這種實驗可以用完整細胞(嗜伊紅粒細胞，或帶有編碼人CKR-3受體核酸的細胞系)，也可以用上述細胞的膜片段。
還有鑒定結(jié)合受體的化合物的其他方法，例如檢測受體結(jié)合所引起的事件的方法，事件包括信號功能和/或刺激細胞反應(yīng)(見下)。例如通過檢測可表達活性重組哺乳動物趨化因子受體3蛋白的宿主細胞應(yīng)答于配體結(jié)合所發(fā)生的信號活性或細胞反應(yīng)，來檢測結(jié)合。
可以理解本發(fā)明抗體的抑制效果可以通過結(jié)合抑制實驗來評價。在適于抗體結(jié)合的條件下，也能用這種方法評價抗體之間對于受體結(jié)合的競爭，實驗中第一化合物就是另一個抗體。
除了受體結(jié)合抑制劑(拮抗物)和促進劑(支持物)外，用這種方法鑒定的配體能夠被進一步評價是否繼結(jié)合之后抑制或激活CKR-3受體其他功能，和/或評價他們的治療功能。信號實驗配體或促進劑例如支持物的結(jié)合將導(dǎo)致G蛋白偶連受體的信號發(fā)生，G蛋白的活性的激活。用任何合適的方法檢測化合物對信號功能的誘導(dǎo)作用。例如，G蛋白活性，GTP水解成GDP，或由受體結(jié)合引起的后續(xù)信號事件，如誘導(dǎo)細胞質(zhì)中游離鈣離子濃度[Ca2+]i迅速而短暫的升高，也能夠用本法或其他合適的方法來評價[參見，例如，Neote,K.et al.,Cell,72:415-425(1993)；VanRiper et al.,J.Exp.Med.,177:851-856(1993)；Dahinden,C.A.etal.,J.Exp.Med.,179:751-756(1994)]。
Sledziewski等人的用雜交G蛋白偶連受體進行的功能實驗，也能夠用來檢測配體或促進劑的受體結(jié)合與激活G蛋白能力(Sledziewski et al.,U.S.Patent No.5,284,746，該文獻中的教導(dǎo)都通過在此引述而合并于本文)。
監(jiān)測(結(jié)合雜交受體引起的)宿主細胞的生物學(xué)反應(yīng)，檢測到反應(yīng)說明待測樣品中有配體存在。Sledziewski et al描述了一種檢測待測樣品中配體存在的方法，其中的配體是能夠被受體上配體結(jié)合區(qū)域結(jié)合的化合物。在本方法的一個實施例里，酵母細胞用一個能夠指導(dǎo)生物活性雜交G蛋白偶連受體(融合蛋白)合成的DNA結(jié)構(gòu)體轉(zhuǎn)化。雜交受體包括哺乳動物G蛋白偶連受體，其中至少一個非配體結(jié)合區(qū)被酵母G蛋白偶連受體相應(yīng)的區(qū)域代替，如STE2基因產(chǎn)物。培養(yǎng)帶有結(jié)構(gòu)體的酵母宿主細胞，表達雜交受體，在適于配體結(jié)合雜交受體的條件下，細胞與待測樣品接觸。如本文所述進行實驗，檢測(由結(jié)合雜交受體引起的)宿主細胞的生物應(yīng)答，檢測到應(yīng)答說明有信號功能。
在一個實驗里STE2基因產(chǎn)物雜交受體的結(jié)合，導(dǎo)致BAR1啟動子的誘導(dǎo)。啟動子的誘導(dǎo)通過報道基因(β-gal)的方法來測定，報道基因被連接于BAR1啟動子在第二結(jié)構(gòu)體導(dǎo)入宿主細胞。通過細胞裂解液的離體酶學(xué)檢測或者通過培養(yǎng)基中有報告物(X-gal)的培養(yǎng)皿上蘭色菌落的存在，可以檢測報告基因的表達。
在另一個實施例里，實驗用來鑒定受體功能的潛在抑制劑。用實驗中的配體或促進劑測定化合物的抑制活性，評價化合物對由配體或促進劑引起的活性的抑制作用。
多種已知配體也能夠用來檢查對G偶連蛋白活性刺激功能的降低(減少的活性或無活性)。該實施例里，盡管化合物有配體結(jié)合活性，參與到受體不引起或僅僅微弱引起G偶連蛋白活性，這種化合物是潛在的拮抗物，并施與進一步的實驗。例如，在一個配體或促進劑存在下進行同樣的實驗，評價該化合物對配體或促進劑活性的抑制作用。趨化性和細胞激活性能的實驗趨化性實驗也能夠用來檢測受體功能，這些實驗是基于在離體或活體內(nèi)化合物誘導(dǎo)的功能性遷移，能夠用于評價配體、抑制劑、促進劑的結(jié)合和/或趨化效果。離體透內(nèi)皮趨化性實驗的使用被描述于實施例1,Springer等人描述了一種透內(nèi)皮趨化性實驗[Springer et al.,WO 94/20142，發(fā)表于1994年9月15日，該文獻的教導(dǎo)通過在此引述而合并于本文，還可以參見Berman,etal.,Immunol Invest.17:625-677(1998)]。透過內(nèi)皮遷入膠原蛋白膠也有描述[Kavanaugh et al.,J.Immunol,146:4149-4156(1991)]。鼠L1-2前B細胞穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子或有趨化性的宿主細胞能夠用在趨化性實驗(見例如實施例3)。
通常，趨化性實驗檢測合適細胞(如白細胞(淋巴細胞、嗜伊紅粒細胞、嗜堿細胞))直接運動或遷移進入或穿過屏障(內(nèi)皮，過濾器)，至化合物升高的水平，從屏障第一表面到相對的第二表面。膜或過濾器是常規(guī)的屏障，便于檢測合適細胞直接運動或遷移進入或穿過屏障，至化合物升高的水平，從屏障第一表面到相對的第二表面。一些實驗里，膜外被一種便于黏附的物質(zhì)，如ICAM-1，纖維黏附素或膠原蛋白。
例如，在一合適容器里可以檢測或測量細胞的遷移，從第一室進入或穿過微孔膜再進入包含有待測化合物的第二室，第一室與第二室之間以膜相隔。合適的膜有對應(yīng)于化合物的適當?shù)目壮叽?，以檢測特異的遷移，包括硝酸纖維素、多糖。可以使用大約3-8微米的孔徑，最好是5-8微米的孔徑?？讖娇梢允侨拷y(tǒng)一的或者在一定范圍內(nèi)。
為評價遷移，遷入過濾器的距離，穿過過濾器并黏附于過濾器第二表面的細胞數(shù)，和/或積聚于第二室的細胞數(shù)，都可以用標準技術(shù)來測定(顯微鏡)。在一個實施例里，細胞用一可探測標記物標記(放射性同位素，熒光標記，抗原或抗原表位標記)，通過檢測黏附于膜和/或存在于第二室的標記來評價遷移(檢測放射活性，熒光強度，免疫檢查)。能夠確定化合物誘導(dǎo)的相對于合適對照的遷移范圍。(和沒有化合物存在確定的背景遷移比較，第二化合物誘導(dǎo)的遷移范圍(標準)，和化合物誘導(dǎo)的未轉(zhuǎn)化細胞的遷移范圍)。
室可以用多種固體材料制作，如塑料、玻璃、聚乙烯等。可從室剝離的膜如Biocoat或Transwell膜，是便于計數(shù)黏附細胞。
在容器里，膜擺放的位置是膜能夠和第一室里含細胞的液體接觸，也能夠和第二室液體接觸。除待測化合物，或為檢測目的的額外配體，抑制劑，促進劑外，膜兩邊的液體最好相同。室內(nèi)液體可以包含有助提高穩(wěn)定性或抑制細胞和/或培養(yǎng)基非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)溶液(牛血清白蛋白，小牛血清，人血清白蛋白)。
在一個更好的實施例里，尤其對于嗜伊紅粒細胞、嗜伊紅粒細胞樣細胞、淋巴細胞、表達CKR-3受體的細胞，檢測其透內(nèi)皮遷移。優(yōu)選透內(nèi)皮遷移檢測。這些檢測是更好的生理模型，因為他們最接近活體內(nèi)條件，白細胞穿過排布于管壁的內(nèi)皮細胞層，從血管向組織中有趨化因子的炎癥部位遷移。另外，透內(nèi)皮檢測有較低的背景(信噪比)。
在這個實施例里，評價了穿過內(nèi)皮細胞層的遷移。為了制備細胞層，可以在微孔濾器或膜上培養(yǎng)內(nèi)皮細胞，可能外被一些物質(zhì)如膠原蛋白，纖維黏附素或其他胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，便于內(nèi)皮細胞的依附.培養(yǎng)內(nèi)皮細胞直至形成豐富的單細胞層，多種哺乳動物細胞能夠形成單細胞層，包括靜脈，動脈，毛細血管內(nèi)皮細胞，如人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Clonetics Corp.San Diego,CA)或合適的細胞株如ECV304。為檢測對于特定哺乳動物受體的應(yīng)答趨化，最好使用同種哺乳動物的內(nèi)皮細胞；然而也有使用異種或異屬的哺乳動物的內(nèi)皮細胞。
總體來說，實驗是通過檢測細胞遷向或穿過濾膜的定向遷移，從濾器第一表面向背面的第二表面，化合物的濃度逐漸升高，濾器在第一表面上有內(nèi)皮細胞層。定向遷移是從第一表面附近區(qū)域進入或穿過膜，遷向位于濾器背面的化合物。第二表面附近區(qū)域的化合物濃度高于第一表面附近區(qū)域。
在一個實施例里，趨化因子被用來檢驗化合物的配體或促進劑的活性，含有能夠遷移和表達哺乳動物CKR-3受體的化合物置于第一室，含有待測化合物的混合物置于第二室，第一室里最好沒有可誘導(dǎo)細胞趨化反應(yīng)的其他配體或促進劑存在，但是可以有一個或多個有趨化吸引功能的配體或促進劑。實驗中能夠結(jié)合受體并有誘導(dǎo)哺乳動物CKR-3受體細胞趨化反應(yīng)的化合物是受體功能的配體或促進劑。
用來檢測抑制劑的實施例里，含有可遷移和表達啊CKR-3哺乳動物受體的化合物置于第一室，含有可誘導(dǎo)第一室細胞趨化反應(yīng)的一個或多個配體或促進劑(有趨化吸引能力)，置于第二室，在將細胞置于第一室之前一點或同時，放置帶有待測化合物的混合物，最好放在第一室。實驗中能夠結(jié)合受體并抑制由哺乳動物CKR-3受體表達細胞的配體或促進劑誘導(dǎo)的趨化反應(yīng)的化合物，是受體功能的抑制劑(激活反應(yīng)的抑制劑)。在待測樣品存在下配體或促進劑誘導(dǎo)遷移范圍的減少，說明有抑制活性(見實施例5)。獨立的結(jié)合實驗將確定抑制作用是待測樣品結(jié)合于受體的結(jié)果，還是通過不同的機制。
下面描述了(見炎癥模型部分)在活體實驗中，將化合物注射到組織中，引起白細胞的滲漏作用。該模型測定了應(yīng)答于配體或促進劑，細胞遷出并向炎癥部位趨化的能力。
除本方法外，還可以用合適的受體表達細胞檢測其對活性受體誘導(dǎo)所作出的細胞應(yīng)答，從而評價配體，抑制劑，促進劑對受體刺激功能的影響效果。類似地，這些實驗也能夠用來確定受體的功能。例如，細胞外滲作用(嗜伊紅粒細胞脫粒作用，導(dǎo)致嗜伊紅粒細胞陽離子蛋白和/或一或多個酶，其他粒組分的釋放；從嗜堿細胞釋放組胺)，炎癥介質(zhì)釋放(生物活性脂類如白三烯的釋放)，呼吸障礙[Rot,A.et al.,J.Exp.Med.,176:1489-1495(1992)]等，都可以用已知的適宜的方法監(jiān)測[Bischoff.S.C.et al.,Eur.J.Immunol.,23:761-767(1993)and Baggliolini,M.and C.A.Dahinden,Immunology Today,15:127-133(1994)以及其中所引述的文獻]。
在一個實施例里，通過檢測脫離過程或細胞外滲中酶類的釋放，鑒定配體，抑制劑，促進劑。帶有本發(fā)明核酸的細胞，所編碼的受體蛋白能夠刺激細胞外滲作用或脫粒作用，在合適的條件和培養(yǎng)基里培養(yǎng)這種細胞，使表達受體誘導(dǎo)脫粒過程。受體與待測化合物接觸，評價釋放的酶類。用適當?shù)臋z測方法檢測或測定釋放到培養(yǎng)基的酶，例如免疫學(xué)檢測，或酶活性的生化檢測。
通過向培養(yǎng)基中(細胞與化合物結(jié)合之前、同時或之后)直接投入檢測成分(底物，協(xié)同因子，抗體)，檢測培養(yǎng)基。也可以在與細胞分離開的培養(yǎng)基上或在實驗前進一步破碎的培養(yǎng)基上進行檢測。
例如，可提供用來分析β-葡萄糖醛酸酶和嗜伊紅粒細胞過氧化物酶等的常規(guī)檢測方法[White,S.R.et al.,A kinetic assay foreosinophil peroxidase activity in eosinophils and eosinophilconditioned media,J.Immunol.Methods,144(2):257-263(1991)]。
一種化合物的脫粒刺激功能說明該化合物是哺乳動物CKR-3受體的配體或促進劑。另一個實施例里，對脫粒過程的抑制說明是抑制劑，這個實施例里，表達受體的細胞與配體或促進劑結(jié)合，在此之前，之后或同時，已經(jīng)加入了待測化合物。炎癥模型已經(jīng)有多種炎癥活體培養(yǎng)模型，可用來檢測活體培養(yǎng)時，配體，抑制劑，促進劑作為治療藥物的效果。
例如已經(jīng)有活體檢測嗜伊紅粒細胞滲透到肺里的原始模型[參見，例如，Wegner,C.D.et al.,Science,247:456(1990)]。在一個實施例里，給予動物一種可與人CKR-3反應(yīng)，也可與靈長目CKR-3交叉反應(yīng)的抗體(如單克隆抗體)。測定一系列參數(shù)以評價活體效果，包括但不僅局限于支氣管肺泡滲出液中嗜伊紅粒細胞數(shù)目，呼吸通暢，呼吸率、氣管過敏癥狀的減少說明有治療效用。
此外，氣喘的綿羊模型，被動皮膚過敏癥的豚鼠模型，或其他模型可用來在活體培養(yǎng)下評價化合物[參見，例如，Weg,V.B.et al.,J.Exp.Med.,177:561(1993)；Abraham,W.M.et al.,J.Clin.Invest.,93:776(1994)]。
向合適動物如鼠，兔，豚鼠皮內(nèi)注射化合物后，檢測白細胞的滲透[參見，例如，Van Damme J.et al.,J.Exp.Med.,176:59-65(1992)；Zachariae,C.O.C.et al.,J.Exp.Med.171:2177-2182(1990)；Jose,P.J.et al.,J.Exp.Med.,179:881-887(1994)]。在一個實施例里，用皮膚活檢來組織學(xué)評價白細胞的滲透(如嗜伊紅粒細胞，粒細胞)。另一個實施例里，給予動物一種有趨化反應(yīng)和滲出作用的標記細胞(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CKR-3受體表達細胞，用111In標記)，應(yīng)答于注射待測樣品(在某種緩沖液或載體里的待測化合物)的細胞滲透作用說明配體或促進劑的存在，例如樣品中支持劑的存在。實驗也可以經(jīng)修改來鑒定趨化反應(yīng)和白細胞滲出作用的抑制劑。例如可以在給予實驗動物配體或支持劑之前，同時或之后，給予一個抑制劑，和沒有抑制劑存在時比較，抑制劑存在下滲透作用范圍的減少說明有抑制效果。診斷用途本發(fā)明還有多種診斷用途，包括但不限于下面所討論的各種用途。
哺乳動物CKR-3受體基因的突變可導(dǎo)致編碼受體至少一個功能的缺陷，降低或加強了受體功能。例如，產(chǎn)生受體變體或改變表達水平的突變型，能夠降低或增強受體功能，能夠降低或增強受體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
例如，檢測或測量受體功能的方法可以用來鑒定個別細胞(白細胞)中受體的活性或從該細胞分離受體的活性。在這些實驗里，能夠評價受體功能的降低或增強。
本發(fā)明的核酸提供了篩查，鑒定和/或分離一種缺陷的哺乳動物CKR-3受體基因的試劑，該基因編碼的受體有降低或升高的活性，可以采用篩查缺陷基因的標準方法。缺陷基因及其編碼受體的活性可被分離并表達于合適的宿主細胞，用于進一步評價哺乳動物CKR-3受體。許多人類疾病都伴有G蛋白偶連受體功能的缺陷[Clapham,D.E.,Cell,75:1237-1239(1993)；Lefkowitz,R.J.,Nature,365:603-604(1 993)]。
本發(fā)明的抗體可以用來檢測細胞表面的受體，這種受體為可表達它的白細胞類型提供了一個篩選標記，尤其是嗜伊紅粒細胞。例如，針對受體蛋白或多肽產(chǎn)生的抗體能夠用來計數(shù)表達受體的細胞。細胞計數(shù)可以用來診斷多種疾病，或發(fā)現(xiàn)有升高或降低白細胞類型的條件(如高嗜伊紅粒細胞綜合癥里的嗜伊紅粒細胞；低嗜伊紅粒細胞癥。樣品中升高水平的嗜伊紅粒細胞的出現(xiàn)，說明有炎癥疾病或ASTHMA、寄生蟲等感染所致的嗜伊紅粒細胞滲漏。另外，這些抗體也能夠用來在細胞混合物中對受體表達細胞進行分類。為此目的可采用一些適合的細胞計數(shù)法和/或細胞分類法(細胞流計法，熒光激活細胞分類法)。
抗體還可以用來檢測或測量在多種疾病或在白細胞受到改變(以正常細胞表達水平為對照的降低或升高)的炎癥條件下受體表達水平的降低或升高。例如從某個體分離白細胞(嗜伊紅粒細胞，T淋巴細胞等淋巴細胞，單核細胞，嗜堿細胞)，用適當?shù)拿庖邔W(xué)檢測(ELISA,FACS分析)來評價表達水平。哺乳動物CKR-3受體的表達水平可用來診斷哺乳動物CKR-3受體表達升高或降低的疾病或條件。轉(zhuǎn)基因動物用重組DNA技術(shù)改變動物宿主的基因組，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物。在一個實施例里，改變是不可遺傳的(改變的是軀體細胞，如祖代骨髓細胞)，另一個實施例里改變是可遺傳的(改變的是生殖細胞)。用標準技術(shù)或其他方法可以構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物[參見，例如，Cooke.M.P.et al.,Cell,65:281-291(1991)關(guān)于對T淋巴細胞的修飾；Hanahan,D.,Science,246:1265-1275,(1989)]。
一方面，在某種動物宿主使內(nèi)源哺乳動物CKR-3受體基因全部或部分失活(用基因凋損技術(shù))，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明核酸可以用來評價包含失活CKR-3基因的成功宿主細胞結(jié)構(gòu)體(Southern雜交)。另外，通過檢測編碼受體的功能來評價包含失活CKR-3基因的成功宿主細胞結(jié)構(gòu)體。
在另一個實施例里，將編碼哺乳動物CKR-3受體蛋白或多肽的核酸導(dǎo)入適當宿主細胞，制備轉(zhuǎn)基因動物。更好的實施例里，轉(zhuǎn)基因動物的內(nèi)源CKR-3受體基因是失活的(通過同源重組導(dǎo)入核酸的同時使失活，損壞并替換內(nèi)源基因)。例如，可制備轉(zhuǎn)基因動物(鼠，豚鼠，綿羊)，其白細胞(嗜伊紅粒細胞，T淋巴細胞)中能夠表達不同哺乳動物種類(人)的CKR-3受體，為評價該受體功能提供了一個方便的動物模型。另外，給予轉(zhuǎn)基因動物某種化合物，用適當?shù)姆治龇椒z測該化合物在受體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的作用[參見，例如，Weg,V.B.et al.,J.Exp.Med.,177:561(1993)；Abraham,W.M.et al.,J.Clin.Invest.,93:776(1994)。以這種方式可以鑒定抑制或促進受體功能的化合物，或者評價其體內(nèi)效果。治療方法根據(jù)本發(fā)明，通過抑制或促進至少一種哺乳動物CKR-3受體特有的功能，調(diào)節(jié)其功能，為抑制或促進白細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)提供了一種有效的選擇性的方法。這里所述CKR-3受體功能的一個或多個配體，抑制劑和/或促進劑，能夠用來為治療疾病調(diào)節(jié)白細胞的功能。在一個實施例里，本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)哺乳動物CKR-3受體至少一個功能的方法，其中步驟包括該蛋白與其至少一個功能的抑制劑或促進劑相接觸。
哺乳動物CKR-3受體作為主要的嗜伊紅粒細胞和淋巴細胞趨化因子受體，為干涉或促進哺乳動物如人嗜伊紅粒細胞和/或淋巴細胞功能提供了靶向。相一致地，在特定的炎癥滲透情況下發(fā)現(xiàn)T細胞和嗜伊紅粒細胞的共同定位。因此，本發(fā)明所鑒定的抑制或促進CKR-3受體功能的化合物如配體，抑制劑(7B11)和促進劑，尤其能夠為了治療目的調(diào)節(jié)嗜伊紅粒細胞，嗜堿細胞和/或淋巴細胞功能。
因此本發(fā)明提供一種為治療目的抑制或促進炎癥反應(yīng)的方法，包括給予病人一種可抑制或促進哺乳動物CKR-3受體功能的化合物。
在一個實施例里，給予一種抑制哺乳動物CKR-3受體(人CKR-3受體)一個或多個功能的化合物，以抑制炎癥(減輕或預(yù)防)。結(jié)果一或多個炎癥過程例如白細胞的滲出，趨化反應(yīng)，細胞物質(zhì)外滲(酶或組胺)或炎癥介導(dǎo)物的釋放，受到了抑制。例如，根據(jù)本發(fā)明嗜伊紅粒細胞向炎癥部位滲透(例如，在哮喘中)受到了抑制。因此可提供一種治療炎癥疾病或條件的方法，包括給予哺乳動物有效治療量的哺乳動物CKR-3受體蛋白抑制劑。
另一個實施例里，給予一種能夠促進哺乳動物CKR-3受體(人CKR-3受體)一個或多個功能的化合物，以刺激(誘導(dǎo)或加強)炎癥反應(yīng)，如白細胞的滲出，趨化反應(yīng)，細胞物質(zhì)外滲(酶或組胺)或炎癥介導(dǎo)物的釋放，導(dǎo)致有利的炎癥反應(yīng)激活。例如，嗜伊紅粒細胞能夠富集以抵抗寄生蟲感染。
根據(jù)本發(fā)明的方法，除了靈長目動物如人外，還有許多其他哺乳動物能夠用此法治療。這些哺乳動物包括但不僅僅局限于乳牛，綿羊，山羊，馬，狗，貓，豚鼠，兔等。然而這種方法也能夠用于其他種類，如鳥類(雞)。
伴隨炎癥和感染的疾病和條件能夠用這種方法來治療，在一個更好的實施例里，疾病是為了調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，嗜伊紅粒細胞和/或淋巴細胞的活性受到了抑制或促進。
人或其他種類動物的疾病可以用CKR-3受體功能的抑制劑來治療，包括但不局限于◎炎癥或變應(yīng)性疾病，包括呼吸變應(yīng)性疾病如氣喘，變應(yīng)性鼻炎，過敏性肺病，過敏性肺炎，嗜伊紅粒細胞性肺炎(Loeffler＇s綜合癥，慢性嗜伊紅粒細胞性肺炎)，間隙肺病(自發(fā)性肺纖維化，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎伴發(fā)的ILD，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，關(guān)節(jié)強硬脊椎炎，系統(tǒng)硬化，Sjogron＇s綜合癥，多肌炎或皮膚肌炎)，系統(tǒng)性過敏癥或超敏反應(yīng)，藥物變應(yīng)性(青霉素，頭孢霉素)，昆蟲叮咬變應(yīng)性，腸炎癥，如Crohn＇s病和潰瘍性結(jié)腸炎，脊椎關(guān)節(jié)病，硬皮病，牛皮癬和皮膚炎癥如皮炎，濕疹，特應(yīng)性皮炎，變應(yīng)性接觸皮炎，急性尋麻疹，結(jié)節(jié)性脈管炎(壞死性的或過敏性的)；◎嗜伊紅粒細胞性肌炎，嗜伊紅粒細胞性肌膜炎；◎自身免疫疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，牛皮癬性關(guān)節(jié)炎，多重硬化，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，重癥肌無力，少年型糖尿病，血癥性腎小球性腎炎，自體免疫甲狀腺炎，Behcet＇s??；◎移植排斥反應(yīng)(器官移植)，包括異體移植排斥反應(yīng)或移植-宿主疾??；◎皮膚或器官白細胞滲透性癌癥；◎其他疾病包括但不限于，再灌注損傷，粥樣硬化，某些敗血癥，細胞因子毒性(敗血性休克，內(nèi)毒性休克)，多肌炎，皮膚肌炎；能夠用CKR-3受體促進劑治療的人或其他種類動物的疾病，包括但不局限于
◎免疫抑制，例如免疫缺陷綜合癥AIDS，放療，化療，進行自體免疫疾病治療，或其他藥物治療(皮質(zhì)類固醇治療)將導(dǎo)致免疫抑制，受體功能先天缺陷的免疫抑制；◎感染性疾病，如寄生蟲病，包括但不局限于蠕蟲感染，如線蟲；(Trichuriasis,Enterobiasis,Ascariasis,Hookworm,Strongyloidiasis,Trichinosis,filariasis)；吸蟲(fluxes)(Schistosomiasis,Clonorchiasis),cestodes(tape worms)(Echinococcosis,Taeniasis saginata,Cysticercosis)；絳蟲(Toxocara)；內(nèi)臟蠕蟲，內(nèi)臟游走性幼蟲病，腸胃炎(例如，Anisaki spp.,Phocanema ssp.)；皮膚游走性幼蟲病(Ancylostomabraziliense,Ancylostoma caninum)。在某些炎癥反應(yīng)尤其是氣喘中嗜伊紅粒細胞作為靶細胞嗜伊紅粒細胞產(chǎn)生于骨髓再循環(huán)到組織中，主要是到黏膜組織，例如肺，胃腸道，和生殖道。嗜伊紅粒細胞在血液里一般占白細胞的1-3％，但是在變應(yīng)性疾病和蠕蟲感染疾病患者的組織或血里有嗜伊紅粒細胞的積累，嗜伊紅粒細胞的積累對宿主可以是有益的也可以是有害的。
例如，嗜伊紅粒細胞有許多粒物質(zhì)，帶有陽性蛋白質(zhì)，IgG,IgA,IgE受體的參與或血小板激活因子(PAF)，白三烯，趨化因子等炎癥介質(zhì)的刺激，將引起嗜伊紅粒細胞的脫粒作用，導(dǎo)致粒物質(zhì)的釋放。嗜伊紅粒細胞產(chǎn)物也會傷害宿主細胞，最大的危害來自于陽性蛋白，從氣喘病人可檢測到升高的陽性蛋白。嗜伊紅粒細胞也產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，如白三烯C4,PAF。這些介質(zhì)使器官平滑肌收縮，促進黏液分泌，改變管道通透性，減少嗜伊紅粒細胞和中性細胞的進一步滲透。
嗜伊紅粒細胞參與變應(yīng)性/氣喘素質(zhì)的啟始和維持。在一個實施例里，除其他嗜伊紅粒細胞并發(fā)癥外，本法還可以用來治療氣喘或過敏性(變應(yīng)性)疾病，尤其是那些包括黏膜組織的疾病。在一個更好的實施例里，給予氣喘病人一種能夠抑制哺乳動物CKR-3受體一到多個功能的化合物。
嗜伊紅粒細胞歲于宿主十分重要，能夠防御大的，不可被吞噬的組織，如多細胞蠕蟲。嗜伊紅粒細胞也是免疫反應(yīng)對付可誘導(dǎo)高水平IgE抗體的抗原的重要效應(yīng)細胞。因此，本法可用來治療感染性疾病，如寄生蟲疾病，刺激或促進炎癥防御，或抑制有害宿主的炎癥應(yīng)答。嗜伊紅粒細胞和氣喘藥物病因?qū)W氣喘的特征是器官或支氣管的阻塞，是由各種藥理介質(zhì)引起的支氣管過敏和迅速狹窄?，F(xiàn)在廣泛認為支氣管黏膜的慢性炎癥在氣喘的發(fā)展方面充當重要角色。
在氣喘和其他過敏反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)了支氣管黏膜有強烈的嗜伊紅粒細胞，巨噬細胞，淋巴細胞的滲透。通常嗜伊紅粒細胞向炎癥氣道選擇性遷移很重要，可能由于嗜伊紅粒細胞從血里分離并和內(nèi)皮細胞特異結(jié)合。嗜伊紅粒細胞尤其是引起支氣管黏膜損傷的作用物質(zhì)，對氣喘病人的研究顯示，血液嗜伊紅粒細胞的數(shù)目與支氣管過敏程度相關(guān)。另外支氣管活檢和的氣喘支氣管肺泡隱藏液的研究都表明在嗜伊紅粒細胞和臨床嚴重程度之間有明確的相關(guān)性。因此存在嗜伊紅粒細胞和不利的免疫反應(yīng)尤其是氣喘之間有強烈的聯(lián)系。
嗜伊紅粒細胞和淋巴細胞上主要的趨化因子，在選擇性趨化反應(yīng)，外滲和應(yīng)答于趨化吸引的活化方面發(fā)揮作用，也為干涉嗜伊紅粒細胞的富集提供了完美的靶向。能夠抑制哺乳動物CKR-3受體至少有或多個功能的抑制劑，例如抑制趨化因子結(jié)合，提供了一種治療氣喘的有效途徑。通過減輕或防止白細胞特別是嗜伊紅粒細胞向炎癥肺或氣道組織的富集(外滲，滲透)，和/或減弱這些組織中白細胞功能，能夠抑制氣喘破壞性的炎癥過程，并緩解癥狀。
有證據(jù)顯示阻止嗜伊紅粒細胞向肺部富集可以環(huán)節(jié)氣喘的癥狀。據(jù)報道，用α4整合蛋白活性的單克隆抗體可抑制嗜伊紅粒細胞向肺部和氣道的積聚，可以抑制綿羊身上抗原引起的氣道過敏反應(yīng)。在氣喘的靈長目模型里，有報道ICAM-1單克隆抗體可減少氣道嗜伊紅粒細胞和過敏反應(yīng)。另外，在被動皮膚過敏癥的豚鼠模型上，離體培養(yǎng)用抗α4單克隆抗體預(yù)處理嗜伊紅粒細胞，可阻止嗜伊紅粒細胞的積聚[參見，例如，Wegner,C.D.et al.,Science,247:456(1990)；Weg,V.B.et al.,J.Exp.Med.,177:561(1993)；and Abraham,W.M.et al.,J.Clin.Invest.,93:776(1994)有關(guān)這些模型。給藥方式根據(jù)本方法，通過合適的途徑，給予宿主一或多種化合物，單獨給藥或配合其他藥物，給予一個有效量的化合物(抑制配體結(jié)合的受體多肽，抗體或抗體片段)。一個有效量是指在給藥條件下足夠達到預(yù)期治療效果的量，例如，足夠抑制或促進CKR-3受體從而分別抑制或促進炎癥反應(yīng)的量。
有多種可能的給藥途徑，包括但不局限于口服給藥，胃腸道給藥，局部給藥，腸胃外給藥(靜脈內(nèi)，動脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮下注射)，吸入劑(支氣管內(nèi)，鼻內(nèi)，或口腔吸入，鼻內(nèi)滴注)，根據(jù)疾病狀態(tài)及條件來確定給藥途徑。對于呼吸系統(tǒng)變應(yīng)性疾病如氣喘，吸入方式是首選給藥途徑。
根據(jù)給藥途徑不同，化合物的形式差別很大(溶液，乳劑，膠囊)，用一個生理可接受的載體制備包含化合物的藥物。對于溶液或乳劑，合適的載體包括氯化鈉溶液，Ringer｀s葡萄糖，葡萄糖和氯化鈉，乳糖化Ringer｀s或固定油。靜脈內(nèi)載體包括多種添加劑，防腐劑，或液體，營養(yǎng)劑或電離再生劑。對于吸入劑，化合物可以溶解再裝入一個合適的給藥分散器中(噴灑器，噴霧器，空壓分散器)。實施例本發(fā)明將有下列實例來說明，但并不意味僅局限于此。
實施例1人嗜伊紅粒細胞的趨化特性人嗜伊紅粒細胞的趨化性為鑒定嗜伊紅粒細胞趨化因子受體的拮抗劑，有必要鑒定嗜伊紅粒細胞趨化反應(yīng)中重要的趨化因子，并確定這些趨化因子所結(jié)合的受體。在靈敏和經(jīng)改進的趨化分析里進行趨化實驗，其中使用在趨化反應(yīng)孔多聚碳水化合物膜上生長的內(nèi)皮細胞。嗜伊紅粒細胞的分離100ml肝素化血液用PBS以1∶1稀釋，分別取20ml樣品鋪在65％、75％Percoll梯度上，室溫下1500rpm離心25分鐘。嗜伊紅粒細胞/中性細胞層轉(zhuǎn)至一新試管，加入20ml 0.2％NaCl,1分鐘后加入30ml 1.8％NaCl使紅細胞裂解。用緩沖液PBS,0.5％BSA,0.5mM EDTA洗滌細胞兩次，重溶于冷緩沖液到5×107cell/50μl，細胞中加入50μl CD16微珠?；旌衔?度下溫育25分鐘，然后加入900μl冷緩沖液。用miniMACSTM分離儀來取消CD16陽性細胞(中性細胞)，取200μl樣品上柱，收集流出的細胞并進行組織學(xué)檢驗，嗜伊紅粒細胞制備物純度＞99％。趨化性檢測趨化因子自Peprotech,Inc.獲得(Rocky Hill,N.J.)。用24孔板中3.0微米Biocoat細胞培養(yǎng)插入子進行趨化性實驗。在趨化實驗之前兩天內(nèi)皮細胞在插入子上生長富足，實驗用內(nèi)皮細胞是ECV304，能夠表達內(nèi)皮細胞標記物如von Willebrand因子，ICAM-1,VCAM-1。因為人臍靜脈內(nèi)皮細胞天然可變，只能夠用幾次實驗，而且比ECV304生長慢，所以該內(nèi)皮細胞株極大地方便了實驗。實驗在37度下進行1.5小時，用倒置顯微鏡計數(shù)遷移細胞。結(jié)果結(jié)果如圖4示，代表至少5次實驗。在聚碳酸酯膜上生長的ECV304內(nèi)皮細胞幾乎完全地消除了背景遷移。用在透內(nèi)皮細胞的趨化檢測中的嗜伊紅粒細胞表現(xiàn)了對多種趨化因子的遷移，特別是RANTES、MCP-3，對MCP-1的遷移相對較低。而MIP-1β、IL-8、MCP-2、和IP-10則幾乎對嗜伊紅粒細胞的趨化作用。在某些實驗中，MIP-1α對嗜伊紅粒細胞是趨化性的，雖然總體上是非活性的。在這些實驗中，使用了相當范圍內(nèi)各種濃度的趨化因子，因為白細胞對不同的趨化因子的反應(yīng)性各異，以及各種趨化因子制劑的質(zhì)量不同。但一致的發(fā)現(xiàn)是，對RANTES和MCP-3的高水平的嗜伊紅粒細胞的趨化反應(yīng)。
實施例2主要嗜伊紅粒細胞性趨化因子受體的鑒定引物的選擇和設(shè)計對五種趨化因子受體基因比較它們對簡并的寡核苷酸的的產(chǎn)生，用于從嗜伊紅粒細胞中PCR克隆出新趨化因子受體。對這五種受體基因的選擇根據(jù)是，其所結(jié)合的趨化因子配體的種類[I1-8受體A(IL8RA)、Ⅰ1-8受體B(IL8RB),MIP-1α受體(MIP1αR)]，或與這些受體有顯著的序列相似性的嬰兒受體，并且其表達被報道為僅限于淋巴樣細胞或組織[Epstein BarrInducible receptor-1(EBI1R)and Burkitt′s Lymphoma Receptor-1(BLR1)]。根據(jù)已經(jīng)出版的對位，將受體的序列相對位排列[IL-8RA,Holmes et al.,Science,253:1278-1280(1991)；IL-8RB,Murphy,P.A.et al.,Science,253:1280-1283(1991)；MIP1α/RANTES,Neote,K.et al.,Cell,72:41 5-425(1991)；EBIIR,Birkenbach,M.et al.,J.Virol.,67:2209-2220(1993)；and BLR1(Dobner,T.et al.,Eur.J.Immunol.,22:2795-2799(1992)]。
根據(jù)高度的序列相似性，選擇了跨膜(TM)區(qū)域2、6和7，以及對TM3的C終端區(qū)域作為簡并寡核苷酸設(shè)計的靶標。簡并的寡核苷酸引物的核苷酸序列在下表中給出。
表引物Set2SEQ ID NO:
TM2a7引物2a-1(正向) 5’-TAC CTG CTS AAC CTG GCC ITG GCI G8嵌套引物2a-2(正向) 5’-AC CTG GCC ITG GCI GAC CTM CTC TTTM39引物3F(正向)5’-GAC CGY TAC CTG GCC ATI GTC CAY GCC10 引物3R(反向)CTG GCR ATG GAC CGG TAI CAG GTR CGG-5’TM6b11 引物6b-1(反向) GAR AMR ACC IRI GGG ATG TTRIAC CAI-5’12 嵌套引物6b-2(反向) AAG RAI GAR GAR AMR ACC IRI GGG ATG T-5’TM713 引物7-1 ACG SAG TTG GGI IAS IAG ATG CGG AAG-5’14 嵌套引物7-2(反向)GTG WCG ACG SAG TTG GGI IAS IAG A-5’1核苷酸縮寫K=G/TM=A/CR=A/GS=C/GW=A/TY=C/T嗜伊紅粒細胞的分離和純化用PBS按1∶1將100ml的肝素化的血稀釋。分別取20ml樣品鋪在65％、75％Percoll梯度上，室溫下1500rpm離心25分鐘。嗜伊紅粒細胞/中性細胞層轉(zhuǎn)至一新試管，加入20ml 0.2％NaCl,1分鐘后加入30ml 1.8％NaCl使紅細胞裂解。用緩沖液PBS,0.5％BSA,0.5mM EDTA洗滌細胞兩次，重溶于冷緩沖液到5×107cell/50μl，細胞中加入50μl CD16微珠。混合物4度下溫育25分鐘，然后加入900μl冷緩沖液。用miniMACSTM分離儀(Miltenyi Biotec,Inc.,Auburn,CA95603)來取消CD16陽性細胞(中性細胞)，取200μl樣品上柱，收集流出的細胞并進行組織學(xué)檢驗，嗜伊紅粒細胞制備物純度＞99％。
mRNA的分離和PCR用Micro-FastTrackTMmRNA分離試劑盒直接從純化細胞提取mRNA for RT-PCR，在用7TMS退化引物之前，用PCR擴增β-肌動蛋白和/或GAPDH(甘油醛-3-磷酸鹽脫氫酶)mRNA。
根據(jù)實驗手冊，以寡聚dT和/或隨機六聚體為引物，使用GeneAmpRNA PCR試劑盒(Perkin-Elmer)，將20-50ng的mRNA反轉(zhuǎn)錄，20μl終濃度。2-5μl cDNA(反轉(zhuǎn)錄的嗜伊紅粒細胞信息)和200μM dNTPs和50-100pmol退化引物在50μl體積里進行混合。鎂離子濃度和pH適合于每一個引物對，鎂離子濃度從1.0到3.0mM波動，pH波動于8.5到10.0。盡管評價了多種循環(huán)參數(shù)，但是通常所用的條件類似于下面94℃,30秒；37℃,30秒；2分鐘緩升到72℃,1分鐘，然后30個循環(huán)94℃,45秒；48℃,1分鐘；72℃,1分鐘。
對于分離到的201bp片段，引物對2a-1和7-1，或引物對2a-1和3R，被用在PCR反應(yīng)中，60mM Tris-HCl,pH9.5and 1.5mM MgCl2。1μl每個反應(yīng)的產(chǎn)物被用在PCR獨立的循環(huán)，使用“裸露”引物2a-2和3R。裸露PCR的反應(yīng)條件完全同于第一個PCR中所述。
用瓊脂糖凝膠電泳評價和分離PCR產(chǎn)物，用pCR-ScriptTMSK+克隆試劑盒純化并亞克隆適當長度的片段。(適當?shù)钠伍L度如下區(qū)域2a和7的引物對的PCR(見上表)，為約700bp長度；對來自區(qū)域2a的引物和引物3R的PCR，為約200bp長度；以引物3F和區(qū)域6b的引物的PCE，為約400bp長度，對以引物3F和區(qū)域7引物的PCR，為約550bp的長度)。根據(jù)假設(shè)相關(guān)的受體蛋白有結(jié)構(gòu)相似性，可以預(yù)測片段的尺寸。快速篩查實驗為了快速從大量克隆中檢測出新的7TMS家族成員，如前述獲得的細菌克隆插入子(即包括適當長度片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體亞克隆到pCR-Script SK+)，通過PCR用互補于填補多聚連接pCR-ScriptTM的填補序列T3和KS引物進行篩查。特別是，過夜轉(zhuǎn)化的細菌克隆一部分直接混合于40μl的PCR混合物，包含200μM dNTPS,20mM Tris,pH8.5,50mM KCl,2.5mMMgCl2,50pmol各種引物和0.25活性單位Taq多聚酶。循環(huán)條件是25次循環(huán)94℃,20秒；55℃,20秒；72℃,30秒。通過在1.5％瓊脂糖凝膠上評價20μl PCR產(chǎn)物來鑒定合適長度的插入子。用AluⅠ,HhaⅠ，和RsaⅠ降解剩下的20μl反應(yīng)產(chǎn)物，并溶解于12％聚丙烯酰胺凝膠以篩查不同的降解模式。選擇不同模式的克隆進行序列分析。結(jié)果產(chǎn)生于退化寡聚核酸PCR片段的序列分析，在pCR-Script中鑒定出一個201bp部分cDNA克隆(退化寡聚核酸是2a-1,2a-2,3F,3R和7-1)。該部分克隆稱為Eos L2(也指L2和EL2)，與MIP1α/RANTES受體之間有78.3％的氨基酸相似性，和MCP-1受體之間有60.8％的氨基酸相似性，最近對序列堿基數(shù)據(jù)的查找發(fā)現(xiàn)這個部分克隆是唯一的。Southern和Northern分析標記PCR片段并用來探針Southern和Northern印跡，為準備PCR探針，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅰ和NotⅠ從pCR-Script載體釋放201bp片段。240bp片段的降解結(jié)果包含201bp片段加上載體多聚連接的39個堿基對，通過瓊脂糖凝膠電泳從載體上分離并純化片段(Magic Mini Prep,Promega Corp.Madison,WI)。根據(jù)實驗手冊推薦的方法用購買于Boehringer Mannheim的隨機引物DNA標記試劑盒標記大約200ng材料。
為Southern印跡，用限制性內(nèi)切酶過夜處理基因組DNA(購買于Clontech Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA)并通過在0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離，再毛細管轉(zhuǎn)移到羥基-N尼龍膜(Amersham)，在包含5×Denhardt’s溶液(1×Denhardt’s溶液是0.02％牛血清白蛋白，0.02％Ficoll),10％w/v硫酸葡萄糖，2％SDS，和帶鞘沙丁魚卵DNA(100μg/ml)的6×SSC(1×SSC是0.15M氯化鈉，0.015M檸檬酸鈉)65℃過夜雜交。用2×SSC,0.5％SDS、65℃洗滌膜兩次，再用0.2×SSC、0.5％SDS,65℃洗滌兩次。
Southern雜交顯示單一強烈雜交片段和單一微弱雜交片段，和各自所用酶雜交。微弱雜交片段可能是MIP1α1/RANTES受體。
多組織Northern印跡購買于Clontech Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA。ExpressHybTMSolution購買于Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA。ExpressHybTMSolution也是購買于ClontechLaboratories,Inc.。按照實驗手冊的方法進行Multiple TissueNorthern印跡，探針如上面Southern印跡。Northern雜交結(jié)果顯示在脾臟、邊周血白細胞和胸腺細胞高水平的1.6kb信號，額外的Northern分析見于實施例5。篩查基因組文庫用EMBL3 SP6/T7載體構(gòu)建人基因組噬菌體文庫，載體購買于CLONTECH Laboratories,Inc.(Palo Alto,CA)。用201bpPCR片段篩查得到全長克隆，大約25,000個斑點形成單元混合于600μl過夜的E.coli菌株K802的細菌培養(yǎng)基，由NZCYM頂部瓊脂糖的文庫提供并鋪板于包含NZCYM瓊脂(NZYCM肉湯，瓊脂和瓊脂糖購買于Gibco/BRL)的150mm平板。37℃溫育7小時后，在平板上鋪BA-85硝酸纖維素膜(Schleicher andSchuell,Keene,NH)5分鐘讓噬菌體轉(zhuǎn)移到膜上。膜在失活溶液中浸泡5分鐘(1.5M氯化鈉，0.5N氫氧化鈉)，再用1.5M氯化鈉，0.5M Tris,pH8.0中和。過濾器風(fēng)干15分鐘再于80℃進行真空烘烤2小時。如上面Southern印跡所述用過濾器雜交，201bpPCR片段包含寡聚核苷酸引物2a-2(TM2)a和3R(TM3)之間的序列。
基因組噬菌體克隆，標為Eos L2.8，包含帶有Southern印跡中1.8kb HindⅢ片段的插入序列(完全的插入長度不明確但大概是17kb)。
用HindⅢ限制性內(nèi)切酶降解噬菌體克隆Eos L2.8，瓊脂糖電泳，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。1.8kb片段重溶解于水，連接到pBluescriptⅡKS+載體的HindⅢ位點(Stratagene)，然后轉(zhuǎn)化到購買于Gibco/BRL的DH5α活性細胞。
對HindⅢ片段的兩條鏈進行測序，片段中含有Eos L2受體的全部氨基酸編碼序列，將該序列和下述cDNA克隆進行比較顯示該克隆是全長克隆。1065核苷酸的開放閱讀框編碼一個355個氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:2)，預(yù)測其分子量為41Kd。
比較全長Eos L2受體序列和MIP1α/RANTES和MCP-1受體序列發(fā)現(xiàn)分別有73.4％和60.5％的氨基酸相似性。為這個比較，手工排列序列，氨基酸總數(shù)乘以100倍來劃分。
也可以用MegAlignTM(DNASTAR,Inc.)按照簇方法排列序列，和其他趨化因子受體序列進行比較發(fā)現(xiàn)和CKR-1,CKR-2B,和CKR-4之間分別有62％、47％、和41％的氨基酸相同性。相反，和IL-8受體A和B的氨基酸相同性，兩者都只有27％。該受體與MIP1α/RANTES和MCP-1受體的氨基酸相似性，兩個C-C趨化因子受體的實驗結(jié)果和這里所報道的相吻合，說明EosL2是一個C-C趨化因子受體。
實施例3轉(zhuǎn)染細胞株中Eos L2的表達FLAG-標記的Eos L2(CKR-3)受體結(jié)構(gòu)按下法構(gòu)建Eos L2受體融合蛋白1．pCDM8中的一個FLAG-PAF受體結(jié)構(gòu)[按報道的方法構(gòu)建，Kunz,D.et al.,J.Biol.Chem.,267:9101-9106(1992)]用HindⅢ和EcoRi雙重降解，釋放出包含F(xiàn)LAG多肽編碼核酸的48bp片段，核酸序列是AAGCTTCCA GCA GCC ATG GAC TACAAG GAC GAC GAT GAC AAA GAATTC(SEQ ID NO:15)。氨基酸序列是MDYKDDDDKEF(SEQ ID NO:16)。包含F(xiàn)LAG核苷酸的48bp HindⅢ/EcoRⅠ片段亞克隆到pcDNA3載體的HindⅢ/EcoRⅠ位點(Invitrogen,San Diego,CA)，生產(chǎn)pcDNA3/FLAG。
2．用BamHⅠand Xho降解包含1.8kb Eos L2 HindⅢ片段的pBluescriptⅡKS+載體，釋放出一個1.261kb片段，這個BamHⅠ-XhoⅠ片段包含穿過終止密碼子并加上相同3’不翻譯區(qū)域的核酸所編碼Eos L2氨基酸91，還生成21bp的pBluescriptⅡKS+載體。
3．制備兩個PCR引物，用來擴增Eos L2基因的5’端，轉(zhuǎn)移第一個Met并接入EcoRⅠ位點，已經(jīng)在第一步有描述，5’引物是(SEQ ID NO:17):
EcoRⅠ5’-TTAA GAATTC ACA ACC TCA CTA GAT AC該引物包括EcoRⅠ位點，除Met密碼子外EosL2基因的前面17個核苷酸。
3’引物(SEQ ID NO:18)是5’-CATAGT GGATCC AGAATGEos L2基因的引物序列恰好是在BamHⅠ位點的3’端，通過pBluescriptⅡKS+載體用著兩個引物來擴增，載體包含1.8kb EosL2片段作為模板擴增280bp片段，可以用EcoRⅠand BamHⅠ降解Eos L2的5’端，得到的片段用來如下述連接實驗。
擴增的條件是100ng pBluescriptⅡKS+，包含1.8kb Eos12片段連接于在50μl反應(yīng)體積里有200μM dNtps和50pmol引物，最后鎂離子濃度是2.5μM和pH為8.0。片段進行擴增25個循環(huán)94℃,30秒；55℃,30秒；72℃,30秒。擴增產(chǎn)物分離于瓊脂糖凝膠，如上進行電泳純化。用EcoRⅠand BamHⅠ降解片段，在瓊脂糖凝膠電泳上進一步純化。
4．為構(gòu)建Flag-標記的Eos L2基因，包含有FLAG片段的pcDNA3載體(描述于步驟1)用EcoRⅠ和XhoⅠ降解，通過電泳從多聚連接體分離載體片段(EcoRⅠ-XhoⅠ片段包含F(xiàn)LAG編碼序列)，載體片段如同其他電滲出片段一樣純化。載體片段連接于PCR步驟3生成的EcoRⅠ-BamHⅠ片段，這兩個片段來于步驟2。全部三個片段連接在一起，生成pcDNA3中的FlAG-tagged EosL2受體。連接的DNA轉(zhuǎn)化入DH5a。瞬間轉(zhuǎn)染293細胞(ATCC保藏號No.CRL1573)生長于培養(yǎng)基Minimal Essential Medium(MEM)Alpha Medium，購買于Gibco/BRL，并補充以10％小牛血清，谷氨酸，和青霉素/鏈霉素(都是購買于Gibco/BRL)。對于每一次瞬間轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前一天將2×106293細胞放在平板上，35-mm的組織培養(yǎng)板，在轉(zhuǎn)染的時候，細胞(貼壁生長的)用磷酸緩沖液洗滌一次(PBS,Gibco/BRL)，將DNA和lipofectAMINETM試劑(Gibco/BRL)的混合物給予細胞。
DNA/lipofectAMINETM試劑混合物，是通過在終濃度100μl OptiMEMTM(Gibco/BRL)里的2μg Flag-標記的Eos L2受體表達載體和100μl體積里的12μl LipofectAMINETM試劑，在室溫下溫育45分鐘得來。最終體積是200μl。溫育45分鐘后，加800μl OptiMEMTM到200μl DNA/lipofectAMINETM試劑里，取1ml溶液鋪在上述細胞上。細胞在37℃溫育5小時，同時加入上述的1ml MEM Alpha Medium補充培養(yǎng)基，細胞繼續(xù)溫育另外12小時，這時移去所有培養(yǎng)基，并用PBS和2mls MEM Alpha培養(yǎng)基補充劑洗滌細胞兩次。轉(zhuǎn)染細胞溫育額外的72小時。在PBS 10mM EDTA中溫育后用溫和的移液法收集細胞。
FLAG-標記的Eos L2的細胞表面表達，在轉(zhuǎn)染293細胞上已經(jīng)有證實。用熒光染色分析或FACS分析確定大約2.6％的細胞在表面表達受體。發(fā)現(xiàn)一些細胞的表達水平比背景大2log,說明該細胞的高表達水平。因為Eos L2基因在pcDNA3表達載體上(Invitrogen Corp.,San Diego,CA)，帶有新霉素抗性基因，通過新霉素(G418)選擇法可選出穩(wěn)定的293轉(zhuǎn)染子。穩(wěn)定的細胞株用FLAG-標記的受體已經(jīng)產(chǎn)生了超過500個穩(wěn)定的鼠L1-2前B細胞株，L1-2pre-B細胞來自于(Dr.Eugene Butcher,StanfordUniversity,Stanford,CA)，生長于RPMI-1640(Gibco/BRL)培養(yǎng)基，補充10％BSA和青霉素/鏈霉素，從超過200個克隆中篩查細胞表面表達，先用M2抗-FLAG單克隆抗體染色(InternationalBiotechnologies,Inc.,New Haven,CT)，再用抗鼠Ig-FITC(JacksonImmunoResearch Laboratories,Inc.)染色，用熒光激活細胞分類法分析(FACS)。免疫熒光染色法和FACS分析按照CurrentProtocols in Immunology,Vol.1,Coligan,J.et al.,Eds.,(JohnWiley&Sons,Inc.,New York,NY)進行。對多個細胞株的FACS分析結(jié)果顯示許多克隆表達高水平的Eos L2標記受體(圖5)。未轉(zhuǎn)染細胞(未顯示)染色為陰性。有高度表達的穩(wěn)定的細胞株能夠用做免疫原來制備有Eos L2受體反應(yīng)活性的抗體。另外，這些細胞株對于研究趨化性和配體結(jié)合十分有用。桿病毒表達為構(gòu)建桿病毒表達載體，用HindⅢ降解pcDNA3中的Flag-標記的Eos L2受體，以移去Flag-標記基因。HindⅢ片段包含基因是用Klenow片段和dNTP’s填補超序列得到的鈍端基因。鈍端片段亞克隆到pVL1393(Invitrogen)的SmaⅠ位點。2.0μgpVL1393載體(包含Eos L2基因)與0.5μg AcMNPV病毒DNA(Invitrogen)混合。并按照實驗指導(dǎo)用InsectinTM(Invitrogen)共同轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲細胞(Invitrogen)。第二天用5ml SF-9培養(yǎng)基[Grace’s Supplemented Insect Media(Gibco∥BRL)含有10％小牛血清]替換SF-900培養(yǎng)基(無血清)。細胞生長五天，以斑點純化重組病毒，具體參見D.R.O’Reilly,L.K.Miller,and V.A.Luckow(1994)桿病毒表達載體A Laboratory Manual,OxfordUniversity Press,PP.149-158。
通過用純化充足病毒斑點感染Sf9細胞，在Sf9細胞上獲得Eos L2受體的表達。Sf9細胞(2×106cells/ml)受到感染，感染率為10∶1。感染進行72小時，用M2抗FLAG抗體染色。
用Sf9細胞中的桿病毒表達系統(tǒng)也獲得了該受體的成功表達。基于抗-FLAG抗體染色獲得了良好的表達水平(見實施例5)。用同種細胞Sf9轉(zhuǎn)染子也獲得了配體結(jié)合，通過FACS分析受體的表達。然而，用碘化丙錠排除法，可以顯示缺陷的細胞表面表達，和陰性對照相比，這些細胞上的表達是很低的(即，用表達載體轉(zhuǎn)染的Sf9細胞缺少Eos L2基因插入子)。為更高的細胞表面表達，可以降低感染長度，MOI可以進一步適應(yīng)化。
實施例4配體結(jié)合研究配體結(jié)合過程用Eos L2受體轉(zhuǎn)染的細胞或正常純化的人嗜伊紅粒細胞用Hanks平衡鹽溶液洗滌(HBSS)，重新溶解于結(jié)合緩沖液50mMHEPES,1mM CaCl2,5mM MgCl2,0.5％Bovine Serum Albumin(BSA),pH7.3。在微離心管里，5×105細胞和0.1nM放射標記趨化因子溫育(購自New England Nuclear,Massachusetts),200μl的量室溫下60分鐘。細胞單獨與放射性標記趨化因子溫育，或與作為競爭劑的未標記趨化因子溫育(來自PeproTech)，使用表明的濃度。溫育后，用結(jié)合緩沖液洗滌三次，每次洗滌都經(jīng)過離心，7,000xg 2分鐘。洗滌后，沉淀轉(zhuǎn)移到LP3管里，細胞的放射性標記用gamma計數(shù)儀測定結(jié)合量。所有樣品用兩份，實驗至少重復(fù)三次。在Macinto計算機上用MicroSoR Excell和CricketGraph計算結(jié)合數(shù)據(jù)。結(jié)合人嗜伊紅粒細胞基于趨化性實驗的發(fā)現(xiàn)，配體結(jié)合研究集中在RANTES,MIP-1α和MCP-3。放射標記趨化因子或不同冷的趨化因子作為競爭劑，進行配體結(jié)合研究。純化的正常人嗜伊紅粒細胞與0.1nM125Ⅰ-標記的MIP-1α或RANTES溫育，存在或不存在不同冷趨化因子。進一步洗滌細胞后，用gamma計數(shù)儀測定結(jié)合。
圖6是一個柱形圖說明人嗜伊紅粒細胞和RANTES、MIP-1α的結(jié)合，或者其他β-家族趨化因子，例如，MCP-1,MCP-3和RANTES。相反，嗜伊紅粒細胞結(jié)合RANTES十分緊密。RANTES的結(jié)合不能夠被過量冷MIP-1α有效抑制，說明在嗜伊紅粒細胞上可能有不同于MIP-1α和RANTES的受體。
Scatchard點分析說明有1.8×103MIP-1α結(jié)合位點，親合度為91pM。分析也顯示對Rantes有較低的親合度(883pM)，有較多的結(jié)合位點(3.6×104/cell)。在所用條件下，對嗜伊紅粒細胞MCP-1沒有顯著結(jié)合，MCP-1不抑制RANTES的結(jié)合，除非在一個高的濃度(過量2500倍，圖7)。Eos L2受體轉(zhuǎn)染子在Eos L2的克隆和表達之后，轉(zhuǎn)染細胞被用來檢測和大量趨化因子的結(jié)合，用293轉(zhuǎn)染子的第一次嘗試是不成功的，加入冷趨化因子干涉結(jié)合，這也是其它的研究人員發(fā)現(xiàn)的一個現(xiàn)象。相反，用桿病毒感染SF9細胞，可以檢測到好的RANTES結(jié)合。SF9細胞的檢測條件不同于哺乳動物細胞。0.1nM125Ⅰ-labeledRANTES的結(jié)合發(fā)生于50mM HEPES,pH7.3,5mM MgCl2和1mM CaCl2，補充0.5％BSA。室溫下60分鐘后，用含有0.5MNaCl的結(jié)合緩沖液洗滌細胞三次，用gamma計數(shù)儀計算細胞沉淀中的放射性。
在這些配體結(jié)合實驗里，MIP-1α或RANTES結(jié)合最有效的異源競爭劑是MCP-3。事實上，MCP-3也有效抑制MCP-1結(jié)合于活化T細胞。因此，MCP-3表現(xiàn)為結(jié)合CKR-1,CKR-2和CKR-3[CKR-1,Gao,J.L.,et al.,J.Exp.Med.,177:1421(1993)and Neote,K.,et al.,cell,72:415-425(1993)；CKR-2,Charo,I.F.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:2752-2756(1994)and Myers,S.J.,et al.,J.Biol.Chem.,270:5786-5792(1995)]。
放射標記MCP-3也用于結(jié)合研究。細胞與0.1nM125Ⅰ-標記的MCP-3溫育，結(jié)合緩沖液是HBSS加0.5％BAS和0.1％疊氮化鈉。在37℃進行結(jié)合30分鐘。細胞通過在800μl 20％蔗糖中以12,000xg離心2分鐘將未結(jié)合同位素標記分離。試管封口后，在干冰里冷凍。用鉗子鉸開頂部后進行計數(shù)。
實施例5嗜伊紅粒細胞趨化因子量體的表達為證實Eos L2受體是嗜伊紅粒細胞上的功能性受體，用下法檢測受體的表達(a)Northern印跡分析，和(b)用單克隆抗體或受體反應(yīng)活性的抗多肽抗體的細胞流計。人嗜伊紅粒細胞、中性細胞和PBMC的純化嗜伊紅粒細胞分離于肝素化血液，個體患有嗜伊紅粒細胞增多癥。梯度離心，用抗-CD16磁珠陰性選擇。從Percoll離心得到的粒細胞部分CD16微珠溫育30分鐘。細胞上MACS柱，收集通過的嗜伊紅粒細胞，組織學(xué)檢查嗜伊紅粒細胞的純度＞99％。
室溫下通過密度梯度離心從肝素化靜脈血分離人中性細胞[Coligan et al.,Eds.,1992,Current Protocols in Immunology,(JohnWiley&Sons；New York,NY)]。RBCs裂解除去。
分離PBMCs(Coligan et al.,Eds.,1992,Current Protocols inImmunology,(John Wiley&Sons；New York,NY))。通過以磁化顆粒的CD14陽性選擇純化單核細胞，將淋巴細胞通過尼龍布來分離T細胞。為生成CD3胚細胞，2×106PBMCs/ml在RPMI-1640加10％FCS中被加入到組織培養(yǎng)盤，其首先外被抗-CD3抗體TR77。4-6天后，胚細胞轉(zhuǎn)到新鮮培養(yǎng)基，補充IL-2(Genzyme)50單位/毫升。Northern分析CKR-3在嗜伊紅粒細胞上選擇性表達盡管趨紅素是嗜伊紅粒細胞的一個選擇性趨化吸引劑，CKR-3受體也結(jié)合RANTES和MCP-3，它們都可吸引單核細胞和T細胞。在不同的白細胞類群中檢測受體的信息表達。
初期Northern雜交(參見實施例2)顯示，約1.6kb信息在脾、外周血白細胞、胸腺、一些白細胞亞類、如嗜伊紅粒細胞和T細胞，以及在HL-60細胞系中都被表達。在嗜伊紅粒細胞化的過程中，加入丁酸可以誘導(dǎo)在HL-60細胞中信息水平的急劇升高。
這就表明該信息很可能是Eos L2的，因為對在Southern印跡中雜交的MIP1α/RANTES受體的信息較弱并且被報道為3.0kb。當原始的201bp PCR片段被用在Southern印跡中作為探針時，就見到強力雜交的1.8kb HindⅢ片段。這就是所克隆和討論的片段。除了這個片段之外，也觀察到了約10kb的弱雜交的片段。該10kb的片段相應(yīng)于所報道的MIP1α/RANTES受體的HindⅢ片段尺寸。該MIP1α/RANTES受體產(chǎn)生一個約3kb的信息，這是在Northern印跡中沒有見到的。因此，在Northern印跡中見到的約1.6kb的信息可能來自于Eos L2基因。至此，EosL2的最豐富的表達是在來自于高嗜伊紅粒細胞綜合癥患者的純化嗜伊紅粒細胞制劑中見到的(參見實施例8)。
因為CKR-3和其他CC趨化因子受體之間高度序列同源，以及在Southern印跡中與多種序列的全長克隆雜交的事實，在另外的Northern分析中使用了250bp片段該片段來自于在Southern印跡中不與其它的序列交叉雜交的基因組克隆的3’-未翻譯區(qū)。雜交時，使用了包含1203-1453核苷酸的對CKR-3特異的3’-未翻譯區(qū)探針(圖1C)。
用來自不同的白細胞種群的RNA制備Northern印跡的材料，包括單核細胞、中性細胞、淋巴細胞、T細胞、用CD3 Mab活化產(chǎn)生的T細胞胚細胞，以及嗜伊紅粒細胞。根據(jù)廠商的手冊使用TriZOLTM制劑(Gibco/BRL)分離RNA。從每個高純化白細胞種群中分離的總RNA各取15μg，于1.2％甲醛瓊脂糖凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到Nytran-PlusTM尼龍膜(Schleicher and Schuell)，用Stratalinker交聯(lián)。根據(jù)廠商的手冊，用ExpressHybm Solution(Clontech)進行與放射性標記的3’-未翻譯區(qū)探針的雜交。將Northern印跡在有增強膜的條件下對X-OMAT AR暴光3-5天。在0.5％SDS中煮沸去除CKR-3特異性探針，用自對照至各種濃度的β-肌動蛋白對印跡再次探針檢測。
唯一能夠有可檢測信號的細胞類群是嗜伊紅粒細胞，發(fā)現(xiàn)有一個1.8kb的信號。這些結(jié)果與在圖13A-13D中的免疫學(xué)探察到的表面表達相一致。雖然在本實驗中，靜息態(tài)及活化的T細胞中都沒有探察到信息，但是，有可能的是，T細胞的某個亞組表達受體。與嗜伊紅粒細胞趨化因子受體反應(yīng)的單克隆抗體(MAb)用對應(yīng)于N端35氨基酸的合成多肽免疫老鼠，產(chǎn)生與EosL2受體反應(yīng)的Mab。根據(jù)核苷酸序列(見圖1A-1C；還可見SEQID NO:2)推測的Eos L2的N端35氨基酸被合成，并且與載體蛋白PPD偶聯(lián)(Purified Protein Derivative of Mycobacteriumtuberculosis；Severn Biotech Ltd.,Cambridge,U.K.)。
雌性Balb/C小鼠用在4被PBS中的50μg的這種肽-載體共軛物免疫。使用Freund＇s完全(第一次注射)和Freund＇s不完全輔劑(隨后的注射)將肽-載體共軛物腹膜內(nèi)注射。最后免疫是通過無佐劑的靜脈內(nèi)注射。從合成多肽免疫過的老鼠收集多克隆抗血清。
進行兩次成功的融合，產(chǎn)生超過15,000個的雜合子。最后一次注射四天后，取脾臟，在無血清DMEM培養(yǎng)基制備單一細胞懸液。這些細胞和SP2/0融合，具體操作如Galfre,G.等人所述[Galfre,G.et al.,Nature,266:550-552(1977)]。20ml的脾細胞和20ml的SP2/0合并起來，以800g旋轉(zhuǎn)5分鐘并去除培養(yǎng)基。將預(yù)溫?zé)岬?7℃的50％聚乙二醇1500在2分鐘內(nèi)加入到細胞中，然后在3分鐘內(nèi)加入10ml的DMEM培養(yǎng)基。細胞懸浮液以400g旋轉(zhuǎn)3分鐘，取出上清液。溫和地將細胞重懸浮于DMEM培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含20％小牛血清、2mM谷氨酸、100units/ml青霉素、100μl硫酸鏈霉素和HAT選擇培養(yǎng)基。將細胞加到96孔平底微滴盤，每孔200μl。
10-14天后，通過ELISA實驗，用酶標記抗鼠抗體檢測孔上清液對多肽的反應(yīng)性。大約篩選出200個mAb，說明對合成多肽的強反應(yīng)性。通過限制性稀釋亞克隆感舉趣的雜合子。
為了確定那些抗體能夠識別天生的表面表達分子，將Mab對用帶有Eos L2基因組DNA的AcMNPV病毒感染的Sf9昆蟲細胞進行篩選。這些昆蟲細胞在細胞表面表達了Eos L2(CKR-3)受體，利用強抗-FLAG對約10％細胞的染色來判定的。先用M2抗-FLAG抗體再用抗鼠Ig-FITC進行染色，用熒光激活細胞分類法分析，通過FACScan分析來定量表達[Current Protocols inImmunology,Vol.1,Coligan,J.et al.,Eds.,(John Wiley&Sons,Inc.；New York,NY)]。
大約33％的抗多肽雜合子與Eos L2轉(zhuǎn)染昆蟲細胞反應(yīng)，染色模式用于FLAG抗體，用抗鼠Ig-FITC作為第二抗體的FACS分析來確定。未轉(zhuǎn)染昆蟲細胞用抗FLAG染色是完全陰性?？苟嚯目贵w檢測對抗未轉(zhuǎn)染細胞，染色陰性。
能夠染色轉(zhuǎn)染昆蟲細胞的Mab，用FACS分析來檢測其與人嗜伊紅粒細胞、邊周血淋巴細胞、單核細胞、中性細胞、活化T細胞的反應(yīng)性。用mAb LS25-5H12，再用FITC-抗鼠Ig進行細胞染色(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)。通過使用過量的正常人血清，控制Fc受體結(jié)合。
所有的嗜伊紅粒細胞都被選擇的抗-Eos L2 mAb、LS26-5H12染色。在檢測條件下，中性細胞沒有顯著地被LS26-5H12染色。根據(jù)所預(yù)期的Eos L2受體的分布，以及其在RANTES結(jié)合中的功能，MAb LS26-5H12表現(xiàn)為識別該受體的天然的表達形式。除了LS26-5H12 Mab外，有約五種另外的Mab表現(xiàn)了相類似行為。
通過限制性稀釋，進一步純化LS25-5H12雜合子，在另一個實驗里，用MAb LS26-5H12染色高度純化的白細胞亞基，用細胞流計分析，染色模式代表至少四次實驗?；贑D3染色鑒別T細胞，通過向前和側(cè)向散光來監(jiān)別單核細胞和中性細胞。
LS26-5H12強烈染色了高純度嗜伊紅粒細胞，說明嗜伊紅粒細胞表面受體豐富的表達，和配體結(jié)合與Scatchard分析確定的高受體數(shù)目的結(jié)果相吻合。中性細胞、血T細胞和單核細胞表現(xiàn)出弱的或沒有該MAb染色性。后來用再克隆雜合子抗體進行的實驗結(jié)果，說明CKR-3在嗜伊紅粒細胞上選擇性表達，在其他供試白細胞類型無明顯表達。然而有可能是T細胞亞族表達受體。
實施例6選擇穩(wěn)定的L1.2細胞轉(zhuǎn)染物2％-5％瞬時轉(zhuǎn)染的COS、HEK-293和CHO細胞用對FLAG-標記的受體鑒定為細胞表面陽性(見上述)，而大部分細胞內(nèi)蛋白質(zhì)可以被檢查到，說明蛋白質(zhì)運輸?shù)男什?。L1.2鼠pre-B細胞系被用來選擇具有更高表面表達水平的細胞系，用于進一步對CKR-3的配體結(jié)合特異性和信號的傳導(dǎo)進行評價。該細胞系已經(jīng)被成功地用于對其它的趨化因子受體的研究中(Honda,S.,et al.,J.Immunol.,152:4026-4035(1994))，被轉(zhuǎn)染的人趨化因子受體賦予了獨各種配體的特異性趨化因子能力。
為監(jiān)測CKR-3的表面表達，通過用序列對應(yīng)于CKR-3N端35個氨基酸的合成多肽免疫老鼠，在受體N端區(qū)域產(chǎn)生單克隆抗體MAb，用ELISA檢測抗多肽MAb，根據(jù)與人嗜伊紅粒細胞的反應(yīng)性和對瞬間轉(zhuǎn)染子的染色，來鑒定識別天然受體的MAb。構(gòu)建CKR-3/pcDNA3插入HindⅢ限制酶位點并對緊靠啟始密碼子的5’Kozak序列優(yōu)化，對包含在1.8kb基因組片段中的CKR-3基因進行PCR。編碼區(qū)和338bp的3’-未翻譯區(qū)被插入到pcDNA3的HindⅢ位點，使該基因受載體的人CMV立即早期基因啟動子控制。建立這個FLAG-標記的Eos L2(CKR-3)受體構(gòu)建物的細節(jié)在實施例3中給出。轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定的細胞系選擇鼠前B淋巴細胞株L1.2由Eugene Butcher博士提供(Stanford University)并生長于RpMI-1640培養(yǎng)基中，補充以10％牛血清。20μg線性化的CKR-3/pcDNA3按照下述用來轉(zhuǎn)染細胞株。L1.2細胞在HBSS中洗兩次，并重懸浮于0.8ml相同的HBSS中。質(zhì)粒DNA和細胞混合，室溫下溫育10分鐘，轉(zhuǎn)入0.4cm電滲透管，單一脈沖250v,960μF。室溫溫育10分鐘后進行電滲透。加入G418，終濃度為0.8mg/ml，轉(zhuǎn)染48小時后，細胞加入到96孔盤中，25,000細胞/孔。用藥物選擇2-3周后，G418抗性細胞用5H12抗-受體mAb染色(見下面)并用FACScan分析。
具有可檢測表面染色的細胞株，用限制稀釋進行擴展和多次克隆，通過Northern雜交進一步分析有最亮表面染色的克隆，以確證轉(zhuǎn)染受體的存在，也可用RT-PCR法分析，互補于pcDNA3載體的T7引物為5’引物，CKR-3特異性引物為3’引物，在未加逆轉(zhuǎn)錄酶之前沒有擴增反應(yīng)。
為了短暫的轉(zhuǎn)染，電滲透中使用20μlg超螺旋DNA，和制備穩(wěn)定的細胞株完全一樣，48-72小時后檢測細胞表面染色。
用CKR-3/pcDNA3轉(zhuǎn)染的L1.2細胞在組織培養(yǎng)基中稀釋到1×106cells/ml。加入N-丁酸(鈉鹽，Sigma Chemical Corp.,Cat.No.B5887)至終濃度5mM(從1M母液被組織培養(yǎng)基稀釋獲得)。使用前，細胞生長過夜在37℃和5％Co2條件下(18-24小時)。較低濃度也已經(jīng)被成功地使用了。N-丁酸鹽處理已經(jīng)被報道能誘導(dǎo)蛋白質(zhì)水平提高約10倍，相對于未被誘導(dǎo)的對照而言。被人CMV立即早期基因啟動子驅(qū)動的CKR-3mRNA水平被n-丁酸鹽處理顯著地提高了。單克隆抗體制備和細胞流計合成多肽反應(yīng)活性MAb按實施例5的方法來制備。MAb按照下述用ELISA篩選。50μl肽，濃度為在碳酸鹽緩沖液中2μg/ml，將其用于包被NUNC96孔Maxisorp盤，4℃下至少4小時。300μl/孔的封閉緩沖液(PBS+1％BSA)被加入，至少2小時。盤子被用PBS/Tween20洗至少4次，將50μl的Mab上清液加入到每個孔中，并在37℃下培養(yǎng)1小時。用PBS/Tween20洗盤子4次，在每個孔中加入在PBS中按1∶500稀釋的堿性磷酸鹽-共軛的第二抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories,WestGrovePA)。在37℃下培養(yǎng)30分鐘后，用PBS/Tween20洗盤子4次。用于顏色反應(yīng)的底物是溶于二乙醇胺緩沖液中的p-硝基苯基磷酸鹽(Bio-Rad)。盤子在ELISA閱讀器上以410nm讀取數(shù)據(jù)。
為確定哪個抗多肽MAb能夠識別天然的表面表達的CKR-3，利用短暫轉(zhuǎn)染細胞和嗜伊紅粒細胞篩查抗多肽MAb。為了MAb染色，細胞用PBS洗滌一次，并重懸浮于100μl的PBS中，其中含有2％FCS、0.1％疊氮化鈉、5μg/ml純化的抗體、5μg/ml與對照Mab相配的同型MOPC-21 IgG1或100μl雜交瘤培養(yǎng)上清。在4℃下30分鐘后，細胞用FACS緩沖液洗兩次，重懸浮于100μl FITC-共軛的親和純化F(ab’)2山羊抗-鼠IgG。培養(yǎng)在4℃下30分鐘，用FACS緩沖液洗滌細胞兩次，F(xiàn)ACScan分析以確定表面的表達水平，碘化丙錠被用來排除死細胞。表面受體表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子圖10A顯示瞬間轉(zhuǎn)染受體的可檢測表面染色，在L1.2細胞的亞類群上進行，使用抗受體Mab,LS26-5H12。未轉(zhuǎn)染L1.2細胞為陰性。按上面所述，對轉(zhuǎn)染物進行有限稀釋克隆并選擇比較高的表面染色來建立了穩(wěn)定的細胞系。該過程產(chǎn)生了有較高受體表達的細胞株(圖10C)。Northern印跡分析證實一個亞克隆中轉(zhuǎn)染CKR-3mRNA的存在，標為E5，在未轉(zhuǎn)染L1.2細胞沒有存在(未顯示)。
實施例7穩(wěn)定L1.2轉(zhuǎn)染子的配體 結(jié)合特異性趨化因子重組人趨化因子得自于Peprotech,Inc.(Rocky Hill,NJ)，除了人趨紅素是利用固相合成法合成的，本法特別適于全自動多肽合成儀(model 430A；Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA)，所述如[Clark-Lewis,I.,et al.,Biochemistry,30:3128-3135(1991)]。人趨紅素也可從該Peprotech公司購買。標記用Bolton Hunter試劑(NEN)制備125Ⅰ-標記趨紅素，具體見[Coligan,J.E.,et al.,Eds.,1992,Current Protocols inImmunology(New York:John Wiley and Sons)]。經(jīng)計算，放射性標記趨紅素的特異活性為180 Ci/mM。配體結(jié)合用已經(jīng)報道的改良方法[Van Riper,G.,et al.,J.Exp.Med.177:851-856(1993)]進行趨化因子對靶細胞的結(jié)合實驗。細胞用PBS洗滌一次，重懸浮于結(jié)合緩沖液(50mM HEPES,pH7.5,1mM CaCl2,5mM MgCl2,0.5％BSA和0.05％疊氮物)，濃度為1×107/ml。將50μl的等份試樣(5×105細胞)分布于試管，加入冷競爭劑和放射標記的趨化因子，終濃度為200μl。非特異結(jié)合被確定下來，通過在250-500nM未標記趨化因子存在下，細胞和標記趨化因子溫育來實現(xiàn)。室溫下培養(yǎng)60分鐘后，用含有0.5M的NaCl結(jié)合緩沖液洗滌細胞三次。進行細胞計數(shù)。
競爭表示為特異結(jié)合的百分比，按100(S-B)/(T-B)計算，S是樣品的放射性，B是背景結(jié)合，T是沒有競爭劑的總結(jié)合。通過細胞和放射標記趨化因子以及至少400倍過量的未放射標記趨化因子溫育，獲得背景結(jié)合。趨紅素和E5細胞的總結(jié)合是11611±119cpm，背景結(jié)合是2248±745cpm。趨紅素和嗜伊紅粒細胞的總結(jié)合是7866±353cpm，而背景結(jié)合是1148±518cpm。實驗中都進行雙份，而且標準偏差都低于平均值的10％。用KaleidaGraph software計算曲線。
實施例6中的E5細胞株，用來檢測其結(jié)合放射標記趨紅素的能力。細胞與0.6nM125Ⅰ-標記的趨紅素和不同濃度的冷競爭劑溫育。圖11A顯示轉(zhuǎn)染細胞特異結(jié)合125Ⅰ-標記的趨紅素并具有高親和性。對結(jié)合數(shù)據(jù)用Scatchard分析表明分離系數(shù)(Kd)為1.5nM(圖11C)，類似于用純化人嗜伊紅粒細胞活動的數(shù)據(jù)0.5nM(圖11D)。此外，RANTES and MCP-3能夠競爭結(jié)合。沒有任何其他趨化因子包括MIP-1α、MIP-1β、和IL-8可以特異性競爭放射標記的配體(圖12)。趨化性實驗用改良的透內(nèi)皮實驗評價人嗜紅細胞的趨化性[Carr,M.W.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3652-3656(1994)]。實驗用內(nèi)皮細胞是歐洲保藏物中心(European Collection of Animal CellCultures,Porton Down,U.K.)的ECV304細胞株，在6.5mm直徑BiocoatTranswell組織培養(yǎng)器(Costar Corp.,Cambridge MA)上培養(yǎng)內(nèi)皮細胞，3.0μM的孔徑。ECV304的培養(yǎng)基由M199+10％小牛血清，L-谷氨酸和抗生素組成。
檢測培養(yǎng)基包括等量RPMI1640和M199，以及0.5％BSA。實驗前24小時，每個24孔趨化反應(yīng)板上裝2×105ECV304細胞，37℃溫育。向24孔組織培養(yǎng)板加入趨化因子(以檢測基質(zhì)稀釋)，終體積為600μl。內(nèi)皮覆蓋的組織培養(yǎng)物插入每個孔，并向上室加106細胞，終體積為100μl。平板在37℃,5％二氧化碳/95％空氣中溫育4小時。
用細胞流計來計算遷向下室的細胞，將500μl下室細胞懸液裝入試管，每30秒一個時間段計數(shù)細胞，本方法具有可重復(fù)性，并且只讓白細胞通過而排除碎片或其他細胞。本方法的計數(shù)結(jié)果和顯微鏡計數(shù)結(jié)果相吻合。
相同的方法還可用來評價L1.2細胞或L1.2受體轉(zhuǎn)染細胞的趨化性，不同的是Biocoat Transwell組織培養(yǎng)裝填子不外被內(nèi)皮細胞。帶有趨紅素RANTES和MCP-3應(yīng)激趨化性L1.2細胞的CKR-3表達在一系列濃度下檢測L1.2受體轉(zhuǎn)染子對一組趨化因子作出應(yīng)激性遷移的能力。CKR-3表達細胞E5對趨紅素，RANTES和MCP-3表現(xiàn)出趨化反應(yīng)，且對趨紅素的峰值為100ng/ml，盡管在低至10ng/ml的濃度下都能夠檢測到特異性遷移(圖13A)。雖然對RANTES的應(yīng)答在10ng/ml和100ng/ml都是明顯的，但是應(yīng)答強度低于趨紅素。MCP-3對E5細胞的趨化吸引能力低于嗜伊紅粒細胞，在低于100ng/ml檢測不到遷移。本細胞株對其他供試趨化因子無顯著應(yīng)答。在其他對照實驗中，向上孔加入趨化因子細胞并不遷向下室，證實了細胞遷移是趨化性的而不是化學(xué)促進性的(未示出)。
未轉(zhuǎn)染L1.2細胞對任何供試趨化因子無應(yīng)激性遷移(圖13B)。的確，L1.2細胞的一個顯著特征就是對非特異性配體僅有微弱背景趨化性。作為特異性對照，被IL-8RB轉(zhuǎn)染的L1.2細胞不僅對NAP-2和ENA-78應(yīng)答(未示出)，而且對IL-8和GROα(圖17C)應(yīng)答并有特異性遷移，但是不應(yīng)答其他CXC或CC趨化因子。其他轉(zhuǎn)染入L1.2細胞的趨化因子受體對其特異配體也有趨化能力，包括CKR-2轉(zhuǎn)染子(應(yīng)答MCP-1和MCP-3),CKR-1轉(zhuǎn)染子(應(yīng)答MIP-1α)和IL-8RA轉(zhuǎn)染子(應(yīng)答IL-8)(未示出)。百日咳毒素完全抑制了嗜紅細胞和CKR-3轉(zhuǎn)染子對趨紅素的趨化應(yīng)答，標志著在普通細胞和轉(zhuǎn)染細胞中，受體都是通過Gα亞族傳遞信號[Simon,M.I.,et al.,Science,252:802-808(1991)](未示出)。嗜伊紅粒細胞的趨化特性類似于CKR-3轉(zhuǎn)染子為評價普通嗜伊紅粒細胞的功能是否類似于CKR-3 L1.2轉(zhuǎn)染子，用嗜伊紅粒細胞進行趨化實驗，由富含嗜伊紅粒細胞(6-8％of WBC)的數(shù)個正常個體(人)獲得這些細胞(純化按照實施例5進行)。圖14A-14B顯示在兩個不同個體上發(fā)現(xiàn)的嗜伊紅粒細胞趨化性兩種特征模式，一種模式是對趨紅素有強烈的遷移，對RANTES和MCP-3只有弱的應(yīng)答(圖14A)，另一種模式是對趨紅素，RANTES和MCP-3都有相同的應(yīng)答。這些模式并非實驗差異所致，因為對于每一個對象，在很長的一段時間結(jié)果都可重復(fù)。在第二類個體，MIP-1α對嗜伊紅粒細胞只表現(xiàn)微弱趨化活性。
實施例8編碼Eos L2 cDNA的克隆嗜伊紅粒細胞cDNA文庫的構(gòu)建嗜伊紅粒細胞是從一名被診斷患有自發(fā)性嗜伊紅粒細胞增多癥的病人(M.V.)身上獲得[Costa,J.J.et al.,J.Clin.Invest.,91:2673(1993)]。因標準的胍基異硫氰酸/氯化銫法分離RNA[In:Current Protocols In Molecular Biology,Vol.1,Ausubel,F.M.et al.,Eds.,(John Wiley&Sons:New York,NY)page4.2.2-4.2.3(1991)]。用Dynabeads獲得mRNA(Dynal Inc.)，用對于cDNA合成和λ克隆的SuperScriptTMLambda系統(tǒng)構(gòu)建噬菌體文庫，它們帶由λgt22A、NotⅠ-SalⅠ臂。文庫篩查我們雙份篩查人嗜伊紅粒細胞cDNA文庫的約750,000個噬菌斑，所用探針是編碼MIP-1α/RANTES受體(CKR-1)的全長放射標記cDNA探針(P4cDNA)[Gao et al.,J.Exp.Med.,177:1421(1993)]。p4cDNA被克隆到pcDNAⅠ的BamHⅠ(5＇)和XhoⅠ(3＇)位點(Invitrogen)。通過限制性酶切獲得該克隆的BamHⅠ-Xhol片段(即，p4cDNA在pcDNAI中)，用Gene Clean分離。用隨機引物標記試劑盒將該片段標記上32P。
42℃溫育兩小時使濾膜預(yù)雜交，溶液是50％甲酰胺，5×SSC,1×Denhardt’s,10％Dextran Sulfate,20mM TRIS,pH7.5,0.1％SDS。雜交是用相同溶液在42℃過夜進行。嗜伊紅粒細胞cDNA文庫濾膜的洗滌是用2×SSC/0.1％SDS室溫下兩次，2×SSC/0.1％SDS 42℃兩次。每次洗30分鐘，濾膜暴露過夜，選擇陽性斑點兩次。在低嚴緊洗滌后，如果雙份為陽性，再進一步檢測克隆。cDNA克隆的鑒定斑點是純化的斑點，用少量噬菌體裂解方案分離DNA[In:Current Protocols In Molecular Biology,Vol.1,Suppl.10,Ausubel,F.M.et al.,Eds.,(John Wiley&Sons:New York,NY),page1.13.7(1991)]。用EcoRⅠ(載體臂中位點)和NotⅠ降解噬菌體DNA。降解所釋放的插入子在膠上可視化，約1.6kb長。用GeneClean(Bio101)分離斑點中稱為Mip-16或M-16中的約1.6kb的插入子，克隆到Bluescript載體KS(Stratagene)的EcoRⅠ和NotⅠ位點，事先用EcoRⅠ和NotⅠ降解以產(chǎn)生非對稱末端。連結(jié)的質(zhì)粒導(dǎo)入XL1-Blue大腸桿菌細胞(Stratagene)具體操作見Hanahan所述[Hanahan,D.,(1985),In:DNA Cloning,Volume 1,D.M.Glover,Ed.(IRL Press:Washington,D.C.),pp.109-135]。
用雙去氧核苷酸測序試劑盒測序M-16/Bluescript結(jié)構(gòu)體(得自于USB,United States Biochemical,Cleveland,OH)。該克隆的核苷酸序列被確定編碼一種高度類似于MIP-1α/RANTES受體的新型蛋白；但是從測序數(shù)據(jù)看，克隆不是完整長度的。
為鑒定全長克隆，再分離純化15-20個斑點，用限制性酶分析和/或測序鑒定噬菌體中的插入子。另一個λ克隆M31含有一個1.8kb插入子。插入子克隆到Bluescript載體KS的EcoRⅠ和NotⅠ位點，如上述再導(dǎo)入XL1-Blue大腸桿菌細胞。DNA測序該克隆(M31/Bluescript結(jié)構(gòu)體)，發(fā)現(xiàn)它編碼一個全長受體。
用EcoRⅠ和NotⅠ降解M31/Bluescript結(jié)構(gòu)體，釋放M31插入子，用Gene Clean分離出得到的片段，并插入到載體AprM9的EcoRⅠ和NotⅠ位點，事先用EcoRⅠ和NotⅠ降解生成非對稱末端。載體AprM9[de Fougerolles,A.R.et al.,J.Exp.Med.,177:1187-1192(1993)]是CDM8的衍生物，包含pBluescript的β-內(nèi)酰胺酶和psP64的多聚連接子。得到的結(jié)構(gòu)體A31導(dǎo)入適宜的XL1-Blue細胞。
圖2A-2B所示全長cDNA的核苷酸序列和所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列(還可參見SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)。圖2A-2B中所示的cDNA序列確定于克隆A31[堿基15-365(該數(shù)字如圖2A-2B中所示)]，和M-16/Bluescript結(jié)構(gòu)體[堿基366-1152(該數(shù)字如圖2A-2B中所示)]。與其它蛋白質(zhì)比較新受體的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)新受體和MIP-1α/RANTES受體之間有62％序列同源，和MCP-1受體之間有50.57％序列同源。用Wisconsin UWGCG包裝確定系列同源，并使用了Needleman和Wunsch算法[Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)]。Northern雜交分析用于Northern分析的RNA來自于一名嗜伊紅粒細胞增多癥病人。分離出嗜伊紅粒細胞[Costa,J.J.,et al.,J.Clin.Invest.,91:2673(1993)]。用標準程序分離嗜伊紅粒細胞總RNA[In:CurrentProtocols In Molecular Biology,Vol.I.Ausubel.F.M.et al.,Eds.,(John Wiley&Sons:New York,NY)page 4.2.2-4.2.3(1991)]。全RNA在1％瓊脂糖膠上分級，在Gene Screen濾膜(New EnglandNuclear)上印跡。根據(jù)實驗手冊上關(guān)于高嚴緊洗滌Gene Screen印跡(New England Nuclear)的方法，在高嚴緊條件標記濾膜。
準備多個Northern分析，其中一個用M16/Bluescript結(jié)構(gòu)體的EcoRⅠ-NotⅠ片段做探針，其他的用克隆A31的EcoRⅠ-NotⅠ片段做探針，兩種片段都包括3＇端未翻譯區(qū)。用隨機引物標記試劑盒(Boehringer Mannheim Biochemicals)將探針標記上32P。
每個Northern印跡都檢測到在全部人嗜伊紅粒細胞RNA中一長約1.8kb強烈信號的存在，結(jié)果指出該病人的嗜伊紅粒細胞有高水平的A31 RNA表達。
實施例9編碼Eos L2受體cDNA的表達及其配體結(jié)構(gòu)研究構(gòu)建載體A31和A31-pcDNA3被用在表達和結(jié)合分析。為構(gòu)建A31-pcDNA3，用EcoRⅠ和NotⅠ降解載體A31，用Gene Clean(Bio101)分離1.8kb的插入子，然后再插入載體pcDNA3的EcoRⅠ和NotⅠ位點，事先已經(jīng)被EcoRⅠ和NotⅠ降解。連結(jié)的結(jié)構(gòu)體稱為A31-pcDNA3，再導(dǎo)入適宜的XL1-Blue細胞。瞬間轉(zhuǎn)染用腎細胞293中的A31進行瞬間轉(zhuǎn)染最初說明A31和放射活性RANTES之間有高親合力。這些最初結(jié)構(gòu)研究很難重復(fù)。因此隨后產(chǎn)生了穩(wěn)定的細胞株，A31/pcDNA3穩(wěn)定整合到RBL(鼠嗜堿性白血病細胞)和293細胞。RBL細胞(保藏號，ATCCCRL1378)來自于美國培養(yǎng)物保藏中心[American Type CultureCollection,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD20852]，而293細胞(保藏號ATCC CRL1573)是I.Charo,GladstoneCardiovascular Institute饋贈的。穩(wěn)定的細胞株如下述構(gòu)建穩(wěn)定的細胞株。通過NotⅠ降解線性化A31-pcDNA3，用電滲透將之導(dǎo)入RBL和293細胞，再放到胰蛋白酶處理過的100×20mm平板上培養(yǎng)，重溶于1cc磷酸緩沖液(PBS)，在0.4cm管中960微法250伏特電滲透。在含有基因霉素的培養(yǎng)基中陽性篩選，分離出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子。細胞先在DMEM中培養(yǎng)，10％小牛血清，幾天后轉(zhuǎn)入DMEM,10％小牛血清和0.9mg/cc的基因霉素，3周后，用克隆柱篩選存活集落，一個克隆一個孔在DMEM上培養(yǎng)，10％小牛血清和0.9mg/cc基因霉素。
通過Northern分析檢測高水平表達A31 RNA的存活克隆，篩查了120個RBL穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子和38個293細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。用酸酚法[Chomczynski,P.and N.Sacchi,Anal.Biochem.,162:156-159(1987)]分離個別克隆的RNA,RNA用電滲透進行分級，在Gene Screen上印跡，按實驗手冊上關(guān)于高嚴緊洗滌提供印跡探針。分離質(zhì)粒A31的EcoRⅠ-NotⅠ插入子，利用隨機引物標記試劑盒標記上32P放射性標記，并作為探針。凝膠溴乙錠染色定量RNA，未轉(zhuǎn)染293或RBL細胞作為相應(yīng)的轉(zhuǎn)染物的陰性對照。
標為A31-293-#8,A31-293-#9,A31-293-#7和A31-293-#20的穩(wěn)定細胞株，相繼被發(fā)現(xiàn)能夠表達高水平的A31 RNA。Northern分析所發(fā)現(xiàn)高度表達A31的克隆A31-293-#20被選為進一步研究對象。
一種RBL細胞株被發(fā)現(xiàn)表達低-中量的RNA，但是在所用條件下不結(jié)合RANTES。配體結(jié)合穩(wěn)定的克隆A31-293-#20足量生長來用于結(jié)合分析。細胞生長在100mm平板DMEM中，10％小牛血清，0.9mg/cc基因霉素，平板生長豐富，制備膜按下述進行。移去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞兩次，通過TEN(40mM TRIS,pH7.5,1mMEDTA，和150mM NaCl)洗滌收獲細胞。在液氮中冷凍細胞，室溫下解凍，在錐形管18,000rpm離心10分鐘收集膜片段。由生產(chǎn)至富足的單一100mm盤收獲的膜的一半來確定每個結(jié)合點。
125Ⅰ-標記的RANTES購自于New England Nuclear，冷RANTES購自于Peprotech(Princeton,N.J.)。125Ⅰ-標記的MCP-3是New England Nuclear饋贈的，冷MCP-3饋贈自J.Van Damme,Rega Institute for Medical Research,University of Leuven,B-3000Leuven,Belgium[還可參見，Opdenakker,G.et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,191(2):535-542(1993)]。結(jié)合實驗是根據(jù)Van Riper的方法加以改良，0.125nM的125Ⅰ-RANTES與膜的結(jié)合，有不同濃度的未標記配體的存在。結(jié)合緩沖液是50mMHepes,1mM CaCl2,5mM MgCl2,0.5％BSA,pH7.2。放射性標記和冷配體同時加到膜上，室溫下保存1.5小時。結(jié)合反應(yīng)被加到2cc洗滌緩沖液中(0.5M NaCl,50mM Hepes,1mM CaCl2,5mM MgCl2,0.5％BSA,pH7.2)，攪拌混合，再置于被聚乙烯亞胺處理的Whatman GFC濾膜上。用2cc洗滌緩沖液洗滌濾膜，通過液閃計數(shù)確定保留在膜上的活性。濾膜置于5cc閃爍液體中，然而在一臺miniaxi-beta液閃計數(shù)儀上計數(shù)(UnitedTechnologies,Packard,Downers Grove,IL)。每個點測三次，除2nM的點只測兩次。
結(jié)果顯示RANTE和A31克隆編碼的受體之間有高親合力結(jié)合(圖15)，數(shù)據(jù)的Scatchard分析顯示RANTES的Kd值為約2.5nM，與普通細胞一樣。
利用上述的用于RANTES結(jié)合A31-293-#20膜的配體結(jié)合檢測來評價MCP-3與A31-293-#20膜的結(jié)合(圖16)，結(jié)合實驗包含0.125nM的125Ⅰ-標記的MCP-3。
另外，通過確定標記MCP-3的程度來評價結(jié)合特異性(在沒有冷MCP-3存在下可以結(jié)合)，能夠被冷MCP-3代替(圖17)，所有點都重復(fù)兩次。
MCP-3與未轉(zhuǎn)染細胞的膜的結(jié)合不能夠被125Ⅰ標記MCP-3代替，說明非特異性結(jié)合。相比之下，MCP-3與A31-293-#20細胞膜的結(jié)合能夠被熱MCP-3代替，說明特異結(jié)合。
這些實驗結(jié)果說明A31 cDNA編碼的受體特異結(jié)合人MCP-3
實施例10人嗜伊紅粒細胞通過一個主要受體對大量cc趨化因子作出應(yīng)答細胞，細胞株和組織培養(yǎng)。用CD16微珠(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)從肝素處理過的血中分離嗜伊紅粒細胞，具體見Ponath,P.D.et al.,J.Clin.Invest.,97:604-612(1996)，并且細胞學(xué)顯示純度≥99％。根據(jù)Ponath的方法[Ponath,P.D.,et al.,J.Clin.Invest.,97:604-612(1996)]分離中性細胞和PBMC。為生成CD3胚經(jīng)胞，2×106PBMC/ml于RPMI-1640加上10％FCS被加到組織培養(yǎng)板中，事先外被抗-CD3抗體TR66。4-6天后將胚細胞轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基，補充IL-2到50units/ml(由Antonio Lanzavecchia,Basel提供)。所用其他細胞株包括L1.2鼠前B細胞的轉(zhuǎn)染子，能高水平表達CCR3[見下面；Ponath,P.D.,et al.,J.Exp.Med.,183:2437-2448(1996)]、IL-8RA[Ponath,P.D.,et al.,J.Exp.Med.,183:2437-2448(1996)]、IL-8RB[Ponath,P.D.,et al.,J.Exp.Med.,183:2437-2448(1996)]、CCR2b,CCR4,CCR5,CCR1[Campbell,J.J.,et al.,J.Cell Biol.,134:255-266(1996)]中任何一個。在補充有10％牛血清和800μg/ml G418的RPMI-1640中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染子。用特異于CCR3[Ponath,P.D.,et al.,J.Exp.Med.,183:2437-2448(1996)]、,IL-8RA,IL-8RB或CCR2的mAb[Qin,S.,et al.,Eur.J.Immunol.26:640-647(1996)；Ponath,P.D.,et al.,J.Clin.Invest.,97:604-612(1996)]，檢測不同轉(zhuǎn)染中相關(guān)受體的表達。對于CCR4和CCR5，用抗-flag mAb M2檢測表達，因為這些受體在N端有此表位。
人嗜伊紅粒細胞培養(yǎng)于RPMI1640，帶有10％FCS和5ng/ml重組人IL-5,5-7天。用帶有亞豐富單層ECV304細胞的組織培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)。
對IL-8RA、IL-8RB、和CCR2(MCR-IR)的Mab都已經(jīng)被描述[Qin,S.,et al.,Eur.J.Immunol.26:640-647(1996)]。用標準方法對細胞進行mAb染色，具體如前所述[Ponath,P.D.,et al.,J.Exp.Med.,183:2437-2448(1996)]。為計數(shù)每個細胞的抗體結(jié)合位，用Simply細胞微珠(Flow Cytometry Standards Corp.,SanJuan,PR)確定7B11-FITC的F/P比率，用Quantum26微珠校正FACScan。100μl供體全血和超飽和量(400ng)帶有0.5％疊氮化物PBS中的7B11-FITC反應(yīng)。用氯化銨裂解紅細胞，通過細胞流計確定7B11染色細胞的平均區(qū)帶熒光強度。表達載體構(gòu)建和CCR3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子的產(chǎn)生1.8kb CKR-3(CCR3)基因組片段連接于pBluescriptⅡKS+載體的HindⅢ位點(見實施例2)，為便于表達對其改良，加入一個HindⅢ限制性位點，在緊靠起始密碼子5＇端處添加Kozak序列，具體的四步過程如實施例3所述[Construction of FLAG-tagged Eos L2(CKR-3)Receptor Construct]。
鼠前-β淋巴細胞L1.2培養(yǎng)于補有10％牛血清的RPMI-1640。通過ScaⅠ酶切線性化20μg FLAG-標記的CKR-3/pc DNA3結(jié)構(gòu)體(見實施例3)，用于轉(zhuǎn)染L1.2細胞。L1.2細胞用HBSS洗滌兩次，再溶于0.8ml的同樣的HBSS中，質(zhì)粒DNA與細胞混合，室溫下溫育10分鐘，轉(zhuǎn)入0.4cm電滲透管，250V,960μF的單一脈沖，然后室溫保持10分鐘。轉(zhuǎn)染后48小時加入G418成終濃度0.8mg/ml。將細胞放入96孔板，25,000細胞/孔。藥物篩選2-3周后，以5H12抗受體單克隆抗體染色G418抗性細胞，用FACScan(Becton Dickinson&Co.,Mountain View,CA)分析。為mAb染色，細胞用PBS洗滌一次，重溶于100ul的PBS中，其中含有2％FCS、0.1％疊氮化鈉、(FACS緩沖液)、5μg/ml親合純化抗體或5μg/ml MOPC-21IgG同型匹配對照mAb(SigmaChemical Co.,St.Louis,MO)，或100μl雜交培養(yǎng)上清液。4℃下30分鐘，細胞用FACS緩沖液洗滌兩次，重溶于100μl的FITC-連結(jié)的親合純化F(ab＇)2山羊抗-鼠IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories)。4℃下溫育30分鐘后，用FACS緩沖液洗滌兩次，用FACScan分析。用Propidium iodide排除死亡細胞。在分析或免疫前24小時，用5nM丁酸(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,Catalog No.B 5887)處理轉(zhuǎn)染子(FACS染色或結(jié)合)。所有的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子，包括如圖18A和18C描述的L1.2轉(zhuǎn)染子都用丁酸處理。帶有可檢測表面染色的細胞株進行擴展，并通過限制稀釋度克隆幾倍。作為一個陰性對照，用相關(guān)的對照IgG1mAb(MOPC-21)和相同的第二抗體染色CKR-3轉(zhuǎn)染細胞。另外，同時進行用IL-8RB轉(zhuǎn)染對照L1.2細胞，用5H12和第二抗體染色。熒光密度檢測到有最亮表面染色的CKR-3轉(zhuǎn)染克隆，被用作免疫原?？偟膩碚f，5H12染色細胞制備物有高于對照2-3logs的平均區(qū)帶熒光密度。免疫實驗所用產(chǎn)生單克隆抗體7B11的轉(zhuǎn)染子，顯示出高于MOPC-21和IL-8RB對照2logs的熒光密度。
用Northern雜交進一步分析最亮表面染色的克隆，以確定轉(zhuǎn)染受體的表達，也可以用RT-PCR，互補于pcDNA3載體的T7引物作為5＇引物，CKR-3特異引物作為3＇引物。不加逆轉(zhuǎn)錄酶，沒有擴增現(xiàn)象。單克隆抗體制備和細胞流計L1.2 CCR3轉(zhuǎn)染細胞按照上述制備，用PBS洗滌三次，重溶于200μl的PBS/107細胞。用107L1.2 CCR3轉(zhuǎn)染細胞免疫C57BL6老鼠，在兩周的時間里腹膜內(nèi)5-6次，最后的免疫是靜脈內(nèi)注射，產(chǎn)生可與CCR3反應(yīng)的單克隆抗體。四天后，取脾臟，細胞與SPI/O細胞進行融合[見Coligan,J.E.et al.,1992,In:CurrentProtocols In Immunology(John Wiley&Sons,New York),Unit2.5.4]。
用未轉(zhuǎn)染和CCR3轉(zhuǎn)染的L1.2細胞，鑒定CCR3反應(yīng)活性的單克隆抗體，用FACScan進行免疫熒光染色分析(BectonDickinison&Co.,Mountain View,CA)。雜交培養(yǎng)上清液被用于抗鼠Ig-FITC96孔模式的非直接免疫熒光檢測。用PBS洗滌未轉(zhuǎn)染的和CCR3轉(zhuǎn)染的L1.2細胞，重溶于50μl的FACS緩沖液，其含有2％的FCS、0.1％疊氮化鈉。加入50μl雜交培養(yǎng)上清液，4℃下培養(yǎng)30分鐘，F(xiàn)ACS緩沖液洗滌兩次，重溶于100μl的FITC-連結(jié)的親合純化F(ab＇)2山羊抗-鼠IgG。4℃下培養(yǎng)30分鐘，用FACS緩沖液洗滌兩次，用FACScan分析。篩選染色CCR-3轉(zhuǎn)染子而不染未轉(zhuǎn)染L1.2細胞的抗體。從兩個不同的融合，獲得兩個CCR3反應(yīng)活性的單克隆抗體。其中之一由7B11雜合子產(chǎn)生，稱為7B11。趨化因子，趨化性檢測和配體結(jié)合分析重組人趨化因子來自Peprotech(Rocky Hill,NJ)，趨紅素(Ponath,P.D.,et al.,J.clin.Invest.,97:604-612(1996))由Dr.IanClark-Lewis惠贈。用改良的透內(nèi)皮實驗評價人嗜伊紅粒細胞的趨化性[Carr,M.W.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3652-36561(1994)]，利用了ECV304細胞株[Ponath,P.D.,et al.,J.Clin.Invest.,97:604-612(1996)]。將遷入下室的細胞置于一個試管中，用FACScan細胞計數(shù)。
125Ⅰ-標記趨紅素來自Amersham(Arlington Heights,IL)，特異活性是2000 Ci/mM。趨化因子與靶細胞結(jié)合，具體見以前的描述[Ponath,P.D.et al.,J.Clin.Invest.,97:604-612(1996)；VanRiper,G.,et al.,J.Exp.Med.,177:851-856(1993)]。所有實驗都進行雙份，標準偏差通常小于平均值的10％。所有實驗至少重復(fù)三次。用KaleidaGraph軟件計算50％特異結(jié)合(IC50)的抑制濃度和曲線(Synergy Software,Reading,PA)。胞內(nèi)鈣離子濃度([CA2+])的測定50μg Fura-2AM(Molecular Probes,Eugene OR)溶解于44μl的DMSO中，用加載緩沖液稀釋到4.4ml(Hanks Balanced SaltSolution,Gibco/BRL,catalogue#14025-092 containing 2％BSA)。嗜伊紅粒細胞重溶于緩沖液成107cells/ml,1.5ml細胞和300μlFura-2溶液在37℃混合30分鐘。接下來標記，多余的染色劑離心除去，細胞重溶于125mM NaCl,5mM KCl,1mM CaCl2,0.5mM葡萄糖，0.025％BSA和20mM HEPES,pH7.4，終濃度106/ml。在Hitachi F-2000熒光光譜儀上用340nm和380nm激發(fā)來測定[Ca2+]I。用全部釋放的1％NP-40校正，25μM EGTA用來鰲合游離Ca2+。結(jié)果用mAb,7B11完全抑制趨紅素，RANTES和MCP-3對CCR3轉(zhuǎn)染子的結(jié)合。用抗CCR3多肽mAb 5H12篩選高水平表達CCR3的L1.2轉(zhuǎn)染子[實施例5，在本文中也稱為LS26-5H12；Ponath,P.D.,et al.,J.Clin.Invest.,97:604-612(1996)]。MAb 7B11能夠與CCR3轉(zhuǎn)染的L1.2細胞反應(yīng)，但不與CCR1,CCR26,CCR4,CCR5,CXCR1，或CXCR2轉(zhuǎn)染的L1.2細胞反應(yīng)(圖18A)。MAb 7B11顯著染色人嗜伊紅粒細胞(圖18B)。該mAb與淋巴細胞、CD3激活T細胞、單核細胞無反應(yīng)活性。對中性細胞的染色為陰性，盡管小比例細胞能夠表達非常少的受體?？娠@著被7B11染色的粒細胞小亞族(圖18A)是屬于粒細胞的嗜伊紅粒細胞。
評價mAb 7B11對125Ⅰ-標記的-趨紅素，125Ⅰ-RANTES,125Ⅰ-MCP-2,125Ⅰ-MCP-3，結(jié)合CCR3轉(zhuǎn)染子的抑制能力。MAb 7B11完全抑制125Ⅰ-標記的趨紅素結(jié)合轉(zhuǎn)染子(圖18C)，這種抑制作用和100nM冷趨紅素的一樣有效，這說明mAb 7B11能夠完全抑制趨紅素結(jié)合CCR3。該mAb也完全抑制125Ⅰ-標記的RANTES,125Ⅰ-標記的MCP-3和125Ⅰ-標記MCP-2結(jié)合CCR3轉(zhuǎn)染子(圖18C)，說明7B11識別的表位參與了多種CC趨化因子的結(jié)合。相反，mAb 7B11不能抑制RANTES結(jié)合CCR1轉(zhuǎn)染子(圖18C)。
MAb 7B11阻止放射標記趨紅素、RANTES、MCP-3結(jié)合嗜伊紅粒細胞。為檢測趨紅素、RANTES、MCP-3是否通過CCR3結(jié)合嗜伊紅粒細胞，在不同濃度抑制mAb 7B11或者一個對照mAb的存在下，進行放射標記趨化因子和嗜伊紅粒細胞的結(jié)合(圖19)。用適量7B11 mAb可以完全抑制125Ⅰ-標記趨紅素和嗜伊紅粒細胞的結(jié)合，這些實驗結(jié)果相吻合說明趨紅素僅結(jié)合嗜伊紅粒細胞上的CCR3[Ponath,P.D.,et al.,J.Exp.Med.,183:2437-2448(1996)]。除CCR3外，RANTES和MCP-3還結(jié)合趨化因子受體[Neote,K.,et al.,Cell72:415-425(1993)；Gao,J.L.,et al.,J.Exp.Med.,177:1421-1427(1993)；Ponath,P.D.,et al.,J.Exp.Med.,183:2437-2448(1996)]。圖19顯示mAb 7B11也抑制125Ⅰ-標記的RANTES和125Ⅰ-標記的MCP-3結(jié)合嗜伊紅粒細胞，50ng/mlmAb 7B11足夠完全抑制所有趨化因子結(jié)合普通嗜伊紅粒細胞，相當于2500倍量冷趨化因子的抑制效果。更少量的mAb 7B11就能夠抑制RANTES、MCP-3的結(jié)合，這與他們與CCR3有更低親合力相吻合[Ponath,P.D.,et al.,J.Exp.Med.,183:2437-2448(1996)]。
用抗CCR3 mAb抑制嗜伊紅粒細胞向CC趨化因子的趨化作用。用嗜伊紅粒細胞水平中等高的正常個體的嗜伊紅粒細胞進行趨化性實驗，圖20A顯示mAb 7B11能夠以一種劑量依賴方式完全抑制嗜伊紅粒細胞向趨紅素趨化，下孔的趨化因子為100ng/ml(12.5nM),5-10μg/ml的7B11就可以達到100％的抑制。圖20B顯示用5-10μg/ml的mAb 7B11就可以完全抑制嗜伊紅粒細胞對RANTES、MCP-2、MCP-3、MCP-4的趨化應(yīng)答。7B11不能抑制嗜伊紅粒細胞趨向C5a(圖20B)。mAb 7B11還不能抑制PBMC趨向RANTES，該過程通過趨化因子受體而不是CCR3。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)嗜伊紅粒細胞對趨化因子趨化應(yīng)答的供體到供體變體方式[Ponath,P.D.,et al.,J.Exp.Med.,183:2437-2448(1996)]。然而在這些全部供試個體里，mAb 7B11能夠抑制嗜伊紅粒細胞向趨紅素、RANTES、MCP-2、MCP-3、MCP-4遷移作用的95％以上。
MAb 7B11抑制嗜伊紅粒細胞應(yīng)答CC趨化因子的[Ca2+]I的改變。通過人嗜伊紅粒細胞趨紅素、RANTES、MCP-2、MCP-3、MCP-4能夠誘導(dǎo)[Ca2+]i的改變[Ponath,P.D.,et al.,J.Clin.Invest.,97:604-612(1996)；Uguccioni,M.,et al.,J.Exp.Med.,183:2379-2384(1996)]。為檢查mAb 7B11的支持劑/拮抗劑功能，在注射mAb 7B11或相關(guān)對照mAb后檢測嗜伊紅粒細胞的[Ca2+]I。在注射適量趨紅素、RANTES、MCP-2、MCP-3、MCP-4(圖21)后嗜伊紅粒細胞和相關(guān)mAb溫育也產(chǎn)生[Ca2+]的一種激動劑，被用作對照。
與6.4μg/ml 7B11 mAb溫育40秒的嗜伊紅粒細胞，不對趨紅素、RANTES、MCP-2、MCP-3、MCP-4作出應(yīng)答。這種抑制作用不是細胞表面受體調(diào)節(jié)的后果，因為這種作用是迅速的，對在室溫下和mAb 7B11溫育的嗜伊紅粒細胞的免疫熒光染色表現(xiàn)為一種劇烈染色。另外mAb 7B11是拮抗劑而不是支持劑，因為10μg/ml的mAb不誘導(dǎo)[Ca2+]I的改變，7B11處理過的嗜伊紅粒細胞對c5a表現(xiàn)出[Ca2+]i的改變(圖21)。MAb 7B11對于丁酸分化HL-60細胞應(yīng)答MIP-1α或RANTES的[Ca2+]i沒有效果，這種應(yīng)答由某種CCR3以外的受體介導(dǎo)。
IL-5前導(dǎo)的嗜伊紅粒細胞通過CCR3應(yīng)答CC趨化因子但調(diào)高IL-8受體。嗜伊紅粒細胞性個體的嗜酸繪圖儀出體培養(yǎng)IL-5前導(dǎo)的正常嗜伊紅粒細胞都在趨化試驗中應(yīng)答IL-8[Schweizer,R.C.,et al.,Blood,83:3697-3704(1994)；Sehmi,R.,et al.,Clin.Exp.Allergy,23:1027-1034(1994)]。說明活化的嗜伊紅粒細胞有改變了的趨化因子受體表達。為測試有前導(dǎo)的或活化的嗜伊紅粒細胞是否像正常嗜伊紅粒細胞那樣對CC趨化因子作出應(yīng)答，類似于圖20和21所示進行抑制實驗，采用5-7天IL-5激活嗜伊紅粒細胞，和嗜伊紅粒細胞性個體的嗜伊紅粒細胞。對所有正常供試個體(n=12)的嗜伊紅粒細胞，用mAb染色檢測不到IL-8受體，CXCR1和CXCR2。然而和人IL-5，離體培養(yǎng)5-7天后，CXCR2和(更低程度的)CXCR1，能夠在嗜伊紅粒細胞表面被檢測到，用抗-CXCR2 mAb和細胞流計，表達平行于這些嗜伊紅粒細胞遷向IL-8的能力。在一個供體嗜伊紅粒細胞里(18-25％WBC是嗜伊紅粒細胞，＞1年)CXCR2以較低水平表達于嗜伊紅粒細胞(圖22C)。
MAb 7B11仍然能夠以類似于抑制正常嗜伊紅粒細胞的方式，完全抑制IL-5前導(dǎo)嗜伊紅粒細胞和嗜伊紅粒細胞性供體的嗜伊紅粒細胞對MCP-2、MCP-3、MCP-4之外的趨紅素和RANTES所作出的鈣離子應(yīng)答。實驗里缺乏MIP-1α應(yīng)答的證據(jù)，在IL-5前導(dǎo)嗜伊紅粒細胞，大量健康個體的嗜伊紅粒細胞上檢測CCR3表達。經(jīng)計算每個健康個體嗜伊紅粒細胞的7B11結(jié)合位點數(shù)目為17,400±1600(n=12),IL-5激活后無顯著差異，然而在一個供試個體，7B11結(jié)合位點數(shù)目高達26,000。討論嗜伊紅粒細胞特有趨化因子的功能效果，包括能夠被抗-CCR3 mAb以強烈的拮抗劑活性完全抑制趨紅素、RANTES、MCP-2、MCP-3、MCP-4。MAb特異于CCR3，對其他趨化吸引受體無抑制作用，這些結(jié)果進一步確立CCR3是嗜伊紅粒細胞應(yīng)答CC趨化因子的主要受體，并質(zhì)疑CCR1、CCR2、CCR4、CCR5的關(guān)鍵作用。
嗜伊紅粒細胞的主要CC趨化因子受體是CCR3。通過配體結(jié)合研究和mAb染色顯示受體以高水平表達。最近的研究說明人嗜伊紅粒細胞以約CCR3 1-5％的水平表達MIP-1α受體，CCR1、CCR4或CCR5[Daugherty,B.L.,et al.,J.Exp.Med.,183:2349-2354(1996)]，在一些個體發(fā)現(xiàn)對MIP-1α的中度趨化應(yīng)答[見上面；Ponath,P.D.,et al.,J.Exp.Med.,183:2437-2448(1996)；Ponath,P.D.,et al.,J.Clin.Invest.,97:604-612(1996)]。然而使用mAb 7B11的實驗結(jié)果說明MIP-1α對于嗜伊紅粒細胞功能性應(yīng)答RANTES或MCP-3過程貢獻很小。在嗜伊紅粒細胞對CC趨化因子的應(yīng)答中見到了供體變化的作用。然而，用mAb7B11完全封閉所有個體的這些反應(yīng)就表明，如果有其它的趨化因子受體存在的話，它們也僅僅起很微小的作用。此外，IL-5-刺激的嗜伊紅粒細胞對CC趨化因子的應(yīng)答也可以被mAb 7B11封閉就說明，在細胞因子主宰的嗜伊紅粒細胞中沒有新的受體被上調(diào)[Loetscher,P.,et al.,J.Exp.Med.,184:569-577(1996)]。IL-8受體在IL-5主宰的或活化的嗜伊紅粒細胞上的相關(guān)性還不明確。本文中所描述的表型或功能分析與以前報道的IL-5刺激的嗜伊紅粒細胞、或從嗜伊紅粒細胞性供體來的嗜伊紅粒細胞、在趨化反應(yīng)中對IL-8的應(yīng)答都是相吻合的[Schweizer,R.C.,et al.,Blood,83:3697-3704(1994)；Sehmi,R.,et al.,Clin.Exp.Allergy,23:1027-1034(1994)]。
因此，如本文所述，對CC趨化因子受體全面拮抗的mAb已經(jīng)被鑒定出來了。CCR3拮抗劑可以應(yīng)用于治療疾病，例如，哮喘等，即抑制嗜伊紅粒細胞遷移到呼吸道能夠帶來有意效果的疾病都可被治療。因為在哮喘這類疾病中經(jīng)常發(fā)生選擇性的嗜伊紅粒細胞的聚集，所以，就建議了在嗜伊紅粒細胞遷移到哮喘患者的呼吸道的過程中的趨紅素-CCR3所扮演的角色。然而，趨紅素和其它的趨化因子在哮喘患者的呼吸道中都是被升高很多的[J.Rottmann and D.Ringler]，而且在過敏性呼吸道疾病的動物模型中也是如此[Jose,P.J.,et al.,J.Exp.Med.,179:881-887(1994)；Gonzalo,J.-A.,et al.,Immunity,4:1-14(1996)]。
實施例11用抗-CCR3單克隆抗體7B11封閉由趨紅素、RANTES和MCP-3誘導(dǎo)的嗜伊紅粒細胞的去粒作用由趨紅素、RANTES和MCP-3或C5a誘導(dǎo)的嗜伊紅粒細胞的去粒作用，以趨紅素、RANTES、MCP-3或C5a刺激后嗜伊紅粒細胞釋放到培養(yǎng)基中的嗜伊紅粒細胞過氧化物酶(EPO)的數(shù)量來測定的。EPO是在嗜伊紅粒細胞特異性顆粒中的一種嗜伊紅粒細胞酶。
本研究顯示抗-CCR3單克隆抗體7B11抑制由趨紅素、RANTES和MCP-3誘導(dǎo)的嗜伊紅粒細胞的去粒作用，而對C5a刺激的嗜伊紅粒細胞的去粒作用無效。C5a結(jié)合不同的受體，因此用其作為陰性對照。材料和方法Hank＇s平衡的鹽溶液(HBSS,Cat.No.14025-092)和Dulbecco＇s磷酸鹽緩沖的生理鹽水(PBS,Cat.No.14190-144)來自Gibco BRL。細胞松弛素B(C-6762)、過氧化氫(H2O2,3％溶液，H-6520)、DMSO(D-5879)、Tris(羥基甲基)氨基甲烷(T-1503)和o-亞苯基胺(P2903)都來自于Sigma ChemicalCo.,(St.Louis,MO)。聚苯烯V或圓底盤來自Costar公司。純化的人嗜伊紅粒細胞按照前述制備。嗜伊紅粒細胞的去顆粒檢測和單克隆抗體7B11的封閉在PBS中制備濃度為1mg/ml和0.1mg/ml的7B11抗體溶液(100x檢測終濃度)。趨化因子或C5a溶解于HBSS、25mMHepes、0.25％BSA緩沖液(檢測緩沖液)，是檢測終濃度的2倍濃度。
嗜伊紅粒細胞重懸浮于檢測緩沖液至2.5×106/ml(HBSS,25mM Hepes,0.25％BSA)。將1∶1000體積的5mg/ml細胞松弛素B溶于100％DMSO的溶液加入到嗜伊紅粒細胞懸浮液中(5μg/ml終濃度)。將100μl的細胞懸浮液加入到96孔V底盤中(0.25×106細胞/孔)。2μl的PBS的或抗體的溶液(1mg/ml或0.1mg/ml分別對應(yīng)于10μg/ml和1μg/ml的抗體終濃度)被加入到細胞中，將盤子放在37℃下10分鐘。培養(yǎng)后，細胞中加入100μl趨化因子溶液，或僅加入緩沖液，培養(yǎng)30分鐘。培養(yǎng)后，以160g在10℃下離心5分鐘。離心后，收集上清，按照下述檢測是否存在嗜伊紅粒細胞過氧化物酶。檢測一般都進行雙份。嗜伊紅粒細胞過氧化物酶檢測對EPO濃度的分析按照White,S.R.等人在J.Immunol.Meth.,44:257-263(1991)中所述方案進行，稍有修改。該檢測的基礎(chǔ)是，在有過氧化氫存在時，EPO氧化o-亞苯基亞胺。檢測的終濃度對底物和過氧化氫分別為16mM和0.01％。使用前才臨時制備底物母液(27mM底物，0.016％過氧化氫)，在0.1M TrispH8.0,0.1％Triton X-100中制備。簡言之，75μl的底物溶液于50μl樣品合并于平底96孔培養(yǎng)盤中，然后立即在492nm讀數(shù)，每15秒一次，共5分鐘。分光光度計讀數(shù)在微滴盤吸收分光光度計上進行(Dynatech MR4000,Dynatech Laboratories,Inc.,Chantilly,Virginia)。收集數(shù)據(jù)并用檢測管理軟件Biolinx TM的2.1版分析。反應(yīng)速度從接連的3-4點內(nèi)推計算。用過氧化物酶(HRP)作為對照。將動力學(xué)數(shù)據(jù)外推得到標準曲線，由2、5、10和20ng的HRP對以每百萬個細胞為單位的EPO活性制作，每單位活性相對于1ng的HRP的活性。因此，每單位EPO定義為給予相等于1ng的HRP產(chǎn)生的活性蛋白質(zhì)的數(shù)量。結(jié)果在兩個分開的實驗中，mAb 7B11封閉趨紅素-誘導(dǎo)的從嗜伊紅粒細胞中釋放過氧化物酶。圖23A顯示濃度為10μg/ml的7B11明顯地一直由10nM或100nM的RANTES或MCP-3誘導(dǎo)的去顆粒化。由100nM的趨紅素、RANTES或MCP-3誘導(dǎo)的去顆粒化分別被抑制了99％、77％和72％。由10nM的趨紅素誘導(dǎo)的去顆?；?μg/ml和10μg/ml的7B11分別抑制了65％和85％。重要的是，如圖23B所示，mAb 7B11沒有抑制由C5a誘導(dǎo)的去顆?；?。
以前的研究顯示，由趨紅素刺激的EPO釋放平行于其它的嗜伊紅粒細胞性顆粒酶和蛋白質(zhì)的釋放，例如，嗜伊紅粒細胞陽離子蛋白質(zhì)(ECP)(圖24A)，葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶B(圖25-27)。EPO、ECP和葡糖苷酸酶存在于嗜伊紅粒細胞特異性顆粒中，而芳基硫酸酯酶存在于小顆粒中。因此，趨紅素誘導(dǎo)特異性顆粒和小顆粒的去顆?；D25-27顯示，對EPO釋放的趨紅素劑量反應(yīng)曲線平行于其它的嗜伊紅粒細胞性蛋白質(zhì)釋放的劑量反應(yīng)曲線。這些檢測都基本按照前面在嗜伊紅粒細胞去顆?；瘷z測的材料和方法中所描述的進行。然后，用已經(jīng)建立的程序?qū)ι锨鍣z測是否存在嗜伊紅粒細胞顆粒蛋白。對ECP，使用了市售的放射免疫檢測試劑盒(Pharmacia Diagnostics,Cat.No.10-9165-01)。對葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶B的酶檢測按照Kroegel,C.，等人在J.of Immunol.,142:3518-3526(1989)中所述進行。
在嗜伊紅粒細胞的去顆粒化研究中選擇EPO酶的原因是對檢測和定量方便。趨紅素釋放的EPO總體上反應(yīng)嗜伊紅粒細胞的去顆粒化。因為EPO釋放平行于其它的嗜伊紅粒細胞的蛋白質(zhì)和酶的釋放，相似地，由封閉EPO釋放所測定的7B11對由趨紅素誘導(dǎo)的去顆?；姆忾]，將也反應(yīng)對其它的嗜伊紅粒細胞蛋白質(zhì)和酶釋放的封閉。
實施例12嗜堿細胞表達CCR3材料和方法細胞流計。用細胞流計檢測全血中細胞表達的CCR3。100μl肝素化全血用400ng的7B11(抗-CCR3)-FITC制劑和500ng生物素偶聯(lián)的抗-人IgE(PharMingen,San Diego,CA)在有100μl的PBS和0.1％疊氮物存在下于室溫下20-30分鐘染色。細胞在有疊氮物的PBS中洗一次，用5μl的鏈酶抗生物素蛋白量紅染色(Sigma Immuno Chemicals,St.Louis,MO)，室溫下15-30分鐘。用2ml的氯化銨裂解緩沖液裂解細胞，收集白細胞并重懸浮于PBS中，用于在FACScan細胞流計分析(Becton Dickinson,Mountain View,CA)。將細胞分類后，對染色細胞用眼觀察分析，染色如上所述，使用FACSvantage細胞流計(Becton Dickinson)，和制備Diff Quik(Baxter Scientific Products,McGaw Park,Ⅱ)染色的收集的細胞的玻片。
計數(shù)位點/細胞。細胞按前述進行用于細胞流計的染色。對樣品進行分析后，將含有Quantum26微珠(Flow CytometryStandards Corp.,San Juan,PR)的試管用于熒光校正。對7B11/FITC制劑的MFSF/蛋白質(zhì)比率用Simply Cellular微珠確定(Flow Cytometry Standards Corp.)。染色細胞的中間道的熒光被用來計算結(jié)合抗體/細胞的平均值。結(jié)果已經(jīng)顯示了識別CCR3的單克隆抗體7B11，僅僅識別全血制劑中的兩個細胞成分(圖28)。其中之一可以顯示出具有在其表面的高水平的IgE，另一個則沒有。分類的細胞缺乏IgE，但用7B11的染色則為97.3％±0.6嗜伊紅粒細胞，從分類的細胞的染色玻片中鑒定。在其表面帶有高水平IgE的細胞并用7B11染色后，顯示為嗜堿性細胞(92％±4.6)，雖然IgE染色、細胞裂解和樣品分類的方法都導(dǎo)致絕大多數(shù)細胞的去顆?；?。對給定個體，嗜伊紅粒細胞一致地具有比嗜堿性細胞稍高數(shù)量的每個細胞的受體數(shù)量(p＜0.001，成對T檢驗)。從對30名個體的分析中，得到的7B11結(jié)合位點/嗜伊紅粒細胞平均值為24,700±5700；而位點/嗜堿性細胞的平均值為19,000±4500。
對全血用7B11-FITC和抗-人IgE-生物素染色，隨后是鏈酶生物素量紅，用細胞流計分析。對全血的兩種染色的分析表明，這兩個種群帶有CCR3(圖28)，其中一個種群被用抗-人IgE雙重染色。比較抗-人CCR3的染色強度表明，對CCR3表達，嗜伊紅粒細胞一致地比嗜堿性細胞的染色強度高。這兩個細胞種群的身份用常規(guī)組織學(xué)染色鑒定，IgE(+)CCR3(+)種群被發(fā)現(xiàn)為嗜堿性細胞(去顆?；?，而IgE(-)CCR3(+)種群被發(fā)現(xiàn)為嗜伊紅粒細胞。對兩個種群的前面和側(cè)面的散射表明，這些細胞的散射性質(zhì)與其細胞類型的其它的性質(zhì)相一致。
實施例13嗜堿性細胞對趨紅素和MCP-4的趨化性被抗-CCR3 mAb的封閉白細胞從未選擇的健康志愿者獲得，分離后用不連續(xù)密度離心分開個組分，具體見[Kurimoto,Y.,et al.,J.Exp.Med.,170:467(1989)；Bischoff,S.C.,et al.,Blood,79:2662(1990)]。簡言之，對靜脈血用10mM EDTA抗凝集，與0.25體積的葡聚糖混合(6％在NaCl 0.9％中)，室溫下讓紅細胞沉降。90分鐘后，收集白細胞，用HA緩沖液洗3次(20mM Hepes,125mM NaCl,5mM KCl,0.5mM葡萄糖，0.025牛血清白蛋白)。為了豐富嗜堿性細胞顆粒細胞，白細胞用Ficoll Hypaque密度離心分開各組分，嚴格按照Kurimoto,Y.,et al.,J.Exp.Med.,170:467(1989)進行。對白細胞的各組分用不連續(xù)Percoll梯度離心獲取純化的嗜堿性細胞[Bischoff,S.C.,et al.,Blood,79:2662(1990)]。收集被富集的嗜堿性細胞，在HA緩沖液中洗，重懸浮于150μl HA緩沖液，于順磁微粒培養(yǎng)40分鐘，微粒上包被有抗CD3(12μl)、CD4(15μl)、CD8(12μl)、CD14(5μl)、CD16(5μl)、和CD19(5μl)的mAb。磁性染色的細胞懸浮液過處于強磁場種的分離柱，去掉污染細胞(MACS system,Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach,FRG)。聯(lián)合使用Percoll梯度離心以及用免疫磁性微珠進行陰性篩選，得到的嗜堿性細胞的純度為80-95％(污染物都是小淋巴細胞)，收復(fù)率為30-60％(由MayGruenwald/Giemsa染色的細胞離心玻片和對總組胺含量的測定來決定的)。細胞最終在HA緩沖液中洗3次，重懸浮于HACM緩沖液(HA緩沖液補充以1mM MgCl2和1mM CaCl2)。組胺和LTC4釋放細胞(80-180×103/ml)在含有125mM葡萄糖和0.025％BSA的20mM Hepes,pH7.4中，加溫到37℃，接觸IL-3(10ng/ml)，帶有或沒有抗-CCR3(5μg/ml)，然后對其攻擊。20分鐘后，將試管放在冰上，測量上清中的組胺和LTC4[Dahinden,C.A.,et al.,J.Exp.Med.,179:751(1994)]。組胺的釋放表達為樣品總含量的百分數(shù)(細胞溶胞后確定)。LTC4的產(chǎn)生表達為LTC4/D4/E4每ng總組胺(其相應(yīng)于1,000嗜堿性細胞)。
如圖29所示，嗜堿性細胞應(yīng)答趨化因子而釋放組胺，而組胺的釋放可以被mAb 7B11封閉。趨化反應(yīng)將趨化因子加入到48孔趨化室的下面的各孔中(NeuroProbe,Cabin John,MD)。細胞懸浮于RPMI1640,20mM Hepes和1％PPL,pH7.4，帶有或沒有抗-CCR3(5μg/ml)，并放置在上面的孔中(每孔50,000個細胞)。在5％CO2和37℃下50分鐘后，由對聚碳酸酯濾膜(不含有聚乙烯吡咯烷酮，5μm孔徑，Nucleopore Corp.,Pleasanton,CA)的分析確定發(fā)生了遷移。在用May-Gruenwald/Giemsa染色后，顯微鏡下計數(shù)濾膜下表面的遷移的細胞數(shù)目。
如圖30A和30B所示，嗜堿性細胞趨向于趨紅素和MCP-4,這種應(yīng)答被抗CCR3 mAb 7B11封閉。等同物本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠采用不超過常規(guī)的實驗來認識或確定那些本發(fā)明描述的具體實施方案的眾多等同物。這些等同物都室包括在本發(fā)明的權(quán)利要求書中的。
序列清單(1)總體信息(ⅰ)申請人(A)名稱LeukoSite,Inc.
(B)街道215 First Street(C)城市Cambridge(D)州/省Massachusetts(E)國家USA(F)郵編/區(qū)號02142(G)電話(617)621-9350(I)傳真(617)621-9349(ⅱ)發(fā)明名稱G-蛋白質(zhì)偶聯(lián)的受體基因(ⅲ)序列數(shù)量18(ⅳ)通訊地址(A)收言人Hamilton,Brook,Smith&Reynolds,P.C.
(B)街道Two Militia Drive(C)城市Lexington(D)州Massachusetts(E)國家USA(F)郵編02173(ⅴ)計算機存儲形式(A)存盤形式軟盤(B)計算機IBM PC兼容
(C)工作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(ⅵ)本申請數(shù)據(jù)(A)A申請?zhí)朠CT/US97/17103(B)申請日24-SEP-1997(C)分類(ⅶ)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S08/720,565(B)申請日30-09-1996(ⅶ)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S08/375,199(B)申請日19-JAN-1995(ⅷ)律師/代理人信息(A)名稱Brook,David E.
(B)注冊號22,592(C)案卷號LKS94-05A3 PCT(ⅸ)通訊信息(A)電話781-861-6240(B)傳真781-861-9540(2)關(guān)于SEQ ID NO:1(ⅰ)序列特征(A)長度1689堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型雙鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:AATCCTTTTC CTGGCACCTC TGATATCCTT TTGAAATTCA TGTTAAAGAA TCCCTAGGCT 60GCTATCACAT GTGGCATCTT TGTTGAGTAC ATGAATAAAT CAACTGGTGT GTTTTACGAA 120GGATGATTAT GCTTCATTGT GGGATTGTAT TTTTCTTCTT CTATCACAGG GAGAAGTGAA 180ATGACAACCT CACTAGATAC AGTTGAGACC TTTGGTACCA CATCCTACTA TGATGACGTG 240GGCCTGCTCT GTGAAAAAGC TGATACCAGA GCACTGATGG CCCAGTTTGT GCCCCCGCTG 300TACTCCCTGG TGTTCACTGT GGGCCTCTTG GGCAATGTGG TGGTGGTGAT GATCCTCATA 360AAATACAGGA GGCTCCGAAT TATGACCAAC ATCTACCTGC TCAACCTGGC CATTTCGGAC 420CTGCTCTTCC TCGTCACCCT TCCATTCTGG ATCCACTATG TCAGGGGGCA TAACTGGGTT 480TTTGGCCATG GCATGTGTAA GCTCCTCTCA GGGTTTTATC ACACAGGCTT GTACAGCGAG 540ATCTTTTTCA TAATCCTGCT GACAATCGAC AGGTACCTGG CCATTGTCCA TGCTGTGTTT 600GCCCTTCGAG CCCGGACTGT CACTTTTGGT GTCATCACCA GCATCGTCAC CTGGGGCCTG 660GCAGTGCTAG CAGCTCTTCC TGAATTTATC TTCTATGAGA CTGAAGAGTT GTTTGAAGAG 720ACTCTTTGCA GTGCTCTTTA CCCAGAGGAT ACAGTATATA GCTGGAGGCA TTTCCACACT 780CTGAGAATGA CCATCTTCTG TCTCGTTCTC CCTCTGCTCG TTATGGCCAT CTGCTACACA 840GGAATCATCA AAACGCTGCT GAGGTGCCCC AGTAAAAAAA AGTACAAGGC CATCCGGCTC 900ATTTTTGTCA TCATGGCGGT GTTTTTCATT TTCTGGACAC CCTACAATGT GGCTATCCTT 960CTCTCTTCCT ATCAATCCAT CTTATTTGGA AATGACTGTG AGCGGACGAA GCATCTGGAC1020CTGGTCATGC TGGTGACAGA GGTGATCGCC TACTCCCACT GCTGCATGAA CCCGGTGATC1080TACGCCTTTG TTGGAGAGAG GTTCCGGAAG TACCTGCGCC ACTTCTTCCA CAGGCACTTG1140CTCATGCACC TGGGCAGATA CATCCCATTC CTTCCTAGTG AGAAGCTGGA AAGAACCAGC1200TCTGTCTCTC CATCCACAGC AGAGCCGGAA CTCTCTATTG TGTTTTAGGT AGATGCAGAA1260AATTGCCTAA AGAGGAAGGA CCAAGGAGAT NAAGCAAACA CATTAAGCCT TCCACACTCA1320CCTCTAAAAC AGTCCTTCAA ACCTTCCAGT GCAACACTGA AGCTCTTAAG ACACTGAAAT1380ATACACACAG CAGTAGCAGT AGATGCATGT ACCCTAAGGT CATTACCACA GGCCAGGGCT1440GGGCAGCGTA CTCATCATCA ACCTAAAAAG CAGAGCTTTG CTTCTCTCTC TAAAATGAGT1500TACCTATATT TTAATGCACC TGAATGTTAG ATAGTTACTA TATGCCGCTA CAAAAAGGTA1560AAACTTTTTA TATTTTATAC ATTAACTTCA GCCAGCTATT ATATAAATAA AACATTTTCA1620CACAATACAA TAAGTTAACT ATTTTATTTT CTAATGTGCC TAGTTCTTTC CCTGCTTAAT1680GAAAAGCTT 1689(3)關(guān)于SEQ ID NO:2(ⅰ)序列特征(A)長度355氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Thr Thr Ser Leu Asp Thr Val Glu Thr Phe Gly Thr Thr Ser Tyr1 5 10 15Tyr Asp Asp Val Gly Leu Leu Cys Glu Lys Ala Asp Thr Arg Ala Leu20 25 30Met Ala Gln Phe Val Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Thr Phe Gly35 40 45Leu Leu Gly Ash Val Val Val Val Met Ile Leu Ile Lys Tyr Arg Arg50 55 60Leu Arg Ile Met Thr Asn Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp65 70 75 80Leu Leu Phe Leu Val Thr Leu Pro Phe Trp Ile His Tyr Val Arg Gly85 90 95His Asn Trp Val Phe Gly His Gly Met Cys Lys Leu Leu Ser Gly Phe100 105 110Tyr His Thr Gly Leu Tyr Ser Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr115 120 125Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe Ala Leu Arg Ala130 135 140Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Ile Thr Ser Ile Val Thr Trp Gly Leu145 150 155 160Ala Val Leu Ala Ala Leu Pro Glu Phe Ile Phe Tyr Glu Thr Glu Glu165 170 175Leu Phe Glu Glu Thr Leu Cys Ser Ala Leu Tyr Pro Glu Asp Thr Val180 185 190Tyr Ser Trp Arg His Phe His Thr Leu Arg Met Thr Ile Phe Cys Leu195 200 205Val Leu Pro Leu Leu Val Met Ala Ile Cys Tyr Thr Gly Ile Ile Lys210 215 220Thr Leu Leu Arg Cys Pro Ser Lys Lys Lys Tyr Lys Ala Ile Arg Leu225 230 235 240Ile Phe Val Ile Met Ala Val Phe Phe Ile Phe Trp Thr Pro Tyr Asn245 250 255Val Ala Ile Leu Leu Ser Ser Tyr Gln Ser Ile Leu Phe Gly Asn Asp260 265 270Cys Glu Arg Thr Lys His Leu Asp Leu Val Met Leu Val Thr Glu Val275 280 285Ile Ala Tyr Ser His Cys Cys Met Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe Val290 295 300Gly Glu Arg Phe Arg Lys Tyr Leu Arg His Phe Phe His Arg His Leu305 310 315 320Leu Met His Leu Gly Arg Tyr Ile Pro Phe Leu Pro Ser Glu Lys Leu325 330 335Glu Arg Thr Ser Ser Val Ser Pro Ser Thr Ala Glu Pro Glu Leu Ser340 345 350Ile Val Phe355(2)關(guān)于SEQ ID NO:3(ⅰ)序列特征(A)長度1193堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特點(A)名稱/KEY:CDS(B)位置92..1156(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:TTGTGCTTAT CCGGGCAAGA ACTTATCGAA ATACAATAGA AGACCCACGC GTCCGGTTTT 60TACTTAGAAG AGATTTTCAG GGAGAAGTGA A ATG ACA ACC TCA CTA GAT ACA112Met Thr Thr Ser Leu Asp Thr1 5GTT GAG ACC TTT GGT ACC ACA TCC TAC TAT GAT GAC GTG GGC CTG CTC 160Val Glu Thr Phe Gly Thr Thr Ser Tyr Tyr Asp Asp Val Gly Leu Leu10 15 20TGT GAA AAA GCT GAT ACC AGA GCA CTG ATG GCC CAG TTT GTG CCC CCG 208Cys Glu Lys Ala Asp Thr Arg Ala Leu Met Ala Gln Phe Val Pro Pro25 30 35CTG TAC TCC CTG GTG TTC ACT GTG GGC CTC TTG GGC AAT GTG GTG GTG 256Leu Tyr Ser Leu Val Phe Thr Val Gly Leu Leu Gly Ash Val Val Val40 45 50 55GTG ATG ATC CTC ATA AAA TAC AGG AGG CTC CGA ATT ATG ACC AAC ATC 304Val Met Ile Leu Ile Lys Tyr Arg Arg Leu Arg Ile Met Thr Ash Ile60 65 70TAC CTG CTC AAC CTG GCC ATT TCG GAC CTG CTC TTC CTC GTC ACC CTT 352Tyr Leu Leu Ash Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu Val Thr Leu75 80 85CCA TTC TGG ATC CAC TAT GTC AGG GGG CAT AAC TGG GTT TTT GGC CAT 400Pro Phe Trp Ile His Tyr Val Arg Gly His Asn Trp Val Phe Gly His90 95 100GGC ATG TGT AAG CTC CTC TCA GGG TTT TAT CAC ACA GGC TTG TAC AGC 448Gly Met Cys Lys Leu Leu Ser Gly Phe Tyr His Thr Gly Leu Tyr Ser105 110 115GAG ATC TTT TTC ATA ATC CTG CTG ACA ATC GAC AGG TAC CTG GCC ATT 496Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile120 125 130 135GTC CAT GCT GTG TTT GCC CTT CGA GCC CGG ACT GTC ACT TTT GGT GTC 544Val His Ala Val Phe Ala Leu Arg Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly Val140 145 150ATC ACC AGC ATC GTC ACC TGG GGC CTG GCA GTG CTA GCA GCT CTT CCT 592Ile Thr Ser Ile Val Thr Trp Gly Leu Ala Val Leu Ala Ala Leu Pro155 160 165GAA TTT ATC TTC TAT GAG ACT GAA GAG TTG TTT GAA GAG ACT CTT TGC 640Glu Phe Ile Phe Tyr Glu Thr Glu Glu Leu Phe Glu Glu Thr Leu Cys170 175 180AGT GCT CTT TAC CCA GAG GAT ACA GTA TAT AGC TGG AGG CAT TTC CAC 688Ser Ala Leu Tyr Pro Glu Asp Thr Val Tyr Ser Trp Arg His Phe His185 190 195ACT CTG AGA ATG ACC ATC TTC TGT CTC GTT CTC CCT CTG CTC GTT ATG 736Thr Leu Arg Met Thr Ile Phe Cys Leu Val Leu Pro Leu Leu Val Met200 205 210 215GCC ATC TGC TAC ACA GGA ATC ATC AAA ACG CTG CTG AGG TGC CCC AGT 784Ala Ile Cys Tyr Thr Gly Ile Ile Lys Thr Leu Leu Arg Cys Pro Ser220 225 230AAA AAA AAG TAC AAG GCC ATC CGG CTC ATT TTT GTC ATC ATG GCG GTG 832Lys Lys Lys Tyr Lys Ala Ile Arg Leu Ile Phe Val He Met Ala Val235 240245TTT TTC ATT TTC TGG ACA CCC TAC AAT GTG GCT ATC CTT CTC TCT TCC 880Phe Phe Ile Phe Trp Thr Pro Tyr Asn Val Ala Ile Leu Leu Ser Ser250 255 260TAT CAA TCC ATC TTA TTT GGA AAT GAC TGT GAG CGG AGC AAG CAT CTG 928Tyr Gln Ser Ile Leu Phe Gly Asn Asp Cys Glu Arg Ser Lys His Leu265 270 275GAC CTG GTC ATG CTG GTG ACA GAG GTG ATC GCC TAC TCC CAC TGC TGC 976Asp Leu Val Met Leu Val Thr Glu Val Ile Ala Tyr Ser His Cys Cys280 285 290 295ATG AAC CCG GTG ATC TAC GCC TTT GTT GGA GAG AGG TTC CGG AAG TAC 1024Met Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe Val Gly Glu Arg Phe Arg Lys Tyr300 305 310CTG CGC CAC TTC TTC CAC AGG CAC TTG CTC ATG CAC CTG GGC AGA TAC 1072Leu Arg His Phe Phe His Arg His Leu Leu Met His Leu Gly Arg Tyr315 320 325ATC CCA TTC CTT CCT AGT GAG AAG CTG GAA AGA ACC AGC TCT GTC TCT 1120Ile Pro Phe Leu Pro Ser Glu Lys Leu Glu Arg Thr Ser Ser Val Ser330 335 340CCA TCC ACA GCA GAG CCG GAA CTC TCT ATT GTG TTT TAGGTAGATG 1166Pro Ser Thr Ala Glu Pro Glu Leu Ser Ile Val Phe345 350 355CAGAAAATTG CCTAAAGAGG AAGGACC1193(2)關(guān)于SEQ ID NO:4(ⅰ)序列特征(A)長度355氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Met Thr Thr Ser Leu Asp Thr Val Glu Thr Phe Gly Thr Thr Ser Tyr1 5 10 15Tyr Asp Asp Val Gly Leu Leu Cys Glu Lys Ala Asp Thr Arg Ala Leu20 25 30Met Ala Gln Phe Val Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Thr Val Gly35 40 45Leu Leu Gly Asn Val Val Val Val Met Ile Leu Ile Lys Tyr Arg Arg50 55 60Leu Arg Ile Met Thr Asn Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp65 70 75 80Leu Leu Phe Leu Val Thr Leu Pro Phe Trp Ile His Tyr Val Arg Gly85 90 95His Asn Trp Val Phe Gly His Gly Met Cys Lys Leu Leu Ser Gly Phe100 105 110Tyr His Thr Gly Leu Tyr Ser Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr115 120 125Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe Ala Leu Arg Ala130 135 140Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Ile Thr Ser Ile Val Thr Trp Gly Leu145 150 155 160Ala Val Leu Ala Ala Leu Pro Glu Phe Ile Phe Tyr Glu Thr Glu Glu165 170 175Leu Phe Glu Glu Thr Leu Cys Ser Ala Leu Tyr Pro Glu Asp Thr Val180 185 190Tyr Ser Trp Arg His Phe His Thr Leu Arg Met Thr Ile Phe Cys Leu195 200 205Val Leu Pro Leu Leu Val Met Ala Ile Cys Tyr Thr Gly Ile Ile Lys210 215 220Thr Leu Leu Arg Cys Pro Ser Lys Lys Lys Tyr Lys Ala Ile Arg Leu225 230 235 240Ile Phe Val Ile Met Ala Val Phe Phe Ile Phe Trp Thr Pro Tyr Asn245 250 255Val Ala Ile Leu Leu Ser Ser Tyr Gln Ser Ile Leu Phe Gly Ash Asp260 265 270Cys Glu Arg Ser Lys His Leu Asp Leu Val Met Leu Val Thr Glu Val275 280 285Ile Ala Tyr Ser His Cys Cys Met Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe Val290 295 300Gly Glu Arg Phe Arg Lys Tyr Leu Arg His Phe Phe His Arg His Leu305 310 315 320Leu Met His Leu Gly Arg Tyr Ile Pro Phe Leu Pro Ser Glu Lys Leu325 330 335Glu Arg Thr Ser Ser Val Ser Pro Ser Thr Ala Glu Pro Glu Leu Ser340 345 350Ile Val Phe355(2)關(guān)于SEQ ID NO:5(ⅰ)序列特征(A)長度1116堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:CAGGGAGAAG TGAAATGACA ACCTCACTAG ATACAGTTGA GACCTTTGGT ACCACATCCT 60ACTATGATGA CGTGGGCCTG CTCTGTGAAA AAGCTGATAC CAGAGCACTG ATGGCCCAGT 120TTGTGCCCCC GCTGTACTCC CTGGTGTTCA CTGTGGGCCT CTTGGGCAAT GTGGTGGTGG 180TGATGATCCT CATAAAATAC AGGAGGCTCC GAATTATGAC CAACATCTAC CTGCTCAACC 240TGGCCATTTC GGACCTGCTC TTCCTCGTCA CCCTTCCATT CTGGATCCAC TATGTCAGGG 300GGCATAACTG GGTTTTTGGC CATGGCATGT GTAAGCTCCT CTCAGGGTTT TATCACACAG 360GCTTGTACAG CGAGATCTTT TTCATAATCC TGCTGACAAT CGACAGGTAC CTGGCCATTG 420TCCATGCTGT GTTTGCCCTT CGAGCCCGGA CTGTCACTTT TGGTGTCATC ACCAGCATCG 480TCACCTGGGG CCTGGCAGTG CTAGCAGCTC TTCCTGAATT TATCTTCTAT GAGACTGAAG 540AGTTGTTTGA AGAGACTMTT TGCAGTGCTC TTTACCCAGA GGATACAGTA TATAGCTGGA 600GSSATTTCCA CACTCTGAGA ATGACCATCT TCTGTCTCGT TCTCCCTCTG CTCGTTATGG 660CCATCTGCTA CACAGGAATC ATCAAAACGC TGCTGAGGTG CCCCAGTAAA AAAAAGTACA 720AGGCCATCCG GCTCATTTTT GTCATCATGG CGGTGTTTTT CATTTTCTGG ACACCCTACA 780ATGTGGCTAT CCTTCTCTCT TSCYWWYMAW YCATCTTATT TGGAAATGAC TGTGAGCGGM 840MGARSMWYYK GGACCTGGTC ATGCTGGTGA CAGAGGTGAT CGCCTACTCC CACTGCTGCA 900TGAACCCGGT GATCTACGCC TTTGTTGGAG AGAGGTTCCG GAAGTACCTG CGCCACTTST 960TCCACAGGCA CTTGCTCATG CACCTGGGCA GATACATCCC ATTCCTTCCT AGTGAGAAGC1020TGGAAAGAAC CAGCTCTGTC TCTCCATCCA CAGCAGAGCC GGAACTCTCT ATTGTGTTTT1080AGGTAGATGC AGAAAATTGC CTAAAGAGGA AGGACC1116(2)關(guān)于SEQ ID NO:6(ⅰ)序列特征(A)長度355氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Met Thr Thr Ser Leu Asp Thr Val Glu Thr Phe Gly Thr Thr Ser Tyr1 5 10 15Tyr Asp Asp Val Gly Leu Leu Cys Glu Lys Ala Asp Thr Arg Ala Leu20 25 30Met Ala Gln Phe Val Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Thr Val Gly35 40 45Leu Leu Gly Asn Val Val Val Val Met Ile Leu Ile Lys Tyr Arg Arg50 55 60Leu Arg Ile Met Thr Asn Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp65 70 75 80Leu Leu Phe Leu Val Thr Leu Pro Phe Trp Ile His Tyr Val Arg Gly85 90 95His Asn Trp Val Phe Gly His Gly Met Cys Lys Leu Leu Ser Gly Phe100 105 110Tyr His Thr Gly Leu Tyr Ser Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr115 120 125Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe Ala Leu Arg Ala130 135 140Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Ile Thr Ser Ile Val Thr Trp Gly Leu145 150 155 160Ala Val Leu Ala Ala Leu Pro Glu Phe Ile Phe Tyr Glu Thr Glu Glu165 170 175Leu Phe Glu Glu Thr Xaa Cys Ser Ala Leu Tyr Pro Glu Asp Thr Val180 185 190Tyr Ser Trp Xaa Xaa Phe His Thr Leu Arg Met Thr Ile Phe Cys Leu195 200 205Val Leu Pro Leu Leu Val Met Ala Ile Cys Tyr Thr Gly Ile Ile Lys210 215 220Thr Leu Leu Arg Cys Pro Ser Lys Lys Lys Tyr Lys Ala Ile Arg Leu225 230 235 240Ile Phe Val Ile Met Ala Val Phe Phe Ile Phe Trp Thr Pro Tyr Asn245 250 255Val Ala Ile Leu Leu Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Leu Phe Gly Asn Asp260 265 270Cys Glu Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Leu Val Met Leu Val Thr Glu Val275 280 285Ile Ala Tyr Ser His Cys Cys Met Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe Val290 295 300Gly Glu Arg Phe Arg Lys Tyr Leu Arg His Xaa Phe His Arg His Leu305 310 315 320Leu Met His Leu Gly Arg Tyr Ile Pro Phe Leu Pro Ser Glu Lys Leu325 330 335Glu Arg Thr Ser Ser Val Ser Pro Ser Thr Ala Glu Pro Glu Leu Ser340 345 350Ile Val Phe355(2)關(guān)于SEQ ID NO:7(ⅰ)序列特征(A)長度25堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅸ)特征(A)名稱/KEY修飾的堿基(B)位置19(D)其它信息/修飾的堿基=i
(ⅸ)特點(A)名稱/KEY修飾的堿基(B)位置24(D)其它信息/修飾的堿基=I(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:TACCTGCTSA ACCTGGCCNT GGCNG 25(2)關(guān)于SEQ ID NO:8(ⅰ)序列特征(A)長度25堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅸ)特點(A)名稱/KEY修飾的堿基(B)位置9(D)其它信息/修飾的堿基=I(ⅸ)特點(A)名稱/KEY修飾的堿基(B)位置14(D)其它信息/修飾的堿基=I(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:ACCTGGCCNT GGCNGACCTM CTCTT 25(2)關(guān)于SEQ ID NO:9(ⅰ)序列特征(A)長度27堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅸ)特點(A)名稱/KEY修飾的堿基(B)位置18(D)其它信息/修飾的堿基=I(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:GACCGYTACC TGGCCATNGT CCAYGCC 27(2)關(guān)于SEQ ID NO:10(ⅰ)序列特征(A)長度27堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅸ)特點(A)名稱/KEY修飾的堿基(B)位置10(D)其它信息/修飾的堿基=i
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:GGCRTGGACN ATGGCCAGGT ARCGGTC 27(2)關(guān)于SEQ ID NO:11(ⅰ)序列特征(A)長度27堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅸ)特點(A)名稱/KEY修飾的堿基(B)位置1(D)其它信息/修飾的堿基=I(ⅸ)特點(A)名稱/KEY修飾的堿基(B)位置6(D)其它信息/修飾的堿基=I(ⅸ)特點(A)名稱/KEY修飾的堿基(B)位置16(D)其它信息/修飾的堿基=I(ⅸ)特點(A)名稱/KEY修飾的堿基(B)位置18(D)其它信息/修飾的堿基=i
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:NACCANRTTG TAGGGNRNCC ARMARAG 27(2)關(guān)于SEQ ID NO:12(ⅰ)序列特征(A)長度28堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅸ)特點(A)名稱/KEY修飾的堿基(B)位置8(D)其它信息/修飾的堿基=I(ⅸ)特點(A)名稱/KEY修飾的堿基(B)位置10(D)其它信息/修飾的堿基=I(ⅸ)特點(A)名稱/KEY修飾的堿基(B)位置23(D)其它信息/修飾的堿基=i(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:TGTAGGGNRN CCARMARAGR AGNARGAA 28(2)關(guān)于SEQ ID NO:13(ⅰ)序列特征(A)長度27堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅸ)特點(A)名稱/KEY修飾的堿基(B)位置12(D)其它信息/修飾的堿基=I(ⅸ)特點(A)名稱/KEY修飾的堿基(B)位置15(D)其它信息/修飾的堿基=I(ⅸ)特點(A)名稱/KEY修飾的堿基(B)位置16(D)其它信息/修飾的堿基=i(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:GAAGGCGTAG ANSANNGGGT TGASGCA 27(2)關(guān)于SEQ ID NO:14(ⅰ)序列特征(A)長度25堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅸ)特點(A)名稱/KEY修飾的堿基(B)位置4(D)其它信息/修飾的堿基=I(ⅸ)特點(A)名稱/KEY修飾的堿基(B)位置7(D)其它信息/修飾的堿基=I(ⅸ)特點(A)名稱/KEY修飾的堿基(B)位置8(D)其它信息/修飾的堿基=I(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:AGANSANNGG GTTGASGCAG CWGTG 25(2)關(guān)于SEQ ID NO:15(ⅰ)序列特征(A)長度48堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲線性(ⅸ)特點(A)名稱/KEY:CDS(B)位置16..48(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:AAGCTTCCAG CAGCC ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAA GAA TTC48Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Glu Phe360 365(2)關(guān)于SEQ ID NO:16(ⅰ)序列特征(A)長度11氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Glu Phe1 5 10(2)關(guān)于SEQ ID NO:17(ⅰ)序列特征(A)長度27堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:TTAAGAATTC ACAACCTCAC TAGATAC 27(2)關(guān)于SEQ ID NO:18(ⅰ)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:CATAGTGGAT CCAGAATG 18
權(quán)利要求
1．一種對哺乳動物趨化因子受體3蛋白質(zhì)或其部分具有特異性結(jié)合的抗體，其中所述的抗體可以與單克隆抗體7B11競爭對人趨化因子受體3蛋白質(zhì)或其部分的結(jié)合。
2．一種權(quán)利要求1所述的抗體的抗原結(jié)合片段。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述的抗體是7B11抗體。
4．一種權(quán)利要求3所述的抗體的抗原結(jié)合片段。
5．一種產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的抗體的雜交瘤。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的雜交瘤，其中所述的雜交瘤是7B11雜交瘤。
7．一種用于治療和診斷的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述的抗體或抗原結(jié)合片段具有對哺乳動物趨化因子受體3蛋白質(zhì)或其部分的特異結(jié)合性，其中所述的抗體可以與單克隆抗體7B11競爭與人趨化因子受體3蛋白質(zhì)或其部分的結(jié)合。
8．一種用于治療和診斷的抗體7B11或其抗原結(jié)合片段。
9．具有對哺乳動物趨化因子受體3蛋白質(zhì)或其部分的特異結(jié)合性的抗體或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療發(fā)炎疾病或病狀的藥物中的應(yīng)用，其中所述的抗體可以與單克隆抗體7B11競爭與人趨化因子受體3蛋白質(zhì)或其部分的結(jié)合。
10．一種抗體7B11或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療發(fā)炎疾病或病狀的藥物中的應(yīng)用。
11．一種對哺乳動物趨化因子受體3蛋白質(zhì)的至少一種功能進行抑制的方法，該方法包括將所述的蛋白質(zhì)接觸對哺乳動物趨化因子受體3蛋白質(zhì)或其部分具有特異結(jié)合性的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原結(jié)合片段可以與單克隆抗體7B11競爭與人趨化因子受體3蛋白質(zhì)或其部分的結(jié)合。
12．根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的抗體或其片段是7B11或其抗原結(jié)合片段。
13．具有對哺乳動物趨化因子受體3蛋白質(zhì)或其部分的特異結(jié)合性的抗體或其抗原結(jié)合片段在抑制哺乳動物受體的至少一種功能中的應(yīng)用，其中所述的抗體或其片段可以與單克隆抗體7B11競爭對人趨化因子受體3蛋白質(zhì)或其部分的結(jié)合。
14．根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其中所述的抗體或其片段是7B11或其抗原結(jié)合片段。
15．一種治療發(fā)炎疾病和病狀的方法，該方法包括給哺乳動物提供治療有效劑量的對哺乳動物趨化因子受體3蛋白質(zhì)或其部分具有特異結(jié)合性的抗體或其片段，其中所述的抗體或其片段可以與單克隆抗體7B11競爭同人趨化因子受體3蛋白質(zhì)或其部分的結(jié)合。
16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的抗體或其片段是7B11或其抗原結(jié)合片段。
17．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的發(fā)炎疾病或病狀是例如過敏疾病、哮喘、自體免疫疾病、移植排斥或癌癥。
18．一種對哺乳動物趨化因子受體3蛋白質(zhì)或其部分具有特異結(jié)合性的抗體或其片段在治療發(fā)炎疾病或病狀中的應(yīng)用，其中所述的抗體或其片段可以與單克隆抗體7B11競爭同人趨化因子受體3蛋白質(zhì)或其部分的結(jié)合。
19．根據(jù)權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其中所述的抗體或其片段是7B11或其抗原結(jié)合片段。
20．根據(jù)權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其中所述的發(fā)炎疾病和病狀是例如，過敏疾病、哮喘、自體免疫疾病、移植排斥或癌癥。
21．一種檢查和測量細胞表面的人趨化因子受體3蛋白質(zhì)或其部分的方法，該方法包括將所述的細胞與對哺乳動物趨化因子受體3蛋白質(zhì)或其部分具有特異結(jié)合性的抗體或其抗原結(jié)合片段相接觸，其中所述的抗體或其片段可以與單克隆抗體7B11競爭同人趨化因子受體3蛋白質(zhì)的結(jié)合。
22．根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的細胞是白細胞。
23．根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的抗體或其片段是7B11或其抗原結(jié)合片段。
24．具有對哺乳動物趨化因子受體3蛋白質(zhì)或其部分的特異結(jié)合性的抗體或其抗原結(jié)合片段在檢查和測量細胞表面的人趨化因子受體3蛋白質(zhì)或其部分中的應(yīng)用，其中所述的抗體或其片段可以與單克隆抗體7B11競爭對人趨化因子受體3蛋白質(zhì)的結(jié)合。
25．根據(jù)權(quán)利要求24所述的應(yīng)用，其中所述的細胞是白細胞。
26．根據(jù)權(quán)利要求24所述的應(yīng)用，其中所述的抗體或其片段是7B11或其抗原結(jié)合片段。
27．具有對哺乳動物趨化因子受體3蛋白質(zhì)的特異結(jié)合性的抗體或其抗原結(jié)合片段在白細胞發(fā)炎過程被改變了的疾病或病狀的診斷中測量個體白細胞的受體表達水平方面的應(yīng)用，其中所述的抗體或其片段可以與單克隆抗體7B11競爭對人趨化因子受體3蛋白質(zhì)或其部分的結(jié)合。
28．根據(jù)權(quán)利要求27所述的應(yīng)用，其中所述的抗體是7B11或其抗原結(jié)合片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及被分離的和/或重組的核酸,它們編碼哺乳動物(例如,人)的稱為C－C趨化因子受體3(CKR－3)或Eos L2的受體蛋白,以及蛋白質(zhì)和多肽,在本文中稱為被分離的、重組的哺乳動物CKR－3受體。本發(fā)明進一步涉及重組的核酸構(gòu)建物,其包括對本發(fā)明的受體蛋白或其局部編碼的核酸;還涉及含有這樣的構(gòu)建物的用于產(chǎn)生重組的CKR－3受體或多肽的宿主細胞;以及涉及對受體有反應(yīng)的抗體,它們可以用于研究和診斷方面。此外,本發(fā)明還提供了使用這些核酸、蛋白質(zhì)、宿主細胞來鑒定受體功能的配體、抑制劑(如拮抗劑)、促進劑(激動劑)的方法。給需要治療的個體提供以抑制或促進受體功能的化合物,就提供了選擇性調(diào)節(jié)白細胞功能的方法,其可以用于各種炎癥疾病和字體免疫疾病中,或用于對感染的治療中。作為存在于白細胞如嗜伊紅粒細胞和淋巴細胞中的主要白細胞趨化因子受體,這些受體提供了藥物篩選和涉及的關(guān)鍵靶標。
文檔編號G01N33/566GK1234806SQ97198390
公開日1999年11月10日 申請日期1997年9月24日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月30日
發(fā)明者查爾斯·R·麥奇, 保羅·D·波納斯 申請人:羅克塞特有限公司