本發(fā)明涉及CXCR2拮抗劑用于預(yù)防和/或治療化療誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變(CIPN)的用途。
背景技術(shù)：
：CIPN被定義為接受化療治療方案的患者所經(jīng)歷的周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷。CIPN是許多化療劑普遍主要的劑量限制性副作用，所述化療劑包括鉑化合物類(例如，奧沙利鉑)、紫杉烷類、長(zhǎng)春花生物堿類、沙利度胺和更新的藥物，例如硼替佐米[Balayssac，ExpertOpin.DrugSaf.，10，407-417，2011)]。這代表了在許多不同的癌癥中顯著的治療局限性，因?yàn)榻K末器官神經(jīng)毒性和神經(jīng)病可能對(duì)患者的生活質(zhì)量具有極大影響且需要停止有效治療。奧沙利鉑已知能引起嚴(yán)重的急性和慢性周圍神經(jīng)病變[CassidyandMisset，Semin.Oncol.，29，11-20(2002)；Extra，Semin.Oncol.，25，13-22(1998)；Pasetto，Crit.Rev.Oncol.Hematol.，59，159-168(2006)；和QuasthoffandHartung，J.Neurol.，249，9-17(2002)]。奧沙利鉑在重復(fù)治療后在晚期引起大鼠坐骨神經(jīng)中有髓纖維的退化[Kawashiri，Eur.J.Pain，15，344(2011)]，且在小鼠模型中用奧沙利鉑慢性治療誘導(dǎo)背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元收縮和有髓纖維的軸突損傷[Renn，Mol.Pain，7，29(2011)；Cavaletti，Eur.J.Cancer，37，2457(2001)]。嚙齒類中感覺終點(diǎn)的早期改變已在奧沙利鉑模型中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致對(duì)熱(Neuropharmacology，79(2014)432-443；Pain，101(2003)65–77)和機(jī)械刺激(Neuropharmacology，79(2014)432-443；BrainResearch，784(1998)154–162)的敏感性增加，其分別使用冷的丙酮刺激和vonFrey細(xì)絲。例如，包含奧沙利鉑的治療方案(例如每2周85mg/m2)在95％的患者中產(chǎn)生即時(shí)性‘冷’敏感的暫時(shí)性感覺異常和肢體肌肉痙攣，其發(fā)展成無(wú)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元參與的對(duì)稱性軸突感覺遠(yuǎn)端原發(fā)性神經(jīng)病[Argyriou，CancerTreatmentReviews，43，368-377(2008)]。在背根神經(jīng)節(jié)(DRG)及其感覺神經(jīng)元中的奧沙利鉑攝取和鉑積累是奧沙利鉑神經(jīng)毒性的主要決定因素(Jong，J.Pharmacol.Exp.Ther.，338(2):537-47(2011)。此外，炎性級(jí)聯(lián)激活在CIPN的引發(fā)和進(jìn)展中起作用，其中免疫細(xì)胞滲入受損的神經(jīng)元環(huán)境中[Wang，Cytokine，59，3-9(2012)]。促炎性趨化因子受體CXCR2表達(dá)于感覺神經(jīng)元且其配體已參與調(diào)節(jié)鈉和鉀電流的增加，其控制神經(jīng)元興奮性[Wang，Mol.Pain，24，38(2008)；Yang，Mol.Pain，5，26(2009)]。在外周神經(jīng)元損傷中，嚙齒類中CXCR2+促炎性分泌型免疫細(xì)胞的聚集也已知涉及一些急性和持續(xù)性疼痛狀態(tài)，其被CXCR2拮抗作用阻斷[Manjavachi，Eur.J.Pain，14，23-31(2010)；Kiguchi，J.Pharmacol.Exp.Ther.，340，577-587(2012)；Stadtmann&Zarbock，F(xiàn)ront.Immunol.，3，263(2012)]。CXCR2配體已經(jīng)顯示出調(diào)節(jié)參與傷害感受過(guò)程的TRPv1通道的功能[Dong，Neurosci.Bull.，28，155-164(2012)]并刺激鈣內(nèi)流和感覺神經(jīng)元中疼痛介導(dǎo)肽降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的釋放(Qin，J.Neurosci.Res.，82，51-62(2005))。人外周神經(jīng)外植體和施萬(wàn)細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)[Ozaki，NeuroReport，19，31-35(2008)]并分泌CXCR2促炎性細(xì)胞因子，例如IL-8[Rutkowski，J.Neuroimmunol.，101，47-60(1999)]，其在糖尿病和酒精性神經(jīng)病以及在長(zhǎng)度依賴性小纖維神經(jīng)病中顯著升高[AboElAsar，Cytokine，59，86-93(2012)]；(Michalowska-Wender，F(xiàn)oliaNeuropathol.，45，78-81(2007)；Neurology，74，1806(2010)]。所述神經(jīng)元CXCR2受體系統(tǒng)也已顯示調(diào)節(jié)髓鞘再生(re-myelination)[Veenstra&Ransohoff，J.Neuroimmunol.，246，1-9(2012)]和突觸可塑性(Xiong，J.Neurosci.Res.，71，600-607(2003)過(guò)程，其控制神經(jīng)元的通信。所述CXCR2受體及其配體在結(jié)腸直腸癌中也被上調(diào)并已參與藥物抗性[Acharyya，Cell，150，165-178(2012)]、腫瘤生長(zhǎng)、血管形成、癌細(xì)胞增殖和嗜中性粒細(xì)胞聚集到腫瘤微環(huán)境[Verbeke，Cytokine&GrowthFactorReview，22，345-358(2012)]。目前尚無(wú)用于預(yù)防和/或治療CIPN的獲批治療選擇。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)防和/或治療CIPN的CXCR2拮抗劑。根據(jù)第二方面，本發(fā)明提供了在需要的人中預(yù)防和/或治療CIPN的方法，其包括給藥CXCR2拮抗劑。根據(jù)第三方面，本發(fā)明提供了CXCR2拮抗劑在制備用于預(yù)防和/或治療CIPN的藥物中的用途。附圖簡(jiǎn)述圖1是顯示在大鼠中慢性壓迫性損傷(chronicconstrictioninjury,CCI)后對(duì)縮足閾值(PWT)的影響的圖。圖2是顯示小鼠中慢性壓迫性損傷后對(duì)PWT的影響的圖。圖3是顯示在大鼠中慢性壓迫性損傷后坐骨神經(jīng)中對(duì)mRNA水平的影響的一系列圖。圖4是顯示在小鼠中慢性壓迫性損傷后坐骨神經(jīng)中對(duì)mRNA水平的影響的一系列圖。圖5是顯示在大鼠中單次注射奧沙利鉑后對(duì)PWT的影響的圖。圖6是顯示在小鼠中單次注射奧沙利鉑后對(duì)PWT的影響的圖。圖7是顯示在大鼠中單次注射奧沙利鉑后左側(cè)坐骨神經(jīng)中對(duì)mRNA水平的影響的一系列圖。圖8是顯示在小鼠中單次注射奧沙利鉑后左側(cè)坐骨神經(jīng)中對(duì)mRNA水平的影響的一系列圖。圖9是顯示化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病變的大鼠模型中式(A)化合物的預(yù)防性治療后對(duì)PWT的影響的圖。圖10是顯示用式(A)化合物或其載體治療后大鼠坐骨神經(jīng)中對(duì)奧沙利鉑減少的神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響的圖。圖11是顯示用式(A)化合物或其載體治療后對(duì)大鼠體重的影響的圖。圖12是一組三個(gè)顯微照片，顯示在奧沙利鉑治療的大鼠中用式(A)化合物治療后對(duì)坐骨神經(jīng)的髓鞘的厚度的影響。圖13是顯示在奧沙利鉑治療的大鼠中用式(A)化合物治療后對(duì)坐骨神經(jīng)的髓鞘的厚度的影響的柱狀圖。發(fā)明詳述迄今為止還沒有公開CXCR2調(diào)節(jié)能對(duì)周圍神經(jīng)病變(特別是CIPN)提供有效的預(yù)防和/或治療方案。本文所述的機(jī)理臨床研究方案的證明，預(yù)期能提供有關(guān)人的證據(jù)，即CXCR2的有效和選擇性的拮抗劑可為CIPN的有效治療方案。該機(jī)理臨床研究的證明是在患有結(jié)腸直腸癌的患者中進(jìn)行，該患者即將經(jīng)歷包含奧沙利鉑的化療治療方案的周期。這種使用CXCR2拮抗劑的治療將在化療周期中和化療周期前后間歇地給予。該方案保證最高的CXCR2抑制同時(shí)具有最高的全身奧沙利鉑暴露量。該研究將在每個(gè)化療周期之前、之中和之后測(cè)量多種相關(guān)的終點(diǎn)。主要終點(diǎn)是使用神經(jīng)生理學(xué)跟蹤技術(shù)測(cè)量周圍神經(jīng)興奮性。由含有奧沙利鉑的治療方案引起的感覺神經(jīng)興奮性(SE)的急性增加可比建立的神經(jīng)生理學(xué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度標(biāo)記物更早地檢測(cè)到，所述治療方案被認(rèn)為是由節(jié)點(diǎn)軸索電壓門控鈉通道(nodalaxonalvoltage-gatedsodiumchannel)的功能障礙引起的[Krishnan，MuscleNerve，32,51-60(2005)]，并且該急性增加已經(jīng)被建議用來(lái)預(yù)測(cè)奧沙利鉑誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變的發(fā)生和嚴(yán)重性[Park，Brain，132,10,2712-23(2009)]。在奧沙利鉑的第5個(gè)周期之前SE從基線增加15％，使得在奧沙利鉑治療的第12個(gè)周期結(jié)束時(shí)檢測(cè)到80％的病例具有中度至重度神經(jīng)毒性。而且，機(jī)理臨床研究方案的證明已被設(shè)計(jì)以提供以下證據(jù)，即有效且選擇性的CXCR2拮抗劑能有效預(yù)防和/或治療CIPN，其通過(guò)捕獲在奧沙利鉑周期過(guò)程中與感覺神經(jīng)興奮性的變化相關(guān)的患者結(jié)果信息。此外，CXCR2拮抗劑的臨床前研究已證明，抑制CXCR2對(duì)奧沙利鉑的抗增殖作用沒有不利影響[Ning，Mol.CancerTher.，11，1353-1364(2012)]。機(jī)理研究的證明也將監(jiān)測(cè)包含奧沙利鉑的治療方案對(duì)癌癥相關(guān)的終點(diǎn)的有效性。因此根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)防和/或治療CIPN的CXCR2拮抗劑。如本文所述，術(shù)語(yǔ)CXCR2拮抗劑是指抑制CXCR2受體的激動(dòng)劑-介導(dǎo)的響應(yīng)的化合物。本文使用的術(shù)語(yǔ)預(yù)防是指完全阻止神經(jīng)損傷和/或相應(yīng)的神經(jīng)功能障礙(通過(guò)神經(jīng)生理跟蹤技術(shù)測(cè)量)或減緩神經(jīng)損傷和/或神經(jīng)功能變化的進(jìn)展。應(yīng)理解預(yù)防包括a)化療劑對(duì)健康神經(jīng)沒有造成損傷或基本上沒有損傷的情況；b)受損的神經(jīng)(例如由早期化療周期引起)不被化療劑進(jìn)一步損傷或基本上不被損傷的情況；和c)與任何先前的化療周期相比，對(duì)神經(jīng)的損傷(由早期化療循環(huán)的累積效應(yīng)引起)減少的情況。本文使用的術(shù)語(yǔ)治療是指逆轉(zhuǎn)或部分逆轉(zhuǎn)CIPN，其中神經(jīng)損傷和/或相應(yīng)的神經(jīng)功能障礙(通過(guò)神經(jīng)生理跟蹤技術(shù)測(cè)量)被修復(fù)或逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致神經(jīng)功能的改善，從而減少神經(jīng)病的癥狀。CIPN是獨(dú)特的神經(jīng)病。在大多數(shù)其它神經(jīng)病(如糖尿病性神經(jīng)病和酒精性神經(jīng)病)中，在損害/神經(jīng)損傷已發(fā)生一段時(shí)間后出現(xiàn)神經(jīng)性癥狀。經(jīng)歷化療的患者中神經(jīng)病發(fā)生的可能性，特別是經(jīng)歷奧沙利鉑化療的神經(jīng)病的高發(fā)生率[DecisionResorcesLLC，KantarHealth，OncologyAnalyser，IntrinsiqDatabase；DeGramont，J.Clin.Oncol.，18，2938-2947(2000)]，意味著在給予化療劑之前或同時(shí)給予CXCR2拮抗劑具有防止神經(jīng)病急性發(fā)生和防止慢性持久的神經(jīng)性癥狀的建立的潛能。機(jī)理臨床研究的證明將通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)興奮性措施及其建議的患者結(jié)果的預(yù)測(cè)性翻譯的證據(jù)而測(cè)量該預(yù)防性方面。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于預(yù)防CIPN的CXCR2拮抗劑。如上所述，已知許多化療劑引起CIPN，例如鉑化合物(例如，奧沙利鉑)、紫杉烷、長(zhǎng)春花生物堿、沙利度胺和硼替佐米。在一個(gè)實(shí)施方案中，該CIPN由包括含鉑的化療劑的化療引起。在一個(gè)實(shí)施方案中，該CIPN由包括奧沙利鉑的化療引起。在一個(gè)實(shí)施方案中，該CIPN由含鉑的化療劑引起。在另一實(shí)施方案中，該CIPN由奧沙利鉑引起。CXCR2拮抗劑用于本發(fā)明的適合性可通過(guò)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)藥物實(shí)踐評(píng)價(jià)其功效、選擇性、吸收、代謝、藥代動(dòng)力學(xué)、毒性等而測(cè)定。CXCR2拮抗劑的功效可使用容易獲得的測(cè)試方法測(cè)定，如以下實(shí)驗(yàn)部分描述的測(cè)試a)、b)、c)和d)。測(cè)試a)測(cè)量人內(nèi)源性激動(dòng)劑IL-8與重組表達(dá)的人CXCR2受體的放射性標(biāo)記的結(jié)合。測(cè)試b)測(cè)量重組表達(dá)的人CXCR2受體的功能活性，其通過(guò)報(bào)告基因構(gòu)建體在受體自身下游測(cè)量。測(cè)試c)測(cè)量重組表達(dá)的人CXCR2受體的功能活性，其通過(guò)報(bào)告基因構(gòu)建體在受體自身下游測(cè)量。測(cè)試d)測(cè)量全血中天然表達(dá)的人CXCR2的細(xì)胞功能活性，其通過(guò)流式細(xì)胞儀細(xì)胞分選方案在受體自身下游測(cè)量。在每個(gè)測(cè)試中，對(duì)激動(dòng)劑介導(dǎo)的終點(diǎn)的抑制決定拮抗劑的效力。對(duì)于給定的拮抗劑，效力可以根據(jù)所使用的測(cè)定法而不同。然而，本領(lǐng)域藥理學(xué)人員能夠容易地比較不同測(cè)試的結(jié)果來(lái)確定效力。在一個(gè)實(shí)施方案中，該CXCR2拮抗劑對(duì)抗CXCR2受體的pIC50值大于或等于7.0，其在CXCR2受體結(jié)合測(cè)試中測(cè)量。在另一實(shí)施方案中，該CXCR2拮抗劑對(duì)抗CXCR2受體的pIC50值大于或等于7.8，其在受體結(jié)合測(cè)試中測(cè)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，該CXCR2拮抗劑對(duì)抗CXCR2受體的pIC50值大于或等于7.0，其在測(cè)試a)中測(cè)量。在另一實(shí)施方案中，該CXCR2拮抗劑對(duì)抗CXCR2受體的pIC50值大于或等于7.8，其在測(cè)試a)中測(cè)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，該CXCR2拮抗劑對(duì)抗CXCR2受體的pA2值大于或等于8.0，其在測(cè)試b)中測(cè)量。在另一實(shí)施方案中，該CXCR2拮抗劑對(duì)抗CXCR2受體的pA2值大于或等于8.2，其在測(cè)試b)中測(cè)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，該CXCR2拮抗劑對(duì)抗CXCR2受體的pIC50值大于或等于8.0，其在測(cè)試c)中測(cè)量。在另一實(shí)施方案中，該CXCR2拮抗劑對(duì)抗CXCR2受體的pIC50值大于或等于8.8，其在測(cè)試c)中測(cè)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，該CXCR2拮抗劑對(duì)抗CXCR2受體的pIC50值大于或等于5.0，其在測(cè)試d)中測(cè)量。在另一實(shí)施方案中，該CXCR2拮抗劑對(duì)抗CXCR2受體的pIC50值大于或等于5.4，其在測(cè)試d)中測(cè)量。CXCR2拮抗劑對(duì)CXCR2受體相對(duì)于CXCR1受體的選擇性可使用測(cè)試a)和e)測(cè)定。選擇性比例可容易通過(guò)對(duì)具體涉及的受體的相應(yīng)IC50值的比例由本領(lǐng)域技術(shù)人員測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，該CXCR2拮抗劑對(duì)CXCR2的選擇性是CXCR1的大于或等于29倍。在另一實(shí)施方案中，該CXCR2拮抗劑對(duì)CXCR2的選擇性是CXCR1的大于或等于50倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，該CXCR2拮抗劑對(duì)CXCR2的選擇性是CXCR1的大于或等于100倍?？诜锢枚仁侵缚诜o藥的藥物達(dá)到體循環(huán)的比例。確定藥物口服生物利用度的因素為溶解度、膜滲透性、代謝穩(wěn)定性和主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)體的可能參與。通常，篩選級(jí)聯(lián)法首先使用體外研究鑒定可能的傾向，然后推進(jìn)至體內(nèi)評(píng)估以確定口服生物利用度。溶出度，即胃-腸道(GIT)中的水性內(nèi)含物對(duì)藥物的溶解作用，可從體外溶解度實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)，其在合適的pH進(jìn)行以模擬GIT。在一個(gè)實(shí)施方案中，該CXCR2拮抗劑的最小溶解度為10μg/ml。溶解度可通過(guò)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)步驟測(cè)定，如Adv.DrugDeliv.Rev.，23，3-25(1997)中所述。膜滲透性是指化合物穿過(guò)生物膜的比率。親脂性是預(yù)測(cè)的關(guān)鍵性質(zhì)且通過(guò)使用有機(jī)溶劑和緩沖液的體外LogD7.4測(cè)量值定義。在一個(gè)實(shí)施方案中，CXCR2拮抗劑的LogD7.4為-2至+4，更優(yōu)選-1至+3。LogD7.4可通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)步驟測(cè)定，如J.Pharm.Pharmacol.，42:144(1990)中所述。代謝穩(wěn)定性涉及在吸收和消除過(guò)程中GIT或肝代謝化合物的能力。測(cè)試系統(tǒng)如微粒體、肝細(xì)胞等可預(yù)測(cè)代謝傾向性。在一個(gè)實(shí)施方案中，該CXCR2拮抗劑在測(cè)試系統(tǒng)中顯示代謝穩(wěn)定性，其與低至中度的肝萃取相稱。測(cè)試系統(tǒng)和數(shù)據(jù)操作的實(shí)例描述于Curr.Opin.DrugDisc.Devel.，4，36-44(2001)；DrugMet.Disp.，28,1518-1523(2000)。由于上述過(guò)程的相互作用，可通過(guò)在臨床前物種中的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估藥物是否潛在可被人口服生物利用。在這些研究中通過(guò)口服和靜脈內(nèi)途徑給予化合物確定絕對(duì)生物利用度。在動(dòng)物中評(píng)估口服生物利用度的實(shí)例可參見DrugMet.Disp.，29，82-87(2001)；J.MedChem.，40，827-829(1997)；DrugMet.Disp.，27，221-226(1999)。合適用于本發(fā)明的CXCR2拮抗劑公開于歐洲專利公開EP1558259B1和EP2009992B1。這些公開的內(nèi)容，特別是其中的權(quán)利要求的治療活性化合物的通式和實(shí)施例化合物，以其整體在此引入作為參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的CXCR2拮抗劑選自：式(A)的1-(4-氯-2-羥基-3-(哌嗪-1-基磺酰基)苯基)-3-(2-氯-3-氟苯基)脲式(B)的1-(4-氯-2-羥基-3-(哌啶-3-基磺?；?苯基)-3-(3-氟-2-甲基苯基)脲式(C)的1-(4-氯-2-羥基-3-(((R)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺?；?苯基)-3-((R)-2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲式(D)的1-(4-氯-3-((1,4-二甲基哌啶-4-基)磺?；?-2-羥基苯基)-3-(2-氯-3-氟苯基)脲式(E)的(R)-1-(4-氯-2-羥基-3-((4-甲基四氫-2H-吡喃-4-基)磺?；?苯基)-3-(2-氯環(huán)戊-2-烯-1-基)脲式(F)的(R)-1-(3-(叔丁基磺?；?-4-氰基-2-羥基苯基)-3-(2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲式(G)的1-(4-氯-2-羥基-3-((反-3-(吡咯烷-1-基)環(huán)丁基)磺?；?苯基)-3-((R)-2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲式(H)的1-(4-氯-3-((反-3-(二甲基氨基)環(huán)丁基)磺酰基)-2-羥基苯基)-3-((R)-2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲式(I)的(R)-1-(4-氯-3-((1,1-二氟乙基)磺?；?-2-羥基苯基)-3-(2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲式(J)的1-(4-氯-2-羥基-3-(((S)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲式(K)的1-(4-氯-2-羥基-3-(((S)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺?；?苯基)-3-((R)-2-氯環(huán)戊-2-烯-1-基)脲和式(L)的1-(4-氯-2-羥基-3-(((R)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺?；?苯基)-3-((R)-2-氯環(huán)戊-2-烯-1-基)脲或其藥學(xué)上可接受的鹽。式(A)的化合物可根據(jù)歐洲專利EP1558259B1實(shí)施例1所述的方法制備。式(B)的化合物可根據(jù)歐洲專利EP2009992B1實(shí)施例1所述的方法制備。式(C)、(D)、(E)、(F)、(G)、(H)、(I)、(J)、(K)和(L)的化合物可根據(jù)以下所述的方法制備。還可參見國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/EP2015/061618的制備。在另一實(shí)施方案中，所述CXCR2拮抗劑為式(A)的1-(4-氯-2-羥基-3-(哌嗪-1-基磺?；?苯基)-3-(2-氯-3-氟苯基)脲或其藥學(xué)上可接受的鹽在另一實(shí)施方案中，所述CXCR2拮抗劑為式(B)的1-(4-氯-2-羥基-3-(哌啶-3-基磺?；?苯基)-3-(3-氟-2-甲基苯基)脲或其藥學(xué)上可接受的鹽在另一實(shí)施方案中，所述CXCR2拮抗劑為式(C)的1-(4-氯-2-羥基-3-(((R)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲或其藥學(xué)上可接受的鹽在另一實(shí)施方案中，所述CXCR2拮抗劑為式(J)的1-(4-氯-2-羥基-3-(((S)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲或其藥學(xué)上可接受的鹽該CXCR2拮抗劑可單獨(dú)給藥，但通常以與合適的藥物賦形劑、稀釋劑或載體的混合物給藥，該藥物賦形劑、稀釋劑或載體根據(jù)預(yù)期給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥物實(shí)踐而選擇。在通過(guò)合適的途徑給藥于患者前，該CXCR2拮抗劑通常，但不必須，配制為藥物組合物。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含a)CXCR2拮抗劑，和b)用于預(yù)防和/或治療CIPN的一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物可以以散裝形式進(jìn)行制備和包裝，其中將本發(fā)明化合物分配然后給藥至所述患者(例如粉末或糖漿)?；蛘?，可將本發(fā)明藥物組合物制備和包裝成藥物劑型，其中每種物理上分散的藥物劑型含有本發(fā)明化合物。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明藥物組合物的藥物劑型。對(duì)于平均體重范圍為約65至80kg的人受試者，每個(gè)分散的藥物劑型通常含有5mg至100mg的本發(fā)明化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易確定體重在該范圍之外的受試者所需的劑量水平，如兒童和老年人。本發(fā)明組合物將通常被配制成適于通過(guò)所需給藥途徑給藥至患者的藥物劑型。例如，藥物劑型包括適于以下的那些：(1)口服給藥，例如片劑、膠囊、小膠囊、丸劑、錠劑、粉末、糖漿、酏劑、混懸液、溶液、乳液、囊劑和扁囊劑；(2)胃腸外給藥，例如無(wú)菌溶液、混懸液、植入物和用于重構(gòu)的粉末；(3)透皮給藥，例如透皮貼劑；(4)直腸和陰道給藥，例如栓劑、陰道栓劑和泡沫；(5)吸入和鼻內(nèi)給藥，例如干粉、氣霧劑、混懸液和溶液(噴霧和滴劑)；(6)局部給藥，例如乳膏劑、軟膏劑、洗劑、溶液、糊劑、滴劑、噴霧劑、泡沫和凝膠；(7)眼部給藥，例如滴劑、軟膏劑、噴霧劑、混懸液和嵌入物；(8)口腔和舌下給藥，例如錠劑、貼劑、噴霧劑、滴劑、咀嚼片和片劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該劑型適用于口服給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物適用于口服給藥。如本文所述，術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的賦形劑"是指不與CXCR2拮抗劑明顯反應(yīng)，且不導(dǎo)致對(duì)CXCR2拮抗劑的治療活性具有不希望的作用的物質(zhì)。藥學(xué)上可接受的賦形劑將根據(jù)所選具體藥物劑型而變化。此外，可根據(jù)具體功能選擇合適的藥學(xué)上可接受的賦形劑，使它們適用于該組合物。例如，可根據(jù)其促進(jìn)均一藥物劑型的產(chǎn)生的能力選擇一些藥學(xué)上可接受的賦形劑?？筛鶕?jù)其促進(jìn)穩(wěn)定的藥物劑型的產(chǎn)生的能力選擇一些藥學(xué)上可接受的賦形劑?？筛鶕?jù)一旦將化合物或本發(fā)明化合物給藥至患者便促進(jìn)從一個(gè)器官或機(jī)體部分?jǐn)y帶或運(yùn)輸所述化合物或本發(fā)明化合物至另一器官或機(jī)體的另一部分的能力選擇一些藥學(xué)上可接受的賦形劑?？筛鶕?jù)其提高患者順應(yīng)性的能力來(lái)選擇一些藥學(xué)上可接受的賦形劑?？筛鶕?jù)其促進(jìn)CXCR2拮抗劑以適當(dāng)?shù)乃俾梳尫乓灾委熢摬“Y的能力來(lái)選擇一些藥學(xué)上可接受的賦形劑。用于適合口服給藥的組合物的藥學(xué)上可接受的賦形劑包括：稀釋劑和填料(如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、預(yù)膠化淀粉、纖維素、微晶纖維素、硫酸鈣、和磷酸氫鈣)；粘合劑(如淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、預(yù)膠化淀粉、明膠、阿拉伯膠、藻酸鈉、海藻酸、黃蓍膠、瓜爾膠、聚乙烯吡咯酮、纖維素和羥丙基甲基纖維素)；崩解劑(如淀粉、聚乙烯聚吡咯烷酮、羥乙酸淀粉鈉、交聯(lián)羧甲醚纖維素、海藻酸和羧甲基纖維素鈉)；潤(rùn)滑劑(如硬脂酸、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、和十二烷基硫酸鈉)；助流劑(如滑石和膠體二氧化硅)；成粒劑；包衣劑；濕潤(rùn)劑；溶劑；共溶劑；懸浮劑；乳化劑；增甜劑；調(diào)味劑；掩味劑；著色劑；抗結(jié)劑；潤(rùn)濕劑；螯合劑；增塑劑；增粘劑；速率調(diào)節(jié)劑；抗氧化劑；防腐劑；穩(wěn)定劑；表面活性劑；和緩沖劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，一些藥學(xué)上可接受的賦形劑可起到一種以上的功能，并且根據(jù)該賦形劑在所述制劑中存在多少以及該制劑中存在什么其他成分可起到替代的功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，適合口服給藥的劑型如片劑、膠囊、囊片和丸劑，可配制以用于立即、延遲、修飾、持續(xù)、脈沖或控制釋放本發(fā)明的化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員具有本領(lǐng)域的知識(shí)和技能，使它們能夠確定合適的藥學(xué)上可接受的賦形劑以適當(dāng)?shù)牧坑糜贑XCR2拮抗劑中。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得許多資源，其描述了藥學(xué)上可接受的賦形劑并可用于選擇合適的藥學(xué)上可接受的賦形劑。實(shí)例包括Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPublishingCompany)、TheHandbookofPharmaceuticalAdditives(GowerPublishingLimited)和TheHandbookofPharmaceuticalExcipients(theAmericanPharmaceuticalAssociationandthePharmaceuticalPress)。本發(fā)明藥物組合物可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)和方法進(jìn)行制備。本領(lǐng)域常用的一些方法描述于Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPublishingCompany)。以下配制例僅為示例性的且不意欲限制本發(fā)明的范圍。根據(jù)本發(fā)明，該CXCR2拮抗劑預(yù)防和/或治療通過(guò)給藥化療劑引起的CIPN。因此，該CXCR2拮抗劑可與化療劑組合給藥。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，該用于預(yù)防和/或治療CIPN的CXCR2拮抗劑與一種或多種主要化療劑組合，該活性劑選自以下列表：鉑化合物(例如，奧沙利鉑)、紫杉烷、長(zhǎng)春花生物堿、沙利度胺和硼替佐米。在另一實(shí)施方案中，該主要化療劑為奧沙利鉑。通常，化療劑與額外的藥劑(例如，其他化療劑、血管生成抑制劑，止吐劑)組合給藥，其為實(shí)現(xiàn)患者順應(yīng)性抗癌治療提供了增加的治療選擇，包括治療難治性群體。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，該CXCR2拮抗劑與以下一起給藥：a)主要化療劑和b)選自以下的額外的藥劑：貝伐單抗、伊立替康、卡培他濱、西妥昔單抗、帕尼單抗、瑞戈非尼和Ziv-阿柏西普。如果給予活性劑的組合，則它們可同時(shí)、分開或相繼給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，該CXCR2拮抗劑在給藥化療劑之前或同時(shí)給藥。應(yīng)理解，本發(fā)明提供了以下其它方面的基礎(chǔ)。上述第一方面中的具體實(shí)施方案延伸至這些方面:在需要的人中預(yù)防和/或治療CIPN的方法，包括給藥CXCR2拮抗劑；CXCR2拮抗劑在制備用于預(yù)防和/或治療CIPN的藥物中的用途；用于預(yù)防和/或治療CIPN的藥物組合，其包含CXCR2拮抗劑和另一種上文定義的活性劑；在需要的人中預(yù)防和/或治療CIPN的方法，包括給藥包含CXCR2拮抗劑和另一種上文定義的活性劑的藥物組合；藥物組合在制備用于預(yù)防和/或治療患者CIPN的藥物中的用途，該藥物組合包含CXCR2拮抗劑和另一種上文定義的活性劑；用于預(yù)防和/或治療CIPN的試劑盒，該試劑盒包含：a)包含CXCR2拮抗劑的第一藥物組合物；b)包含另一種上文定義的活性劑的第二組合物；和c)用于該第一和第二組合物的容器；和試劑盒在制備用于預(yù)防和/或治療CIPN的藥物中的用途，該試劑盒包含：a)包含CXCR2拮抗劑的第一藥物組合物；b)包含另一種上文定義的活性劑的第二組合物；和c)用于該第一和第二組合物的容器。實(shí)驗(yàn)部分a)CXCR2和CXCR1的受體結(jié)合測(cè)試[125I]IL-8(人重組體，IM249)獲自AmershamCorp.，ArlingtonHeights，IL，比活性為2000Ci/mmol。所有其它化學(xué)品為分析級(jí)。高水平的重組人CXCR1和CXCR2受體分別在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)，如Holmes，等人，Science，1991，253，1278所述，將其在此引入以進(jìn)行本測(cè)試。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢膜根據(jù)Haour，等人，J.Biol.Chem.，249pp2195-2205(1974)制備，將其在此引入以進(jìn)行本測(cè)試，除了將均化緩沖液改變?yōu)榘?mMMgS04、0.5mMEDTA(乙二胺四乙酸)、1mMPMSF(α-甲苯-磺酰氟)、2.5mg/L亮抑酶肽和0.1mg/ml抑肽酶的40mMTris-HCLpH7.5。膜蛋白質(zhì)濃度使用Bio-Rad試劑使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)而測(cè)定。所有結(jié)合測(cè)試使用閃爍親近測(cè)定法(SPA測(cè)試)進(jìn)行，其使用小麥胚芽凝集素珠在96-孔微孔板(optiplate96，Packard)格式中。該CHO-CXCR2和CHO-CXCR1膜在結(jié)合緩沖液中用珠子預(yù)培養(yǎng)；20mMBisTris丙烷，pH8，其包含25mMNaCl、1mMMgSO4、0.1mMEDTA，在測(cè)試前在4℃保持30分鐘。化合物以終濃度的20倍在100％DMSO中稀釋(最終1nM至1000nM和5％DMSO)。該測(cè)在包含結(jié)合緩沖液、用小麥胚芽凝集素珠預(yù)處理的膜、多種濃度的化合物、5％DMSO、0.04％CHAP、0.0025％BSA和0.225nM[125I]IL-8的0.1ml反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行。該96-孔板在振動(dòng)平臺(tái)上培養(yǎng)1小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)將板以2000RPM旋轉(zhuǎn)5分鐘，且在TopCount計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。認(rèn)為顯示pIC50值>5的化合物在測(cè)試中具有活性。式(A)的化合物對(duì)CXCR2受體的pIC50值為7.8且對(duì)CXCR1受體的pIC50值為5.5。如該測(cè)試所測(cè)量，因此式(A)的化合物對(duì)CXCR2的選擇性是CXCR1的188倍。式(B)的化合物對(duì)CXCR2受體的pIC50值為7.9且對(duì)CXCR1受體的pIC50值為6.0。如該測(cè)試所測(cè)量，因此式(B)的化合物對(duì)CXCR2的選擇性是CXCR1的78倍。b)鈣動(dòng)員測(cè)試穩(wěn)定表達(dá)CXCR2和Gα16的CHO-K1細(xì)胞在DMEM/F12(HAM's)1:1，w/10％FCS(熱滅活)，w/2mML-谷氨酰胺，w/0.4mg/mlG418中生長(zhǎng)至80％融合，同時(shí)在5％CO2培養(yǎng)箱中維持在37℃。在進(jìn)行測(cè)定之前24小時(shí)，收獲細(xì)胞并在96孔、黑色壁、透明底板(PackardView)中鋪板(每孔40,000個(gè)細(xì)胞)，并返回到CO2培養(yǎng)箱中。在測(cè)定當(dāng)天，將化合物在100％DMSO中連續(xù)稀釋至所需測(cè)試濃度的300倍。從細(xì)胞中吸出生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并用100μL負(fù)載培養(yǎng)基(具有Earl's鹽w/L谷氨酰胺，0.1％BSA(來(lái)自SeriologicalsCorp.的BovunlinarCohenFractionV)的EMEM，4uMFluo-4-乙酰氧基甲基酯熒光指示劑染料(Fluo-4AM，來(lái)自MolecularProbes)和2.5mM丙磺舒)在37℃在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)。抽吸負(fù)載培養(yǎng)基并用100μL具有Earl's鹽w/L-谷氨酰胺、0.1％明膠和2.5mM丙磺舒的EMEM更換，并且再培養(yǎng)10分鐘。將300x的在DMSO中的連續(xù)稀釋的化合物(3μL)轉(zhuǎn)移到含有297微升KRH(120mMNaCl，4.6mMKCl，1.03mMKH2PO4，25mMNaHCO3，1.0mMCaCl2，1.1mMMgCl2，11mM葡萄糖，20mMHEPES(pH7.4))w/2.5mM丙磺舒和0.1％明膠的96孔板(現(xiàn)在化合物為3x濃度)。從細(xì)胞中吸出培養(yǎng)基，并用KRHw/2.5mM丙磺舒、w/0.1％明膠洗滌細(xì)胞3次。將具有0.1％明膠的KRH(100μL)w/2.5mM丙磺舒加入孔中，然后將50μL在KRHw/2.5mM丙磺舒和0.1％明膠中的3x化合物加入孔中并在37℃在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10分鐘。將板置于FLIPR(FluorometricImagingPlateReader，MolecularDevices，SunnyvaleCalif)上用于如前所述的分析[SarauetaI.，Mol.Pharmacol.，Sep.，56(3)，657-63(1999)]。針對(duì)化合物的各濃度測(cè)定由1.0nMIL-8(CXCR2的EC80濃度)誘導(dǎo)的最大人IL-8誘導(dǎo)的Ca2+遷移的百分比，并且IC50計(jì)算為抑制由1.0nMIL-8誘導(dǎo)的最大響應(yīng)的50％的測(cè)試化合物的濃度。如該測(cè)試所測(cè)量，式(A)的化合物對(duì)CXCR2受體的pA2值為8.4。如該測(cè)試所測(cè)量，式(B)的化合物對(duì)CXCR2的pA2值為8.2。c)CXCR2Tango測(cè)試該測(cè)試測(cè)定在含有與TEV蛋白酶位點(diǎn)和Gal4-VP16轉(zhuǎn)錄因子相連的重組人CXCR2的穩(wěn)定細(xì)胞系(Invitrogen)中，受體CXCR2的配體誘導(dǎo)的活化。配體與所述受體的結(jié)合導(dǎo)致抑制蛋白(用蛋白酶標(biāo)記)募集至所述受體并觸發(fā)轉(zhuǎn)錄因子的釋放受限。所述轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核并活化報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。化合物抑制CXCR2活化的能力通過(guò)測(cè)量所述報(bào)告基因的活性而間接評(píng)估。將一小瓶冷藏保存的細(xì)胞從液氮中取出并在37℃的水浴中輕輕攪拌以迅速解凍。收集該細(xì)胞內(nèi)含物并以約200,000個(gè)細(xì)胞/ml的密度再混懸于測(cè)試培養(yǎng)基中。將所有的測(cè)試化合物以10mM的濃度溶于DMSO中，然后連續(xù)稀釋以在384-孔測(cè)試板(Greiner781090)中產(chǎn)生10-點(diǎn)劑量響應(yīng)曲線，其使用Echo(Labcyte)濃度-響應(yīng)程序(50nl/孔)。向所述無(wú)細(xì)胞、未刺激和陽(yáng)性對(duì)照中裝入50nl/孔純的DMSO以確保所有測(cè)試板的DMSO濃度恒定。使用具有標(biāo)準(zhǔn)盒的Multi-dropCombi(Thermo)，在含化合物的測(cè)試板中將50μl測(cè)試培養(yǎng)基加至無(wú)細(xì)胞對(duì)照的各孔中；將50μl無(wú)hCXCL1(CXCR2配體)的細(xì)胞混懸液加至未刺激的對(duì)照孔(每孔約10,000個(gè)細(xì)胞)；并將50μl具有80nMhCXCL1的細(xì)胞混懸液加至該測(cè)試板的剩余孔中(每孔約10,000個(gè)細(xì)胞)。將該細(xì)胞在37℃/5％CO2培養(yǎng)過(guò)夜。使用具有小管盒的Multi-dropCombi(Thermo)將10μl的6x底物混合物(LiveBLAzerTM-FRETB/G底物(CCF4-AM)，目錄號(hào)K1096，購(gòu)自Invitrogen，Inc.)加至各孔并將該板在室溫避光培養(yǎng)2h。然后將該板在EnVision上使用一個(gè)激發(fā)通道(409nm)和兩個(gè)發(fā)射通道(460nm和530nm)進(jìn)行讀取。通過(guò)將除去背景的藍(lán)色發(fā)射值除以除去背景的綠色發(fā)射值來(lái)計(jì)算各孔的藍(lán)/綠發(fā)射比率(460nm/530nm)。所述劑量響應(yīng)曲線基于S型劑量-響應(yīng)模型。所有的比率數(shù)據(jù)基于各板的陽(yáng)性對(duì)照(hCXCL1)的最大發(fā)射比率和陰性對(duì)照(DMSO)的最小發(fā)射比率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。如該測(cè)試所測(cè)量，式(A)的化合物對(duì)CXCR2受體的pIC50為9.2。如該測(cè)試所測(cè)量，式(B)的化合物對(duì)CXCR2受體的pIC50為8.8。如該測(cè)試所測(cè)量，式(C)的化合物對(duì)CXCR2受體的pIC50為9.0。如該測(cè)試所測(cè)量，式(D)化合物對(duì)CXCR2受體的pIC50為8.9。如該測(cè)試所測(cè)量，式(E)化合物對(duì)CXCR2受體的pIC50為8.8。如該測(cè)試所測(cè)量，式(F)的化合物對(duì)CXCR2受體的pIC50為9.7。如該測(cè)試所測(cè)量，式(G)的化合物對(duì)CXCR2受體的pIC50為9.0。如該測(cè)試所測(cè)量，式(H)的化合物對(duì)CXCR2受體的pIC50為9.0。如該測(cè)試所測(cè)量，式(I)的化合物對(duì)CXCR2受體的pIC50為9.4。如該測(cè)試所測(cè)量，式(J)的化合物對(duì)CXCR2受體的pIC50為9.0。d)人全血測(cè)試版本i)通過(guò)靜脈穿刺在含有225微升0.25MEDTA的10ml注射器中由訓(xùn)練有素的醫(yī)療人員從健康同意的成年人獲得人血液并填充7ml血液(在整個(gè)CXCL1刺激期間保持在37℃)。將測(cè)試化合物溶于100％DMSO中至10mM的濃度，并在1.2％DMSO中稀釋至測(cè)定濃度的12倍(DMSO終濃度為0.1％)。測(cè)試：將100μl全血加入含有10微升1.2％DMSO(測(cè)定濃度為0.1％)或10微升溶解在1.2％DMSO中的化合物的測(cè)試管或96孔U底透明板中(測(cè)試濃度范圍0.1μM至10μM)，然后在37℃培養(yǎng)10分鐘，隨后加入10μl的DPBS中的0.1％BSA(陰性對(duì)照)或10μl的120nMCXCL1(GROα，PreproTech，Inc)(溶于0.1％BSA的DPBS溶液中)(測(cè)試濃度為10nM，其為CXCL1的EC80)，并在輕輕攪拌下在37℃培養(yǎng)另外10分鐘，然后置于冰上，通過(guò)加入250μlCellFix或250μl3.7％v/v多聚甲醛(BDBiosciences)終止測(cè)試。一分鐘后，將50μl固定血加入含有10μl抗CD11b-FITC(BeckmanCoulter)和5μl抗人CD16-PE(DakoCytomation)的管中，輕輕混合，且將總樣品加入500μl冷DPBS中。在使用LSR流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson)或FACSCantoII分析之前，將細(xì)胞在4℃用10μlLDS-751(MolecularProbes)核酸染色劑染色10分鐘，允許細(xì)胞儀閾值設(shè)置排除紅細(xì)胞。使用CellQuest軟件或FACsdiva進(jìn)行分析。通過(guò)順序門控測(cè)定嗜中性粒細(xì)胞群；首先在側(cè)向散射對(duì)前向散射圖中對(duì)所有粒細(xì)胞進(jìn)行門控，然后對(duì)粒細(xì)胞群(CD16+嗜中性粒細(xì)胞，CD16-嗜酸性粒細(xì)胞)中的CD16+(PE熒光)細(xì)胞進(jìn)行門控。評(píng)估每個(gè)樣品的嗜中性粒細(xì)胞群體的平均FITC熒光，因?yàn)槠渲苯由婕癈D11b含量，即CXCR2激活的生物標(biāo)志物。測(cè)定每個(gè)樣品的平均熒光。陽(yáng)性對(duì)照定義為用10nMCXCL1(無(wú)抑制劑)刺激的樣品的熒光值。陰性對(duì)照定義為載體處理的樣品(無(wú)CXCL1，無(wú)抑制劑)的熒光值。從每個(gè)樣品中減去平均陰性對(duì)照值。然后將所有樣品相對(duì)于平均陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行歸一化。如該版本的測(cè)試中所測(cè)量的，式(A)的化合物對(duì)CXCR2受體的pIC50為5.7。如該版本的測(cè)試中所測(cè)量的，式(B)的化合物對(duì)CXCR2受體的pIC50為6.4。如該版本的測(cè)試中所測(cè)量的，式(D)化合物對(duì)CXCR2受體的pIC50為5.4。版本ii)通過(guò)靜脈穿刺從知情的成人中抽取血液并倒入含有抗凝血?jiǎng)└嗡?10uL/mL血液)的Sterilin管中。將所有測(cè)試化合物溶于DMSO至4mM并在板中以1:3連續(xù)稀釋，得到10點(diǎn)劑量響應(yīng)曲線。然后將該化合物在PBS[磷酸鹽緩沖液(無(wú)氯化鈣和氯化鎂)]中稀釋100倍，之后使用FX將1uL分配于96U型底的Costar板上。這么做是為了將最終的DMSO濃度降低至0.25％并在加入血液后以10uM的最終測(cè)試濃度篩選化合物。使用多通道移液管將10μL血液轉(zhuǎn)移至化合物板，輕輕敲打并在37℃培養(yǎng)15分鐘。15分鐘后，將刺激物GROα在0.1％BSA(牛血清白蛋白)-PBS中稀釋成100nM并將5μL分配至整個(gè)板上，使最終濃度為33nM。輕輕敲打平板并在37℃再培養(yǎng)15分鐘。將該板置于冰上1分鐘，然后加入10μL由BioLegend(地址：CambridgeBioscience，MunroHouse，TrafalgarWay，BarHill，Cambridge，UK)的CD11b-FITC(40ug/mL)和購(gòu)自BDPharmingen(地址：TheDanbyBuilding，EdmundHalleyRoad，OxfordSciencePark，Oxford，UK)的CD16-PE組成的抗體混合物(儲(chǔ)備濃度100倍測(cè)試濃度，將2mL儲(chǔ)備體積以1:5稀釋)。將該板在冰上避光1小時(shí)。然后將該細(xì)胞使用200uL/孔的1xFACS(流式激活細(xì)胞分選(FlowActivatedCellSorting))裂解溶液(Becton和Dickinson-BD)進(jìn)行固定并在冰上避光20分鐘。將該板以1600rpm離心5分鐘并用200uL冰冷的PBS再混懸。將這個(gè)步驟重復(fù)兩次并在最終步驟中將該板用50uL冰冷的-PBS再混懸，用于流式細(xì)胞檢測(cè)分析。將樣品在Becton和Dickinson(BD)-AcurriC6流式細(xì)胞儀上，使用HyperCyt采樣裝置(IntelliCyt)以2uL/秒的流速運(yùn)行。監(jiān)測(cè)在嗜中性粒細(xì)胞中CD11b的上調(diào)并使用側(cè)向散射和CD16表達(dá)的組合進(jìn)行鑒定。如該版本的測(cè)試中所測(cè)量的，式(J)的化合物對(duì)CXCR2受體的pIC50為7.4。如該版本的測(cè)試中所測(cè)量的，式(D)化合物對(duì)CXCR2受體的pIC50為5.8。該值類似于該測(cè)試版本ii)中測(cè)量的式D的化合物獲得的pIC505.4，因此測(cè)試d)的版本i)和ii)的結(jié)果是相當(dāng)?shù)?。e)GPCR抑制蛋白測(cè)試本發(fā)明的某些化合物還由DiscoveRXCorporation(42501AlbraeStreet，F(xiàn)remont，CA94538，UnitedStates)在他們的GPCR抑制蛋白(Arrestin)測(cè)定中測(cè)試，以確定它們對(duì)包括CXCR2和CXCR1的一組受體的活性。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法從冷凍庫(kù)中擴(kuò)增PathHunterCHO細(xì)胞系。將細(xì)胞以20μL的總體積接種到白壁384孔微量培養(yǎng)板中，并在測(cè)試前在37℃培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間。將細(xì)胞與拮抗劑預(yù)培養(yǎng)，隨后在EC80濃度下進(jìn)行激動(dòng)劑刺激。進(jìn)行樣品儲(chǔ)液的中間稀釋以在測(cè)試緩沖液中產(chǎn)生5X樣品。將5μL5x樣品加入細(xì)胞中，并在37℃或室溫培養(yǎng)30分鐘。載體濃度為1％。將5μL的測(cè)試緩沖液中的6XEC80激動(dòng)劑加入到細(xì)胞中，并在37℃或室溫培養(yǎng)90或180分鐘。通過(guò)單次添加12.5或15μL(50％v/v)PathHunter檢測(cè)試劑混合物，隨后在室溫培養(yǎng)1小時(shí)產(chǎn)生測(cè)試信號(hào)。在用用于化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)的PerkinElmerEnvisionTM儀器產(chǎn)生信號(hào)后讀取微孔板。使用CBIS數(shù)據(jù)分析套件(ChemInnovation，CA)分析化合物活性。使用下式計(jì)算抑制百分比：％抑制＝100％×(1-(測(cè)試樣品的平均RLU-載體對(duì)照的平均RLU)/(EC80對(duì)照的平均RLU-載體對(duì)照的平均RLU))。如該測(cè)試所測(cè)量，式(J)的化合物對(duì)CXCR2受體的pIC50值為8.3且對(duì)CXCR1受體的pIC50值為5.4。如該測(cè)試所測(cè)量，式(J)的化合物對(duì)CXCR2的選擇性是CXCR1的730倍。如該測(cè)試所測(cè)量，式(D)化合物對(duì)CXCR2受體的pIC50值為7.0且對(duì)CXCR1受體的pIC50值為5.6。如該測(cè)試所測(cè)量，式(D)化合物對(duì)CXCR2的選擇性是CXCR1的29倍。f)奧沙利鉑和式(A)的化合物在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系增殖測(cè)試中的作用細(xì)胞增殖測(cè)試:細(xì)胞以不同細(xì)胞密度接種于96-孔板(Costar)：HCT116，500個(gè)細(xì)胞/孔；Caco-2，1000個(gè)細(xì)胞/孔。培養(yǎng)基的總體積為90μl/孔。細(xì)胞在37℃和5％CO2培養(yǎng)器中培養(yǎng)24小時(shí)。奧沙利鉑和式(A)的化合物濃度系列進(jìn)一步用DPBS稀釋。奧沙利鉑在HCT116細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中的終濃度來(lái)自500μM的3倍稀釋，15種濃度和一個(gè)對(duì)照。The終濃度sof奧沙利鉑在Caco-2細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中的終濃度來(lái)自55.5μM的3倍稀釋，9種濃度和一個(gè)對(duì)照。式(A)的化合物的終濃度為8.5μM。5μL奧沙利鉑連同5μl載體或式(A)的化合物一起添加至培養(yǎng)基且再在37℃和5％CO2培養(yǎng)器中培養(yǎng)72小時(shí)。細(xì)胞增殖速率通過(guò)添加100μlCellTiter-GloTM(Promega)根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行測(cè)量。培養(yǎng)10分鐘后，將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至OptiPlate-384孔，通過(guò)BioTekSynergyTM4Hybrid微板讀取器使用Gen5軟件記錄發(fā)光。所有數(shù)據(jù)點(diǎn)一式五份生成。進(jìn)行三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)分析：pIC50值通過(guò)軟件GraphPadPrism5使用S形濃度-響應(yīng)(可變斜率)計(jì)算。所有數(shù)據(jù)表示為來(lái)自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)確定的平均值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。通過(guò)從三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)確定的單因素ANOVA方差分析(GraphPadPrism5)分析單獨(dú)的式(A)化合物(8.5μM)對(duì)Caco-2和HCT116細(xì)胞系的基底增殖的影響。在這些分析中包括從奧沙利鉑濃度響應(yīng)曲線和載體對(duì)照的整體產(chǎn)生的所有數(shù)據(jù)，以允許相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)奧沙利鉑的確定的生物效應(yīng)的背景下單獨(dú)的式(A)化合物的作用。結(jié)果：奧沙利鉑顯示在Caco-2和HCT116細(xì)胞系中對(duì)細(xì)胞增殖的濃度-依賴性抑制，其中pIC50值分別為5.923±0.047和6.049±0.016。在濃度為8.5μM的式(A)的化合物的存在下，這些奧沙利鉑抑制細(xì)胞增殖的效力不受影響，其中pIC50值分別為5.95±0.07和6.05±0.02。在Caco-2和HCT116細(xì)胞系中；單獨(dú)的式(A)化合物存在基底增殖的非顯著性降低，分別為2.7±2.1％和8.9±0.7％。此外，這些影響小于在各個(gè)奧沙利鉑濃度響應(yīng)曲線中觀察到的生物相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，式(A)的化合物(8.5μM)單獨(dú)對(duì)兩種細(xì)胞系的基底細(xì)胞增殖沒有影響。g)慢性壓迫性損傷嚙齒類中的臨床前基因表達(dá)神經(jīng)性疼痛的慢性壓迫性損傷(CCI)模型涉及具有四個(gè)結(jié)扎的坐骨神經(jīng)的單側(cè)松散連接。這導(dǎo)致出現(xiàn)痛覺過(guò)敏，異常性疼痛和自發(fā)性疼痛(異位放電)，部分由外周中炎性細(xì)胞的募集和脊髓中小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化引起。認(rèn)為該模型模擬在臨床中觀察到的神經(jīng)性疼痛的一些癥狀和病因(Bennett和Xie，Pain198833(1)：87-107(1988)；Field等，Pain83(2)：303-11(1999)。在CCI模型中已經(jīng)觀察到嚙齒動(dòng)物中感覺終點(diǎn)的早期改變，導(dǎo)致對(duì)熱(Neuropharmacology，79(2014)432-443；Pain，101(2003)65-77)和機(jī)械刺激(Neuropharmacology，79(2014)432-443；BrainResearch，784(1998)154-162)的敏感性增加，分別使用冷丙酮刺激和vonFrey細(xì)絲。雄性SpragueDawley大鼠(Harlan，UK.200-250克)在四個(gè)一組的標(biāo)準(zhǔn)籠養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)，自由獲取食物(5CR4，Purina)和水(放置在測(cè)試箱中時(shí)除外)，以12/12光/暗循環(huán)。從到達(dá)日提供環(huán)境豐富化，并在星期一(城堡)，星期三(房子)和星期五(管)改變以防止自殘。將雄性C57BL6小鼠(Harlan，UK，6-7周齡)放在標(biāo)準(zhǔn)的籠中，實(shí)驗(yàn)室條件和5個(gè)一組的環(huán)境富集中，自由獲得食物(5CR4，Purina)和水(放置在測(cè)試箱中時(shí)除外)，以12/12光/暗循環(huán)。行為部分：基線測(cè)試：所有動(dòng)物在手術(shù)前進(jìn)行機(jī)械性異常性疼痛的行為測(cè)試，以確定基線縮足閾值。對(duì)于大鼠研究，將對(duì)用von-Frey纖毛刺激的最后兩個(gè)(共三個(gè))的基線縮足閾值(PWT)的平均值作為基線。對(duì)于小鼠研究，在兩個(gè)分開的天(第-1天和第0天)收集基線數(shù)據(jù)。手術(shù)過(guò)程：在與氧氣混合的異氟烷麻醉(3:1，1L/min)下，將左后腿在大腿中部水平剃毛，并使用手術(shù)刀穿過(guò)皮膚進(jìn)行切口。通過(guò)使用一對(duì)鋒利的剪刀進(jìn)行初始切開來(lái)解剖股二頭肌層，然后使用一對(duì)鈍剪刀將其擴(kuò)大。暴露常見的坐骨神經(jīng)，并且在坐骨神經(jīng)周圍綁扎3根(用于小鼠)或4根(用于大鼠)疏松綁扎的聚丙烯縫線(對(duì)于小鼠)或鉻腸線(SMI)(對(duì)于大鼠)，每個(gè)之間具有1mm的間距。然后將神經(jīng)返回到肌肉層下面，使用可吸收縫線(Vicryl)閉合傷口。假手術(shù)動(dòng)物進(jìn)行相同的程序，只是神經(jīng)未結(jié)扎。在手術(shù)后3天開始行為測(cè)試，在第3天和第7天采取機(jī)械響應(yīng)閾值。在CCI手術(shù)治療后的第1天、第3天和第7天收集來(lái)自DRG和坐骨神經(jīng)的組織。在第1天和第3天使用單獨(dú)的手術(shù)制備的動(dòng)物組進(jìn)行組織收集，并在第3天進(jìn)行行為評(píng)估。通過(guò)放置在適當(dāng)大小的標(biāo)記管中并放置在液氮中將所有組織速凍。靜態(tài)機(jī)械(觸覺)異常性疼痛：大鼠：將動(dòng)物置于具有0.5cm2網(wǎng)格的升高的網(wǎng)底平臺(tái)上，并將倒置的有機(jī)玻璃容器置于各動(dòng)物之上。在初始15-20分鐘適應(yīng)/習(xí)慣期后進(jìn)行測(cè)試。使用校準(zhǔn)的(力；g)von-Frey單絲(觸摸測(cè)試感覺評(píng)估器；ScientificMarketingAssociates)實(shí)現(xiàn)縮足閾值的測(cè)量，其應(yīng)用后爪的足底表面約8秒，用足夠的力以引起細(xì)絲的稍微彎曲?？s足閾值通過(guò)增加和減少刺激強(qiáng)度來(lái)確定，并使用Dixon的上下方法估計(jì)[Dixon，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.，20，441-62(1980)；Chaplan等人，J.Neurosci.Methods，Jul，53(1)，55-63(1994)]。僅認(rèn)為對(duì)刺激的立即快速縮回反應(yīng)(或退縮)代表陽(yáng)性反應(yīng)。小鼠：通過(guò)使用應(yīng)用于后爪的足底表面的校準(zhǔn)(力；g)von-Frey單絲(Touch-TestSensoryEvaluator；ScientificMarketingAssociates)，通過(guò)測(cè)量縮足閾值來(lái)評(píng)估靜態(tài)機(jī)械性異常性疼痛。在試驗(yàn)前將動(dòng)物置于凸起的金屬網(wǎng)上的單獨(dú)的Perspex盒中30-40分鐘。以1秒開1秒關(guān)的方案依次施加一系列漸變的vonFrey纖毛(0.07，0.16，0.4，0.6和1g)，重復(fù)10次。將每根纖毛垂直地施加到爪的腹側(cè)表面的中心，直到它略微彎曲。施加到動(dòng)物后爪以在10個(gè)軌跡中誘導(dǎo)5個(gè)響應(yīng)的力將被記錄為PWT。僅認(rèn)為對(duì)刺激的立即快速縮回反應(yīng)(或退縮)代表陽(yáng)性反應(yīng)。在連續(xù)兩天(第-1天和第0天)評(píng)估和在手術(shù)后第3天和第7天重新評(píng)估PWT，以監(jiān)測(cè)機(jī)械性異常性疼痛的發(fā)展。統(tǒng)計(jì)分析：行為數(shù)據(jù)通過(guò)GraphpadPrism使用常規(guī)雙因素ANOVA方差分析進(jìn)行分析，“治療”作為受試者之間的效應(yīng)，且“天”作為受試者內(nèi)的效應(yīng)。使用Bonferroni方法進(jìn)行事后分析。p值<0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。mRNA表達(dá)：QuantStudioOpenArray用于評(píng)估CCI對(duì)觸覺行為終點(diǎn)后NPY(神經(jīng)肽Y)、CXCR2及其同族配體CXCL1的表達(dá)水平的影響。解剖出大鼠和小鼠的坐骨神經(jīng)并在液氮中快速冷凍。將組織在-80℃冷凍儲(chǔ)存或在干冰上儲(chǔ)存，直到處理用于CXCR2和CXCL1的RNA分析。ActB、GAPDH、HPRT1和MAPK6用作內(nèi)部測(cè)試對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品，并且NPY用作CCI的對(duì)照。使用Q-PCR測(cè)量以下基因。測(cè)試用于制備預(yù)擴(kuò)增池。大鼠的具體測(cè)試基因符號(hào)Taqman測(cè)試IDActBRn00667869_m1CXCL1Rn00578225_m1CXCR2Rn00567841_m1GAPDHRn01775763_g1HPRT1Rn01527840_m1MAPK6Rn00581152_m1NPYRn01410145_m1小鼠的具體測(cè)試基因符號(hào)Taqman測(cè)試IDActBMm01205647_g1CXCL1Mm04207460_m1CXCR2Mm00438258_m1GAPDHMm99999915_g1HPRT1Mm01545399_m1MAPK6Mm00727050_s1NPYMm03048253_m1總RNA分離：對(duì)于每個(gè)組織樣品，通過(guò)根據(jù)制造商的說(shuō)明在RocheMagnaLyser上的GreenBead管(Roche)中的MagNAPureLC裂解緩沖液(Roche)中將組織勻漿來(lái)制備一個(gè)RNA樣品，并使用RocheMagnaPureRNA分離系統(tǒng)(Roche)根據(jù)制造商手冊(cè)中的說(shuō)明進(jìn)行總RNA分離。將樣品以50μL等分試樣洗脫，并在80℃儲(chǔ)存直至需要。RNA定量和完整性評(píng)估：根據(jù)制造商的手冊(cè)，在LifeTechnologiesQubit上定量每個(gè)總RNA樣品。使用AgilentPico試劑盒(AgilentTechnologies)根據(jù)制造商的手冊(cè)在Agilent2100生物分析儀上評(píng)估總RNA樣品的代表性樣品的完整性。如果RIN(RNA完整性數(shù))為6或更大，則認(rèn)為RNA是可接受的質(zhì)量。第一鏈cDNA合成：使用SuperscriptVilo試劑盒(LifeTechnologies)從50ng的每種總RNA合成第一鏈cDNA。每個(gè)RNA用無(wú)RNase的水補(bǔ)足至11μL，并向每個(gè)RNA樣品中加入14μL主混合物。主混合物基于下表制成:組分體積5xViloRT緩沖液5μL10xVilo酶混合物2.5μL無(wú)核酸酶的水6.5μL最終體積RT主混合物14μL將樣品在DNA熱循環(huán)儀中在25℃培養(yǎng)10分鐘，在42℃培養(yǎng)60分鐘，然后在85℃培養(yǎng)5分鐘。合成后，將cDNA儲(chǔ)存在-20℃直至準(zhǔn)備使用。預(yù)擴(kuò)增：Taqman測(cè)試(LifeTechnologies)的預(yù)擴(kuò)增池通過(guò)將10μL每種x20測(cè)試混合在一起而制備(共16種測(cè)試：4種感興趣的基因(大鼠)，4種管家基因(Housekeepers)(大鼠)，4種感興趣的基因(小鼠)和4種管家基因(小鼠))并稀釋至x0.2(通過(guò)加入840μLTE緩沖液(LifeTechnologies))各25μLcDNA通過(guò)以下培養(yǎng)而擴(kuò)增:試劑體積2xPreAmpMM25μL0.2X匯聚的測(cè)試混合物12.5μL使用以下循環(huán)條件:階段重復(fù)溫度時(shí)間酶活化(保持)1195℃10minsPCR(周期)21495℃30sec60℃4mins酶滅活99℃10mins將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物儲(chǔ)存在-20℃直到準(zhǔn)備使用，然后用0.1XTE(pH8.0)稀釋1:10，然后在TaqManOpenArray上運(yùn)行。實(shí)時(shí)定量PCR：根據(jù)LifeTechnologies指南設(shè)置并運(yùn)行QuantStudio開放陣列。將2X實(shí)時(shí)PCR主混合物(LifeTechnologies；cat：4462164)混合，并組合以下組分：組分1個(gè)樣品的體積2x開放陣列主混合物2.5μL水1.3μL將1.2μL每種預(yù)擴(kuò)增的cDNA與3.8μL開放陣列主混合物混合，并置于Accufill384孔板中，通過(guò)AccufillTM系統(tǒng)分配到開放陣列上。OpenArray樣品跟蹤器軟件用于跟蹤樣品。開放陣列在QuantStudio上運(yùn)行，并在QuantStudio上進(jìn)行分析和質(zhì)量控制，并將生成的文件導(dǎo)出到ArrayStudio進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過(guò)QuantStudio開放陣列評(píng)估小鼠和大鼠坐骨神經(jīng)中的CXCR2、CXCL1和NPY的表達(dá)：ArrayStudio中的分析：使用OpenArray條形碼注釋QuantStudio.txt文件，刪除具有空目標(biāo)名稱值的所有行，并且將其適當(dāng)排序?yàn)锳rrayStudio的格式。單獨(dú)的開放陣列.txt文件已上傳到ArrayStudio中。檢查“無(wú)逆轉(zhuǎn)錄”、“無(wú)模板對(duì)照”和“水空白”數(shù)據(jù)，并從最終分析中除去。對(duì)四種管家基因進(jìn)行主成分分析(PCA)。在第一次PCA運(yùn)行后去除異常值數(shù)據(jù)。在通過(guò)管家基因調(diào)整協(xié)方差的影響后，使用該模型估計(jì)每個(gè)基因和治療的平均log2(豐度)。選擇并運(yùn)行全線性分析模型和分析因子。這產(chǎn)生了歸一化數(shù)據(jù)的匯總表、去除了異常值的匯總表、每個(gè)基因的系數(shù)和指示基因是否通過(guò)歸一化改進(jìn)的P值。通過(guò)3因素主成分分析來(lái)分析這些數(shù)據(jù)，以檢查生物復(fù)制樣品聚集在一起。在每個(gè)模型和物種內(nèi)通過(guò)單因素ANOVA方差分析來(lái)分析數(shù)據(jù)，以在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生不同處理之間的倍數(shù)差值。計(jì)算平均差異不包含0的貝葉斯后驗(yàn)概率。取大于0.95的概率表示平均差異顯著不同于0。對(duì)于CCI模型，比較類似組織的同側(cè)和對(duì)側(cè)樣品。結(jié)果：當(dāng)觀察組織表達(dá)時(shí)，在涉及CCI的大鼠和小鼠實(shí)驗(yàn)之間的組間基線縮足閾值(PWT)沒有差異。CCI誘導(dǎo)顯著的機(jī)械性異常性疼痛表型，如通過(guò)大鼠(圖1)和小鼠(圖2)中PWT的顯著減少所反映的。在大鼠中，與基線值和在這些時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組相比，CCI組的PWT在手術(shù)后的第3天和第7天顯著降低(圖1)。(數(shù)值是平均值±SEM。**P<0.01，表示在相同時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組相比的顯著性，雙因素ANOVA方差分析?；€：n＝20/組；第3天：n＝15/組；第7天：n＝10/組)。類似地，小鼠在慢性壓迫性損傷后發(fā)展機(jī)械性異常性疼痛。術(shù)后第3天和第7天，CCI組的PWT顯著降低(圖2)。(數(shù)值是平均值±SEM。***P<0.001，表示在相同時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組相比的顯著性，雙因素ANOVA方差分析。第-1天：假手術(shù)組n＝20，CCI組n＝21；第0天：假手術(shù)組n＝20，CCI組n＝10；第3天：假手術(shù)組n＝15，CCI組n＝16；第7天：假手術(shù)組n＝10，CCI組n＝11)。從圖3(大鼠)和圖4(小鼠)可以看出，CXCR2和CXCL1在大鼠和小鼠中的表達(dá)譜在CCI誘導(dǎo)第1天后的坐骨神經(jīng)中的CCI(同側(cè)；ipsi)的位點(diǎn)處顯著升高，如通過(guò)與假處理的動(dòng)物相比的倍數(shù)變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著增加所證明。當(dāng)與假手術(shù)治療的動(dòng)物比較時(shí)，在CCI誘導(dǎo)后第3天，在坐骨神經(jīng)中CCI(同側(cè)；ipsi)的位點(diǎn)處的神經(jīng)感覺肽(神經(jīng)肽Y(NPY))的表達(dá)譜僅在大鼠中顯著升高。從圖3可以看出，與假手術(shù)組動(dòng)物或?qū)?cè)組織相比，CCI手術(shù)后的早期階段，同側(cè)坐骨神經(jīng)中CXCR2及其配體CXCL1mRNA顯著增加，在第7天減退。在第7天，與假手術(shù)動(dòng)物和對(duì)側(cè)組織相比，神經(jīng)肽-Y(NPY)mRNA在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同。值顯示為平均值。#表示在同一時(shí)間點(diǎn)CCI和假手術(shù)大鼠之間的顯著性差異，*表示在相同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)側(cè)和同側(cè)坐骨神經(jīng)之間的顯著性差異，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n＝5/組，通過(guò)貝葉斯后驗(yàn)概率>0.95評(píng)估。ipsi＝同側(cè)；contra＝對(duì)側(cè)。從圖4(小鼠)可以看出，與假手術(shù)動(dòng)物或?qū)?cè)組織相比，CCI手術(shù)后的早期階段，同側(cè)坐骨神經(jīng)中CXCR2及其配體CXCL1mRNA顯著增加，在第7天減退。在進(jìn)行測(cè)量的任何時(shí)間點(diǎn)，與假手術(shù)動(dòng)物或?qū)?cè)組織相比，神經(jīng)肽-Y(NPY)mRNA沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。值顯示為平均值。#表示在同一時(shí)間點(diǎn)CCI和假手術(shù)小鼠之間的顯著性差異，*表示在相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)側(cè)和同側(cè)坐骨神經(jīng)之間的顯著性差異，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n＝5，通過(guò)貝葉斯后驗(yàn)概率>0.95評(píng)估。ipsi＝同側(cè)；contra＝對(duì)側(cè)?？偨Y(jié)：在兩種嚙齒動(dòng)物物種中的CCI程序引起穩(wěn)健的機(jī)械性異常性疼痛。在這兩種物種中，增強(qiáng)的CXCR2和CXCL1mRNA表達(dá)在機(jī)械性異常性疼痛的暫時(shí)評(píng)估的早期明顯。在大鼠中感覺神經(jīng)肽Y表達(dá)也有變化。大鼠中的這種特性與在CCI模型中CXCR2系統(tǒng)和感覺神經(jīng)肽的已知靈敏度一致，并且允許該方法用于在奧沙利鉑模型中檢測(cè)這些蛋白質(zhì)。h)在奧沙利鉑-誘導(dǎo)的急性感覺損傷嚙齒動(dòng)物中的臨床前基因表達(dá)將成年雄性Sprague-Dawley大鼠(230-300g)在恒定溫度和濕度的受控環(huán)境(溫度：21±1℃，光:暗周期為12:12小時(shí))中以3～5只一組圈養(yǎng)在有機(jī)玻璃籠中，隨意獲得食物和水。將成年雄性C57BL6小鼠(21-30g)在恒定溫度和濕度的受控環(huán)境(溫度：21±1℃，光:暗周期為12:12小時(shí))中以3～5只一組圈養(yǎng)在有機(jī)玻璃籠中，隨意獲得食物和水。允許動(dòng)物從運(yùn)輸中恢復(fù)至少一周，然后開始實(shí)驗(yàn)?；€測(cè)試：所有動(dòng)物在注射前進(jìn)行機(jī)械性異常性疼痛的行為測(cè)試，以確定基線縮足閾值。在最后兩天(第-1天和第0天)獲取用von-Frey纖毛刺激的基線PWT。神經(jīng)病變誘導(dǎo)：制備2mg/ml的奧沙利鉑在5％葡萄糖中的溶液。對(duì)于大鼠，在第0天通過(guò)腹膜內(nèi)途徑以12mg/kg以6ml/kg的體積施用單劑量的奧沙利鉑。載體對(duì)照組接受腹膜內(nèi)6ml/kg的5％葡萄糖溶液。對(duì)于小鼠，在第0天通過(guò)腹膜內(nèi)途徑以15mg/kg以7.5ml/kg的體積施用單劑量的奧沙利鉑。載體對(duì)照組接受腹膜內(nèi)7.5ml/kg的5％葡萄糖溶液。行為部分：通過(guò)在施用單劑量的載體或奧沙利鉑后測(cè)量PWT來(lái)確定機(jī)械性異常性疼痛的出現(xiàn)。在連續(xù)兩天(第-1天和第0天)測(cè)定PWT，然后在第1天、第3天和/或第7天重新評(píng)估。大鼠：在試驗(yàn)前將動(dòng)物置于凸起的金屬網(wǎng)上的單獨(dú)有機(jī)玻璃盒中至少40分鐘。從最小力(約1g)的細(xì)絲開始，將每根細(xì)絲垂直地施加到爪的腹側(cè)表面的中心，直到輕微彎曲6秒。如果動(dòng)物在刺激時(shí)縮回或抬起爪子，則使用具有稍微低于測(cè)試的力的纖毛。如果沒有觀察到反應(yīng)，則測(cè)試具有稍微更高的力的纖毛。將誘導(dǎo)可靠反應(yīng)所需的最小量的力(5次試驗(yàn)中3次為陽(yáng)性)記錄為PWT的值。小鼠：在測(cè)試前將動(dòng)物置于凸起的金屬網(wǎng)上的單獨(dú)的有機(jī)玻璃盒中30-40分鐘。以1秒開1秒關(guān)的方案依次施加一系列漸變的vonFrey纖毛(0.07、0.16、0.4、0.6和1g)，重復(fù)10次。將每根纖毛垂直地施加到爪的腹側(cè)表面的中心，直到它略微彎曲。施加于動(dòng)物后爪以在10次試驗(yàn)中誘導(dǎo)5次反應(yīng)的力記錄為PWT。組織取樣：在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用包含異氟烷+氧氣的混合氣體麻醉動(dòng)物，并通過(guò)斷頭術(shù)殺死動(dòng)物。手術(shù)切除來(lái)自每側(cè)的坐骨神經(jīng)的節(jié)段，在分析天平上稱重并記錄。將來(lái)自每側(cè)的坐骨神經(jīng)分別置于2mlCorning小瓶中。組織在液氮中快速冷凍，然后在-80度儲(chǔ)存。統(tǒng)計(jì)分析：通過(guò)GraphpadPrism使用常規(guī)雙因素ANOVA方差分析來(lái)分析行為數(shù)據(jù)，“治療”作為受試者之間的效應(yīng)，“天”作為受試者內(nèi)的效應(yīng)。使用Bonferroni方法進(jìn)行事后分析。p值<0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的?；虮磉_(dá)部分：切除嚙齒動(dòng)物的坐骨神經(jīng)并在液氮中快速冷凍。將組織在-80℃冷凍儲(chǔ)存或在干冰上儲(chǔ)存，直到處理用于CXCR2和CXCL1的RNA分析。ActB、GAPDH、HPRT1和MAPK6用作內(nèi)部測(cè)試對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品，并且NPY用作奧沙利鉑誘導(dǎo)的損傷的對(duì)照。使用Q-PCR測(cè)量以下基因。測(cè)試用于制備預(yù)擴(kuò)增池。大鼠的具體測(cè)試基因符號(hào)Taqman測(cè)試IDActBRn00667869_m1CXCL1Rn00578225_m1CXCR2Rn00567841_m1GAPDHRn01775763_g1HPRT1Rn01527840_m1MAPK6Rn00581152_m1NPYRn01410145_m1小鼠的具體測(cè)試基因符號(hào)Taqman測(cè)試IDActBMm01205647_g1CXCL1Mm04207460_m1CXCR2Mm00438258_m1GAPDHMm99999915_g1HPRT1Mm01545399_m1MAPK6Mm00727050_s1NPYMm03048253_m1總RNA分離：對(duì)于每個(gè)組織樣品，根據(jù)制造商的說(shuō)明，通過(guò)在RocheMagnaLyser上的GreenBead管(Roche)中的MagNAPureLC裂解緩沖液(Roche)中將組織勻漿制備一個(gè)RNA樣品，并使用RocheMagnaPureRNA分離系統(tǒng)(Roche)根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行總RNA分離。將樣品以50μL等分試樣洗脫，并在-80℃儲(chǔ)存直至需要。RNA定量和完整性評(píng)估：根據(jù)制造商的說(shuō)明，在LifeTechnologiesQubit上定量每個(gè)總RNA樣品。使用AgilentPico試劑盒(AgilentTechnologies)，根據(jù)制造商的說(shuō)明，在Agilent2100Bioanalyser上評(píng)估總RNA樣品的代表性樣品的完整性。如果RIN為6或更多，則認(rèn)為RNA是可接受的質(zhì)量。第一鏈cDNA合成：使用SuperscriptVilo試劑盒(LifeTechnologies)從50ng的每種總RNA合成第一鏈cDNA。每個(gè)RNA用無(wú)RNase的水補(bǔ)足至11μL，并向每個(gè)RNA樣品中加入14μL主混合物。主混合物基于下表制成:組分體積5xViloRT緩沖液5μL10xVilo酶混合物2.5μL無(wú)核酸酶的水6.5μL最終容積RTmastermix14μL將樣品在DNA熱循環(huán)儀中在25℃培養(yǎng)10分鐘，在42℃培養(yǎng)60分鐘，然后在85℃培養(yǎng)5分鐘。合成后，將cDNA儲(chǔ)存在-20℃直至準(zhǔn)備使用。預(yù)擴(kuò)增：Taqman測(cè)試(LifeTechnologies)的預(yù)擴(kuò)增池通過(guò)將10μL每種x20測(cè)試混合在一起而制備[共16種測(cè)試：4種感興趣的基因(大鼠)，4種管家基因(大鼠)]并稀釋至x0.2(通過(guò)加入840μLTE緩沖液(LifeTechnologies)]。各25μLcDNA等分試樣通過(guò)以下培養(yǎng)而擴(kuò)增:試劑體積2xPreAmpMM25μL0.2X匯聚的測(cè)試混合物12.5μL使用以下循環(huán)條件:階段重復(fù)溫度時(shí)間酶活化(保持)1195℃10minsPCR(周期)21495℃30sec60℃4mins酶滅活99℃10mins將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物儲(chǔ)存在-20℃直到準(zhǔn)備使用，且用0.1XTE(pH8.0)稀釋1:10，然后在TaqManOpenArray上運(yùn)行。實(shí)時(shí)定量PCR：根據(jù)LifeTechnologies指南設(shè)置并運(yùn)行QuantStudio開放陣列。將2X實(shí)時(shí)PCR主混合物(LifeTechnologies；cat：4462164)混合，并組合以下組分：組分1個(gè)樣品的體積2x開放陣列主混合物2.5μL水1.3μL將1.2μL每種預(yù)擴(kuò)增的cDNA與3.8μL開放陣列主混合物混合，并置于Accufill384孔板中，通過(guò)AccufillTM系統(tǒng)分配到開放陣列上。OpenArray樣品跟蹤器軟件用于跟蹤樣品。開放陣列在QuantStudio上運(yùn)行，并在QuantStudio上進(jìn)行分析和質(zhì)量控制，并將生成的文件導(dǎo)出到ArrayStudio進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過(guò)QuantStudio開放陣列評(píng)估大鼠坐骨神經(jīng)中的CXCR2、CXCL1、NPY和CGRP的表達(dá)。ArrayStudio中的分析：使用OpenArray條形碼注釋QuantStudio.txt文件，刪除具有空目標(biāo)名稱值的所有行，并且將其適當(dāng)排序?yàn)锳rrayStudio的格式。單獨(dú)的開放陣列.txt文件已上傳到ArrayStudio中。檢查“無(wú)逆轉(zhuǎn)錄”、“無(wú)模板對(duì)照”和“水空白”數(shù)據(jù)，并從最終分析中除去。對(duì)四種管家基因進(jìn)行主成分分析(PCA)。在第一次PCA運(yùn)行后去除異常值數(shù)據(jù)。在通過(guò)管家基因調(diào)整協(xié)方差的影響后，使用該模型估計(jì)每個(gè)基因和治療的平均log2(豐度)。選擇并運(yùn)行全線性分析模型和分析因子。這產(chǎn)生了歸一化數(shù)據(jù)的匯總表、去除了異常值的匯總表、每個(gè)基因的系數(shù)和指示基因是否通過(guò)歸一化改進(jìn)的P值。通過(guò)3因素主成分分析來(lái)分析這些數(shù)據(jù)，以檢查生物復(fù)制樣品聚集在一起。在每個(gè)模型和物種內(nèi)通過(guò)單因素ANOVA方差分析來(lái)分析數(shù)據(jù)，以在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生不同處理之間的倍數(shù)差值。計(jì)算平均差異不包含0的貝葉斯后驗(yàn)概率。計(jì)算平均差異不包含0的貝葉斯后驗(yàn)概率。如果概率大于0.95，則意味著平均差異顯著不同于0。分別比較每個(gè)組織。結(jié)果：在涉及奧沙利鉑的大鼠和小鼠實(shí)驗(yàn)之間，各組之間的基線PWT沒有差異。從圖5(大鼠)和圖6(小鼠)可以看出，奧沙利鉑治療在兩種嚙齒動(dòng)物物種中引起顯著的機(jī)械性異常性疼痛，如從第1天維持至第7天的PWT的顯著降低所表示的。從圖5可以看出，大鼠在單劑量的奧沙利鉑后產(chǎn)生機(jī)械性異常性疼痛。在第1、3和7天，奧沙利鉑組的PWT統(tǒng)計(jì)學(xué)下降。值為平均值±SEM。*P<0.05，***P<0.001，表示與載體組相比在相同時(shí)間點(diǎn)的顯著性，2因素ANOVA方差分析。第-2天、第-1天、第0天：n＝20/組；第1天：n＝5/組；第3天：n＝15/組；第7天：n＝10/組。從圖6中可以看出，小鼠在單次劑量的奧沙利鉑后產(chǎn)生機(jī)械性異常性疼痛。在第1、3和7天，奧沙利鉑組的PWT統(tǒng)計(jì)學(xué)下降。值為平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，表示與載體組相比在相同時(shí)間點(diǎn)的顯著性，雙因素ANOVA方差分析。第-2天，第-1天，第0天：n＝20/組；第1天：n＝5/組；第3天：n＝15/組；第7天：n＝10/組。從圖7(大鼠)和圖8(小鼠)可以看出，在奧沙利鉑治療后第1天，在大鼠左坐骨神經(jīng)中，奧沙利鉑治療后CXCR2和NPYmRNA的表達(dá)譜顯著升高，但在小鼠中不明顯。在兩種物種中在奧沙利鉑治療后，左側(cè)坐骨神經(jīng)中的奧沙利鉑治療后CXCL1mRNA的表達(dá)譜沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從圖7可以看出，在左側(cè)坐骨神經(jīng)中，CXCR2及其配體CXCL1mRNA在注射奧沙利鉑后的早期(第1天)高度增加，如同NPYmRNA。值顯示為平均值。#表示在同一時(shí)間點(diǎn)奧沙利鉑和載體組之間的顯著性差異，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n＝10，通過(guò)貝葉斯后驗(yàn)概率>0.95評(píng)估。從圖8可以看出，在左側(cè)坐骨神經(jīng)中，在奧沙利鉑注射后7天內(nèi)，CXCR2或其配體CXCL1mRNA和NPYmRNA都不顯著增加。值顯示為平均值。#表示在同一時(shí)間點(diǎn)奧沙利鉑和載體組之間的顯著性差異，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n＝10，通過(guò)貝葉斯后驗(yàn)概率>0.95評(píng)估?？偨Y(jié)：在單次奧沙利鉑給藥后，大鼠和小鼠都出現(xiàn)出穩(wěn)健的機(jī)械性異常性疼痛。然而，CXCR2和NPYmRNA表達(dá)(在左坐骨神經(jīng)中增加)的早期統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著變化僅在大鼠中明顯。因此，選擇大鼠作為主要物種，其能夠探索藥理學(xué)抑制CXCR2受體對(duì)奧沙利鉑誘導(dǎo)的機(jī)械性異常性疼痛的作用。i)臨床前CXCR2拮抗劑對(duì)奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性感覺損傷大鼠的作用動(dòng)物：將60只成年雄性Sprague-Dawley大鼠(CharlesRiver，UK。230-300g)用于本研究。將動(dòng)物在恒定溫度和濕度(溫度：21±1℃，光:暗周期為12:12小時(shí))的受控環(huán)境中以3至5只每組飼養(yǎng)在有機(jī)玻璃籠中，隨意獲得食物和水。在開始實(shí)驗(yàn)前，允許它們從運(yùn)輸中恢復(fù)至少一周。通過(guò)濕磨法制備式(A)化合物的0.5mg/ml、2mg/ml和5mg/ml混懸液(分別針對(duì)5mg/kg，20mg/kg和50mg/kg給藥)，然后在1％甲基纖維素(MC)中超聲處理。每周制備制劑，并在避光保存于4℃。給藥體積為10ml/kg。在整個(gè)給藥期間連續(xù)攪拌化合物。在水中制備1％(1g/100ml水)的甲基纖維素(Sigma)，并置于攪拌器上直至完全溶解。載體處理的動(dòng)物以每日兩次(b.i.d.)給藥1％MC，10ml/kgp.o。通過(guò)在5％葡萄糖(Baxter)中超聲處理制備作為2mg/ml溶液(針對(duì)12mg/kg)的奧沙利鉑(Tocrisbioscience)。制劑在給藥當(dāng)天新鮮制備。給藥體積為6ml/kg。研究方案：研究方案示于表1中。在第0天注射一次奧沙利鉑，從第-1天至第6天每日兩次給予三個(gè)劑量的式(A)化合物。在第-2天、第-1天、第0天、第3天和第7天測(cè)試PWT。表1研究以下5組：誘導(dǎo)化療誘發(fā)的神經(jīng)?。阂?ml/kg的體積以12mg/kg腹膜內(nèi)(i.p.)注射單劑量的奧沙利鉑。在使用前將奧沙利鉑溶于5％葡萄糖中至2mg/ml。使用施加到后爪上的一系列漸變的vonFrey纖毛以引發(fā)縮足反應(yīng)(PWT，參見下文)來(lái)監(jiān)測(cè)神經(jīng)性疼痛的出現(xiàn)(其特征在于顯著的機(jī)械性異常性疼痛)，。載體對(duì)照組接受腹膜內(nèi)6ml/kg的5％葡萄糖溶液。以相同的測(cè)試順序注射動(dòng)物。在試驗(yàn)前將動(dòng)物置于凸起的金屬網(wǎng)上的單獨(dú)有機(jī)玻璃盒中至少40分鐘。從最小力(約1g)的細(xì)絲開始，將每根細(xì)絲垂直地施加到爪的腹側(cè)表面的中心，直到輕微彎曲，保持6秒。如果動(dòng)物在刺激時(shí)縮回或抬起爪子，則使用具有稍稍低于測(cè)試的力的纖毛。如果沒有觀察到反應(yīng)，則測(cè)試具有稍微更高的力的纖毛。將誘導(dǎo)可靠反應(yīng)所需的最小量的力(5次試驗(yàn)中3次為陽(yáng)性)記錄為PWT的值。在連續(xù)三天(第-2天，第-1天和第0天)評(píng)估PWT，并在施用單劑量的載體或奧沙利鉑之后在第3天和第7天重新評(píng)估，以監(jiān)測(cè)機(jī)械性異常性疼痛的出現(xiàn)。第-2天和第-1天是在給予奧沙利鉑之前的基線，第0天是在奧沙利鉑注射當(dāng)天的讀數(shù)。統(tǒng)計(jì)分析：通過(guò)雙因素重復(fù)量數(shù)ANOVA方差分析來(lái)分析行為數(shù)據(jù)，“治療”作為受試者之間的效應(yīng)，“天”作為受試者內(nèi)的效應(yīng)。事后分析使用計(jì)劃的成對(duì)比較進(jìn)行[InVivoStat；Clark等人，J.Psychopharmacology，26(8)1136-1142(2012)]。結(jié)果：注射奧沙利鉑導(dǎo)致機(jī)械性異常性疼痛的出現(xiàn)，其使用PWT的von-Frey評(píng)估測(cè)量。在奧沙利鉑之前用式(A)化合物(在第-1天開始)的預(yù)防性治療導(dǎo)致預(yù)防奧沙利鉑誘導(dǎo)的機(jī)械性異常性疼痛的出現(xiàn)。這在奧沙利鉑治療后第3天的所有劑量水平和在奧沙利鉑治療后第7天的20和50mg/kgbid的情況下是明顯的。如圖9所示，奧沙利鉑的推注導(dǎo)致明顯的機(jī)械性異常性疼痛的出現(xiàn)。在第3天和第7天，與Veh/Veh組相比，PWT顯著降低。預(yù)防性的式(A)化合物給藥抑制了通過(guò)奧沙利鉑治療建立的機(jī)械性異常性疼痛，PWT與Oxa/Veh組相比顯著增加。數(shù)值為平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001指示與Oxa/Veh組相比的顯著性，++p<0.01和+++p<0.001指示與Veh/Veh組相比的顯著性，2因素ANOVA方差分析。Oxa＝奧沙利鉑；Veh＝載體；5、20和50mpk＝式(A)化合物的劑量水平，以mg/kgbidpo?？偨Y(jié)：?jiǎn)未瓮谱W沙利鉑導(dǎo)致大鼠機(jī)械性異常性疼痛的出現(xiàn)。用式(A)化合物的預(yù)防性治療減輕了機(jī)械性異常性疼痛的出現(xiàn)。在第3天，與奧沙利鉑和載體組相比，式(A)化合物的所有三個(gè)劑量水平(5、20和50mg/kgp.o.b.i.d)都降低了機(jī)械異常性疼痛。到第7天，僅在以20和50mg/kgp.o.b.i.d接受式(A)化合物的動(dòng)物中仍然存在機(jī)械性異常性疼痛的穩(wěn)健降低。j)臨床前CXCR2拮抗劑對(duì)重復(fù)給藥奧沙利鉑誘導(dǎo)的感覺損傷大鼠的作用已經(jīng)確認(rèn)化療治療引起人和嚙齒類動(dòng)物中神經(jīng)的傳導(dǎo)潛能的顯著降低[Renn等人，Pain，26；7:29，(2011)]。因此，為了補(bǔ)充研究奧沙利鉑誘導(dǎo)的行為超敏性，進(jìn)行坐骨神經(jīng)的電生理研究以進(jìn)一步探測(cè)CXCR2機(jī)理參與人類經(jīng)歷的化療誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變的神經(jīng)生理學(xué)性質(zhì)。將雄性Sprague-Dawley大鼠(109-167g，周齡)在恒定溫度和濕度(溫度：25±3℃，光:暗周期為12:12小時(shí))的控制環(huán)境中以3只一組圈養(yǎng)在籠中，隨意獲得食物(25g/大鼠/天的LabDiet5053)和水?；衔镏苽洌簩⑹?A)化合物制備為在1％甲基纖維素(MC)(w/v)中的2mg/mL懸浮液。在水中制備1％(w/v)(1g/100mL水)的MC(Sigma目錄號(hào)423238)，并置于攪拌器上直至完全溶解。該制劑每6-8天制備一次，每次400-700mL，并在4℃避光儲(chǔ)存。所用的給藥體積為10mL/kg，得到20mg/kgp.o.劑量。載體處理的動(dòng)物以10mL/kgp.o每日兩次(b.i.d.)給藥1％MCw/v。將奧沙利鉑(Selleckchem)加入5％葡萄糖(SigmaAldrich)溶液中，超聲處理30分鐘直至溶解。在每次注射前制備新鮮溶液。對(duì)照載體動(dòng)物用5％w/v葡萄糖以5ml/kg處理。在milli-Q水中制備5％(w/v)(5g/100mL水)的葡萄糖(SigmaAldrichCat#G7021)，并置于攪拌器上直至完全溶解。使用無(wú)菌0.2μm過(guò)濾器(ThermoscientificCat#595-4520)過(guò)濾，并在室溫儲(chǔ)存。用SpragueDawley大鼠的治療方案：對(duì)雄性SpragueDawley大鼠每天用式(A)化合物(20mg/kgp.o.b.i.d.)或其載體(1％甲基纖維素10ml/kgp.o.b.i.d.)給藥4周(28天)，開始于第0天。每天早晨進(jìn)行一次給藥，隨后約8小時(shí)后在晚上進(jìn)行第二次給藥。在第一天用式(A)化合物預(yù)處理后二十四小時(shí)，在短暫的3％異氟烷(Abbott)麻醉下給動(dòng)物施用奧沙利鉑(4mg/kgi.p.)或其載體(葡萄糖溶液5％w/v：1ml/kgi.p.)。在早晨用式(A)化合物或載體預(yù)處理90分鐘后，用奧沙利鉑或其載體的這種治療每周重復(fù)兩次持續(xù)4周(在第1、3、8、10、15、17、22、24天)。因此，將大鼠隨機(jī)分配到以下組：體重跟蹤：在第1、3、9、11、16、18、23和25天，每周兩次測(cè)量大鼠的體重，持續(xù)4周。第5周的體重值表示當(dāng)進(jìn)行傳導(dǎo)速度研究時(shí)從第29、30和31天的每個(gè)組的組合數(shù)據(jù)。進(jìn)行這些研究的科學(xué)家不知道動(dòng)物接受的治療，直到所有數(shù)據(jù)分析完成。使用GraphpadPrism軟件分析數(shù)據(jù)。它們以平均值±SEM表示。通過(guò)雙因素ANOVA方差分析，隨后通過(guò)Dunnett檢驗(yàn)測(cè)定參數(shù)差異的統(tǒng)計(jì)顯著性。p值<0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的測(cè)量：在用式(A)的化合物或其載體治療4周后，在第29天至第31天之間在右坐骨神經(jīng)中測(cè)量神經(jīng)傳導(dǎo)速度。在這些天的每一天，平衡治療組，進(jìn)行這些研究的科學(xué)家不知道動(dòng)物接受的治療，直到所有數(shù)據(jù)分析完成。在測(cè)量傳導(dǎo)速度之后，收集大鼠的左坐骨神經(jīng)用于組織學(xué)研究(參見下面的方法)。用水合氯醛(350mg/kg，3.5mL/kg，腹膜內(nèi))麻醉大鼠。當(dāng)達(dá)到麻醉的手術(shù)深度時(shí)，小心暴露坐骨切口上方的肌肉和右后肢踝部。仔細(xì)鑒定右坐骨神經(jīng)，并通過(guò)放置在第二和第三手指之間的電極記錄動(dòng)作電位，如Jamieson等人，Br.J.Cancer,88(12):1942-7(2003)所述，以及在坐骨切口和踝處經(jīng)由鉑絲電極電刺激神經(jīng)(5V，0.5s，單波脈沖)，來(lái)測(cè)量傳導(dǎo)速度。測(cè)量坐骨切口和踝之間的長(zhǎng)度。使用具有CED1902mkIV可編程放大器/濾波器和DS2A-MK.II單獨(dú)刺激器-恒定電壓(CambridgeElectronicDesignLimited)的CEDMicro1401-3科學(xué)數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)記錄器記錄動(dòng)作電位，數(shù)據(jù)通過(guò)CEDSignal(Windows軟件版本6)(CambridgeElectronicDesignLimited)分析。神經(jīng)傳導(dǎo)速度被計(jì)算為坐骨切口和踝之間的長(zhǎng)度除以各刺激位點(diǎn)處的時(shí)間潛伏期之間的差異[潛伏期(坐骨切口)–潛伏期(踝)]。使用GraphpadPrism軟件分析數(shù)據(jù)。它們以平均值±SEM表示。通過(guò)單因素ANOVA，隨后通過(guò)Tukey檢驗(yàn)測(cè)定參數(shù)差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。p值<0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。坐骨神經(jīng)的組織學(xué)評(píng)估：在傳導(dǎo)速度的測(cè)量之后，收集大鼠的左坐骨神經(jīng)用于組織學(xué)研究。進(jìn)行這些研究的科學(xué)家不知道動(dòng)物接受的治療，直到所有數(shù)據(jù)分析完成。定位并小心地切除左坐骨神經(jīng)(遠(yuǎn)端)的1cm部分。將神經(jīng)在4％多聚甲醛(SigmaAldrich目錄號(hào)：P6148)中固定過(guò)夜，然后用0.2％甘氨酸(SigmaAldrich目錄號(hào)：15527)固定過(guò)夜。用磷酸鹽緩沖鹽水[磷酸二氫鈉(SigmaAldrich目錄號(hào)：04270)]；磷酸氫二鈉(SigmaAldrich目錄號(hào)：30427)；氯化鈉(BDH目錄號(hào)：7647-14-5)]洗滌后，將坐骨神經(jīng)在2％四氧化鋨中后固定2小時(shí)。在從30％至70％乙醇脫水后，將神經(jīng)樣品包埋在石蠟中，將神經(jīng)切成2μm厚度的切片(使用Leica切片機(jī))，安裝在載玻片(SuperiorMaerienfeld)上，并在58℃風(fēng)干。然后將切片浸入100％二甲苯(BDH；CAS號(hào)1330-20-7)中，隨后用100％至70％乙醇(Merck；CAS號(hào)：64-17-5)，然后用100％Milli-Q水再水合。然后將神經(jīng)在1％甲苯胺藍(lán)中染色，并在用水和75％乙醇洗滌后，用蓋玻片固定載玻片。選擇第一清晰和完整的神經(jīng)部分用于分析。使用自動(dòng)立式復(fù)合顯微鏡(LeicaDM6000B)捕獲圖像。使用INCellAnalyzer6000(GEHealthcare)自動(dòng)測(cè)量坐骨神經(jīng)(包括髓鞘)的神經(jīng)纖維的內(nèi)部的橫截面積和整體面積，如DiCesareMannelli等人，J.Pain，14(12)：1585-600(2013)中所述。然后計(jì)算坐骨神經(jīng)的神經(jīng)纖維的內(nèi)部面積與整體面積的比率作為神經(jīng)的髓鞘的厚度的指示。使用GraphpadPrism軟件分析數(shù)據(jù)。它們以平均值±SEM表示。通過(guò)單因素ANOVA方差分析，隨后通過(guò)Tukey檢驗(yàn)測(cè)定參數(shù)差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。p值<0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。結(jié)果：使用慢性大鼠CIPN模型，檢查體重、坐骨神經(jīng)髓鞘的傳導(dǎo)速度和厚度。在第29天、第30天和第31天測(cè)量神經(jīng)傳導(dǎo)速度。在第29、30或31天之間的每個(gè)治療組中未觀察到傳導(dǎo)速度的差異。相比載體-處理的對(duì)照(40.28±1.30m/s)，奧沙利鉑治療的大鼠顯示出在坐骨切口和腳踝之間顯著更低的傳導(dǎo)速度(35.99±0.59m/s)(p<0.05)。式(A)化合物治療顯著地防止大鼠中奧沙利鉑誘導(dǎo)的傳導(dǎo)速度降低(40.83±1.45m/s)(p<0.05)(圖10)。在載體/奧沙利鉑處理的和式(A)的化合物/奧沙利鉑處理的組之間沒有觀察到體重的顯著性差異(圖11)。使用組織學(xué)染色研究式(A)化合物對(duì)坐骨神經(jīng)髓鞘厚度的影響。來(lái)自所有組的神經(jīng)纖維的代表性橫截面顯示在圖12中。對(duì)神經(jīng)的髓鞘的厚度進(jìn)行定量。從圖13，與載體對(duì)照(0.13±0.01)相比，經(jīng)奧沙利鉑處理的大鼠顯示出髓鞘的顯著變薄(由更高的神經(jīng)纖維的內(nèi)部面積/整體面積的比例指示(0.23±0.02))(p<0.001)。與載體/奧沙利鉑處理相比，向經(jīng)奧沙利鉑處理的大鼠口服施用式(A)化合物顯示出坐骨神經(jīng)的髓鞘厚度增加，如通過(guò)較低的神經(jīng)纖維的內(nèi)部面積/整體面積比例指示(0.17±0.01)(p<0.05)。因此，用式(A)化合物的預(yù)防性治療抑制了由奧沙利鉑治療誘導(dǎo)的坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度受損。圖10：值是平均值±SEM。*P<0.05表示載體/奧沙利鉑與載體/載體組相比的顯著性，#p<0.05表示式(A)的化合物/奧沙利鉑與載體/奧沙利鉑組相比的顯著性，單因素ANOVA方差分析。載體/載體，n＝13；載體/奧沙利鉑，n＝12；式(A)的化合物/奧沙利鉑，n＝12。在圖11中顯示，式(A)的化合物不影響奧沙利鉑誘導(dǎo)的體重變化。在2周時(shí)間點(diǎn)，在載體/載體和載體/奧沙利鉑治療組之間觀察到體重的顯著性差異。每周兩次測(cè)量體重，持續(xù)4周。第5周的體重值表示當(dāng)進(jìn)行傳導(dǎo)速度研究時(shí)從第29、30和31天的每個(gè)組的組合數(shù)據(jù)。在研究的任何時(shí)間點(diǎn)，載體/奧沙利鉑和式(A)化合物/奧沙利鉑治療組之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異。數(shù)值為平均值±SEM。***p<0.001指示與載體/奧沙利鉑相比載體/載體的顯著性，###p<0.001指示與化合物D/奧沙利鉑處理的大鼠相比載體/載體的顯著性；雙因素ANOVA方差分析，然后是Dunnett檢驗(yàn)，n＝13(載體/載體)，n＝12(載體/奧沙利鉑)，n＝12(化合物D/奧沙利鉑)。圖12和13顯示式(A)的化合物防止奧沙利鉑使坐骨神經(jīng)的髓鞘厚度減小。圖12示出了使用光學(xué)顯微鏡在40x放大率下拍攝的來(lái)自每組的圖像。圖13圖示了神經(jīng)纖維的髓鞘的厚度。評(píng)價(jià)內(nèi)神經(jīng)纖維的橫截面積與坐骨神經(jīng)整個(gè)神經(jīng)纖維(包括髓鞘)的總橫截面積的比率。奧沙利鉑減少大鼠坐骨神經(jīng)的髓鞘的厚度，通過(guò)用式(A)的化合物處理逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)。數(shù)值為平均值±SEM。***p<0.001指示與載體/載體組相比的載體/奧沙利鉑的顯著性，#p<0.05指示與載體/奧沙利鉑處理的大鼠相比的化合物D/奧沙利鉑的顯著性；單因素ANOVA方差分析隨后是Tukey檢驗(yàn)，n＝12(載體/載體)，n＝12(載體/奧沙利鉑)，n＝12(式(A)的化合物/奧沙利鉑)。總結(jié)：奧沙利鉑誘導(dǎo)大鼠的周圍神經(jīng)病變，通過(guò)神經(jīng)傳導(dǎo)速度和神經(jīng)髓鞘的厚度的降低評(píng)估。用式(A)化合物的預(yù)處理防止了奧沙利鉑治療的大鼠中坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的降低，但不影響奧沙利鉑治療誘導(dǎo)的體重減少。式(A)的化合物還改善由奧沙利鉑誘導(dǎo)的坐骨神經(jīng)的髓鞘的變化。這些研究的結(jié)果表明，式(A)化合物防止在大鼠中奧沙利鉑誘導(dǎo)的行為特征的變化(該行為特征為對(duì)機(jī)械刺激的超敏反應(yīng))、坐骨神經(jīng)的髓鞘狀態(tài)和神經(jīng)傳導(dǎo)速度的減慢。這些是患者中化療誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變的特征。k)機(jī)理臨床研究的證明打算進(jìn)行機(jī)理臨床研究的證明以進(jìn)一步證明式(A)化合物在治療人類患者的CIPN中的作用。可能的研究設(shè)計(jì)如下：臨床研究設(shè)計(jì)將是：雙盲、安慰劑對(duì)照的平行組，機(jī)理研究證據(jù)在患有結(jié)腸直腸癌的患者中，計(jì)劃由含奧沙利鉑的化療治療開始。該項(xiàng)目的概況可能包括受試者每?jī)芍艹鱿拱┗煹呐R床中心。在每次奧沙利鉑給藥之前，將根據(jù)臨床中心程序進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查。指示受試者在奧沙利鉑iv輸注前兩天開始服用式(A)化合物。在前六次奧沙利鉑輸注期間，將指導(dǎo)合格的受試者每天一次在早晨服用一劑的式(A)化合物(x片劑xmg或安慰劑)，持續(xù)7天。設(shè)計(jì)式(A)化合物的給藥方案以在奧沙利鉑的全身峰值期間實(shí)現(xiàn)CXCR2拮抗劑最大效應(yīng)。在該第一研究中，間歇給藥將通過(guò)延長(zhǎng)與奧沙利鉑的共同給藥來(lái)最大化治療功效并最小化任何副作用的可能性。在第六周期結(jié)束后，受試者將停止用式(A)化合物或安慰劑的治療，并將繼續(xù)臨床上合適的化療方案。在前7個(gè)化療周期期間，在臨床中心時(shí)，評(píng)估將包括安全性、耐受性和藥代動(dòng)力學(xué)。在基線和在第1、3、5、6和7周期的奧沙利鉑輸注后24-48小時(shí)之間進(jìn)行關(guān)于神經(jīng)興奮性概況的臨床評(píng)估和主要電生理學(xué)測(cè)量。對(duì)臨床中心的所有隨訪將包括使用NCI-CTCv4和總神經(jīng)病評(píng)分和亞組[TNSc；CavalettiG.F.B.，J.Peripher.Nerv.Syst.，Sep.，12(3)，210-5(2007)；CornblathDR，Neurology，53(8)，1660(1999)]的臨床評(píng)估。將根據(jù)護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)測(cè)腫瘤學(xué)措施。主要措施包括：·測(cè)量的感覺興奮性(超興奮性％)的變化，其作為化療周期1的給藥前和在最后的式(A)的化合物/安慰劑給藥后的化療周期前的差異。式(A)化合物的安全性：監(jiān)測(cè)不良事件、臨床體征、安全實(shí)驗(yàn)室和生命體征。·式(A)的化合物的PK。式(D)化合物：1-(4-氯-3-((1,4-二甲基哌啶-4-基)磺酰基)-2-羥基苯基)-3-(2-氯-3-氟苯基)脲三氟乙酸鹽向6-氨基-3-氯-2-[(1,4-二甲基-4-哌啶基)磺?；鵠苯酚二鹽酸鹽(中間體D1)(0.30g)在1,4-二噁烷(10mL)和水(1mL)中的溶液中添加NaHCO3(0.193g)。將混合物在室溫?cái)嚢?0分鐘。然后添加2-氯-1-氟-3-異氰酸酯基苯(0.131g)。攪拌再持續(xù)10分鐘。然后，該反應(yīng)混合物用水(50mL)稀釋，用EA(2×50mL)萃取。該溶液然后用鹽水洗滌，用無(wú)水Na2SO4干燥且通過(guò)MDAP純化以得到標(biāo)題產(chǎn)物(130mg)。中間體D1：6-氨基-3-氯-2-((1,4-二甲基哌啶-4-基)磺?；?苯酚二鹽酸鹽步驟1：在-78℃向4-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(0.35g)(中間體D2)在四氫呋喃(THF)(25mL)中的溶液中添加正丁基鋰(0.383mL，2.0M在環(huán)己烷中)。將混合物在-78℃攪拌1h。然后添加MeI(0.048mL)。攪拌在-78℃持續(xù)4h。然后，該反應(yīng)用NH4Cl水溶液淬滅，用EA萃取(2×50mL)。該溶液然后用鹽水洗滌，用無(wú)水Na2SO4干燥，且濃縮以得到4-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺?；?-4-甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯(0.4g)。步驟2：向4-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺?；?-4-甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯(0.35g)在二氯甲烷(DCM)(20mL)中的溶液中添加TFA(0.572mL)。將混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。所得溶液真空濃縮以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((4-甲基哌啶-4-基)磺酰基)苯并[d]噁唑三氟乙酸鹽(0.35g)。步驟3：向2-(叔丁基)-6-氯-7-((4-甲基哌啶-4-基)磺酰基)苯并[d]噁唑三氟乙酸鹽(0.35g)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(10mL)中的溶液中添加AcOH(0.054mL)和甲醛(0.788mL)。然后將反應(yīng)混合物冷卻至0℃且攪拌10分鐘。然后分批添加三乙酰氧基硼氫化鈉(0.6g)。反應(yīng)完成后，將混合物用飽和NaHCO3(20mL)水溶液淬滅且用EA萃取(2×50mL)。該溶液然后用鹽水洗滌，用無(wú)水Na2SO4干燥，且濃縮以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((1,4-二甲基哌啶-4-基)磺酰基)苯并[d]噁唑(0.3g)。步驟4：向2-(叔丁基)-6-氯-7-((1,4-二甲基哌啶-4-基)磺酰基)苯并[d]噁唑(0.3g)在1,4-二噁烷(10mL)和水(10mL)中的溶液中添加HCl(0.640mL，37％在水中)。將混合物在120℃加熱3小時(shí)。然后，所得溶液真空濃縮以得到標(biāo)題產(chǎn)物(0.3g)，將其用于下一步而不用進(jìn)一步純化。中間體D2：4-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺?；?哌啶-1-甲酸叔丁酯步驟1：向4-羥基哌啶-1-甲酸叔丁酯(10.0g)在DCM(100mL)中的溶液中添加TEA(13.9mL)，然后在冰浴中添加MsCl(4.7mL)。將混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。添加水(100mL)。分離有機(jī)層，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾且濃縮以得到4-((甲基磺?；?氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(13.9g)，其為白色固體。MS(ES+)m/z302(MNa+)。步驟2：向2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7硫醇鈉(12.0g)和4-((甲基磺?；?氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(13.9g)在DMF(100mL)中的溶液中添加碳酸鉀(6.3g)。將混合物在80℃攪拌2小時(shí)。添加EA(200mL)。有機(jī)相用鹽水洗滌(4×200mL)。合并的有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過(guò)濾且濃縮以得到4-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)硫基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(19.3g)，其為黃色油狀物。MS(ES+)m/z369(M-t-Bu+H+H+)。步驟3：在0℃向4-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)硫基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(19.3g)在DCM(50mL)中的溶液中添加mCPBA(20.4g)。在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜后，將混合物用NaHCO3水溶液和Na2S2O3水溶液淬滅，然后用EA萃取(2×150mL)。將合并的有機(jī)層洗滌，干燥且濃縮。粗物質(zhì)通過(guò)在甲醇/H2O中重結(jié)晶純化以得到4-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺?；?哌啶-1-甲酸叔丁酯(14.0g)。MS(ES+)m/z479(MNa+)。式(E)化合物：(R)-1-(4-氯-2-羥基-3-((4-甲基四氫-2H-吡喃-4-基)磺?；?苯基)-3-(2-氯環(huán)戊-2-烯-1-基)脲向6-氨基-3-氯-2-((4-甲基四氫-2H-吡喃-4-基)磺?；?苯酚鹽酸鹽(50mg)(中間體E1)在吡啶(5mL)中的溶液中添加新鮮的(R)-1-氯-5-異氰酸酯基環(huán)戊-1-烯(中間體E2，0.03M在甲苯中，5mL)且所得混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。將混合物用乙醇(5mL)淬滅且在減壓下濃縮。殘余物用MDAP純化(堿性條件)以得到標(biāo)題化合物(34mg)；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm10.36(br.s.，1H)，8.39(d，J＝8.8Hz，1H)，8.20(s，1H)，7.35(d，J＝8.8Hz，1H)，7.13(d，J＝9.0Hz，1H)，5.96-6.02(m，1H)，4.69-4.80(m，1H)，3.84(dd，J＝11.7，4.4Hz，2H)，3.49(t，J＝11.2Hz，2H)，2.22-2.46(m，3H)，2.04(td，J＝12.5，5.1Hz，2H)，1.61-1.74(m，1H)，1.58-1.61(m，1H)，1.54-1.58(m，1H)，1.50(s，3H)；MS(ES+)m/z449(MH+)。中間體E1：6-氨基-3-氯-2-((4-甲基四氫-2H-吡喃-4-基)磺?；?苯酚鹽酸鹽步驟1：向四氫-2H-吡喃-4-醇(10.0g)在DCM(200mL)中的溶液中添加TEA(12.9g)和甲烷磺酰氯(11.3g)。將混合物在0℃攪拌1小時(shí)，然后用H2O洗滌。有機(jī)層用Na2SO4干燥且濃縮以得到四氫-2H-吡喃-4-基甲磺酸酯(15.5g)。步驟2：向2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-硫醇(18.0g)和Cs2CO3(12.1g)在乙腈(5mL)中的溶液中添加四氫-2H-吡喃-4-基甲磺酸酯(14.8g)。將混合物在90℃攪拌16小時(shí)。冷卻至室溫后，將混合物濃縮。殘余物在EA(100mL)和H2O(100mL)之間分配。將有機(jī)層干燥且濃縮以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((四氫-2H-吡喃-4-基)硫基)苯并[d]噁唑(24.0g)。MS(ES+)m/z326(MH+)。步驟3：向2-(叔丁基)-6-氯-7-((四氫-2H-吡喃-4-基)硫基)苯并[d]噁唑(24.0g)在DCM(1000mL)中的溶液中添加mCPBA(31.8g)。將混合物在15℃攪拌2小時(shí)，然后用Na2SO3水溶液淬滅。將pH調(diào)節(jié)至～7。將有機(jī)層干燥且濃縮以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((四氫-2H-吡喃-4-基)磺?；?苯并[d]噁唑(18.0g)。步驟4：在-78℃在氮?dú)夥障?-(叔丁基)-6-氯-7-((四氫-2H-吡喃-4-基)磺?；?苯并[d]噁唑(5.0g)在THF(50mL)中的溶液中添加BuLi(2.5M在己烷中，6.2mL)。將混合物在-78℃攪拌45分鐘。添加MeI(2.2g)。將反應(yīng)混合物在-78℃攪拌1小時(shí)，然后用NH4Cl水溶液淬滅。將有機(jī)層干燥且濃縮。殘余物通過(guò)柱色譜法純化以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((4-甲基四氫-2H-吡喃-4-基)磺?；?苯并[d]噁唑(4.8g)。MS(ES+)m/z372(MH+)。步驟5：向2-(叔丁基)-6-氯-7-((4-甲基四氫-2H-吡喃-4-基)磺酰基)苯并[d]噁唑(1.0g)在1,4-二噁烷(10mL)中的溶液中添加HCl水溶液(37％，10mL)。在110℃回流4小時(shí)后，將混合物濃縮以得到標(biāo)題化合物(1.0g)，其為灰色固體。MS(ES+)m/z306(MH+)。中間體E2：(R)-1-氯-5-異氰酸酯基環(huán)戊-1-烯步驟1：向環(huán)戊-2-烯酮(1.2g)在甲醇(10mL)中的溶液中添加過(guò)氧化氫溶液(30％，0.5g)。所得混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。添加冷卻水(30mL)且所得混合物用飽和NaHCO3溶液中和。水層用DCM萃取(2×100mL)。合并的有機(jī)層用Na2SO4干燥，過(guò)濾且真空濃縮以得到6-氧雜雙環(huán)[3.1.0]己-2-酮(1.3g)，其為黃色油狀物。步驟2：向6-氧雜雙環(huán)[3.1.0]己-2-酮(25g)在甲醇(10mL)和水(3mL)中的溶液中添加氯化鈰(III)七水合物(95g)。所得混合物在70℃攪拌1小時(shí)。添加冷卻水(30mL)且所得混合物用飽和NaHCO3溶液中和。水層用DCM萃取(2×100mL)。合并的有機(jī)層用Na2SO4干燥，過(guò)濾且真空濃縮以得到2-氯環(huán)戊-2-烯酮(29g)，其為黃色油狀物。步驟3：向2-氯環(huán)戊-2-烯酮(600mg)在甲醇(20mL)中的溶液中添加氯化鈰(III)七水合物(1918mg)和NaBH4(195mg)。所得混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。添加冷水(30mL)且所得混合物用飽和NaHCO3溶液中和。水層用DCM萃取(2×100mL)。合并的有機(jī)層用Na2SO4干燥，過(guò)濾且真空濃縮以得到2-氯環(huán)戊-2-烯醇(400mg)，其為黃色油狀物。步驟4：在0℃向2-氯環(huán)戊-2-烯醇(20.0g)和異二氫吲哚-1,3-二酮(37.2g)在THF(200mL)中的溶液中添加Ph3P(66.4g)和DIAD(49.2mL)。將混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。將溶劑真空去除且殘余物通過(guò)柱色譜法純化(用PE:EA＝10:1洗脫)以得到2-(2-氯環(huán)戊-2-烯-1-基)異二氫吲哚-1,3-二酮(18.0g)，其為黃色固體。MS(ES+)m/z248(MH+)。步驟5：2-(2-氯環(huán)戊-2-烯-1-基)異二氫吲哚-1,3-二酮(14g)通過(guò)SFC純化以得到(R)-2-(2-氯環(huán)戊-2-烯-1-基)異二氫吲哚-1,3-二酮(5.0g)，其為白色固體，和(S)-2-(2-氯環(huán)戊-2-烯-1-基)異二氫吲哚-1,3-二酮(5.5g)，其為黃色油狀物。(R)-2-(2-氯環(huán)戊-2-烯-1-基)異二氫吲哚-1,3-二酮：手性HPLC(柱：AD-H(250*4.6mm，5um)；流動(dòng)相：MeOH/CO2＝15％；流速：3.0ml/min；溫度：40℃)：tR＝2.54分鐘，ee％＝100％；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm7.74-7.98(m，4H)，6.04(d，J＝2.2Hz，1H)，5.32(dd，J＝9.3，1.9Hz，1H)，2.77(ddd，J＝9.4，8.0，3.0Hz，1H)，2.41-2.62(m，2H)，2.22-2.39(m，1H)；(S)-2-(2-氯環(huán)戊-2-烯-1-基)異二氫吲哚-1,3-二酮：手性HPLC(柱：AD-H(250*4.6mm，5um)；流動(dòng)相：MeOH/CO2＝15％；流速：3.0ml/min；溫度：40℃)：tR＝3.04分鐘，ee％＝100％；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm7.32-8.36(m，4H)，6.03(d，J＝2.2Hz，1H)，5.31(dd，J＝9.3，1.8Hz，1H)，2.77(ddd，J＝9.4，8.0，3.0Hz，1H)，2.40-2.64(m，2H)，2.32(ddd，J＝14.2，8.7，3.8Hz，1H)。步驟6：向(R)-2-(2-氯環(huán)戊-2-烯-1-基)異二氫吲哚-1,3-二酮(3.5g)在乙醇(100mL)中的溶液中添加肼.H2O(0.7mL)?；亓?小時(shí)后，將反應(yīng)混合物冷卻至室溫。將沉淀過(guò)濾且用EtOH(10mL)沖洗。將濾液濃縮以去除一半溶劑。向溶液添加醚中的HCl(1M，20mL)且濃縮以得到(R)-2-氯環(huán)戊-2-烯胺的鹽酸鹽(2.0g)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm8.53(s，3H)，6.22(s，1H)，4.19(d，J＝5.8Hz，1H)，2.49-2.54(m，1H)，2.26-2.45(m，2H)，1.90-2.04(m，1H)。步驟7：向(R)-2-氯環(huán)戊-2-烯胺鹽酸鹽(600mg)在甲苯(15mL)中的溶液中添加碳酸二(三氯甲基)酯(694mg)。將混合物在120℃攪拌4小時(shí)。混合物然后冷卻至室溫以得到(R)-1-氯-5-異氰酸酯基環(huán)戊-1-烯的甲苯溶液。該溶液應(yīng)每次新鮮合成。式(F)的化合物：(R)-1-(3-(叔丁基磺酰基)-4-氰基-2-羥基苯基)-3-(2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲向4-氨基-2-(叔丁基磺?；?-3-羥基芐腈(中間體F1，450mg)在吡啶(20mL)中的溶液中添加新鮮的在甲苯(20mL)中的(R)-5-異氰酸酯基-1-甲基環(huán)戊-1-烯(中間體F2，327mg)。將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。將混合物用水(5mL)淬滅且濃縮。殘余物用MDAP純化(酸性條件)以得到(R)-1-(3-(叔丁基磺?；?-4-氰基-2-羥基苯基)-3-(2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲(120mg)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm10.13(br.s.，1H)，8.51-8.64(m，2H)，7.60(d，J＝8.6Hz，1H)，7.34(d，J＝8.3Hz，1H)，5.52(s，1H)，4.54(d，J＝6.8Hz，1H)，2.11-2.37(m，3H)，1.66(s，3H)，1.46-1.60(m，1H)，1.30-1.46(m，9H)；MS(ES+)m/z378(MH+)。中間體F1：4-氨基-2-(叔丁基磺酰基)-3-羥基芐腈步驟1：該反應(yīng)以五批次進(jìn)行(各600mg)微波合成，然后組合純化：將2-(叔丁基)-7-(叔丁基磺?；?-6-氯苯并[d]噁唑(中間體F3，0.6g)和氰化銅(I)(1.6g)在NMP(4mL)中的混合物在180℃在微波中攪拌90分鐘。冷卻后，合并5個(gè)批次，且用EA(100mL)和水(100mL)稀釋。過(guò)濾后，分離有機(jī)層，洗滌，干燥，過(guò)濾且濃縮。殘余物通過(guò)柱色譜法純化(用PE:EA＝1:0至7:3洗脫)以得到2-(叔丁基)-7-(叔丁基磺酰基)苯并[d]噁唑-6-甲腈(1.0g)。MS(ES+)m/z321(MH+)。步驟2：向2-(叔丁基)-7-(叔丁基磺酰基)苯并[d]噁唑-6-甲腈(1.0g)在乙醇(25mL)和水(25mL)中的溶液中添加氫氧化鈉(0.3g)。所得混合物在60℃攪拌1小時(shí)，然后在減壓下濃縮。殘余物用水(50mL)稀釋，用檸檬酸水溶液酸化至pH＝6，且用EA萃取(2×50mL)。將合并的有機(jī)層洗滌，干燥，過(guò)濾且濃縮以得到N-(3-(叔丁基磺?；?-4-氰基-2-羥基苯基)特戊酰胺(1.1g)。MS(ES+)m/z361(MH+)。步驟3：向N-(3-(叔丁基磺酰基)-4-氰基-2-羥基苯基)特戊酰胺(1.2g)在THF(30mL)中的溶液中添加DMAP(0.04g)和Boc2O(1.6mL)。將混合物在60℃攪拌2小時(shí)。向混合物添加肼.H2O(1.6mL)。所得混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，用水(50mL)稀釋，且用EA萃取(2×100mL)。將合并的有機(jī)層洗滌，干燥，過(guò)濾且濃縮。殘余物通過(guò)柱色譜法純化(用PE:EA＝1:0至7:3洗脫)以得到(3-(叔丁基磺酰基)-4-氰基-2-羥基苯基)氨基甲酸叔丁酯(1.2g)。MS(ES+)m/z355(MH+)。步驟4：向(3-(叔丁基磺?；?-4-氰基-2-羥基苯基)氨基甲酸叔丁酯(1.2g)在DCM(25mL)中的溶液中添加TFA(2.6mL)。所得混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。去除DCM。殘余物用NaHCO3水溶液(pH＝8)堿化，且用EA萃取(2×50mL)。將合并的有機(jī)層洗滌，干燥，過(guò)濾且濃縮以得到標(biāo)題化合物(0.8g)。MS(ES+)m/z255(MH+)。中間體F2：(R)-5-異氰酸酯基-1-甲基環(huán)戊-1-烯步驟1：將2-甲基環(huán)戊烷-1,3-二酮(27.0g)、2-甲基丙-1-醇(62.5g)和TsOH(4.6g)在苯(500mL)中的溶液加熱至回流過(guò)夜。將溶劑真空去除且殘余物真空蒸餾以得到3-異丁氧基-2-甲基環(huán)戊-2-烯酮(34.5g)，其為黃色油狀物。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm3.92(d，J＝6.6Hz，2H)，2.53-2.70(m，2H)，2.32-2.52(m，2H)，2.04(dp，J＝13.3，6.7Hz，1H)，1.64(t，J＝1.5Hz，3H)，1.01(d，J＝6.7Hz，6H)；MS(ES+)m/z169(MH+)。步驟2：在0℃向3-異丁氧基-2-甲基環(huán)戊-2-烯酮(34.5g)在DCM(300mL)中的溶液中滴加DIBAL-H(1M在己烷中，250mL)。將反應(yīng)混合物在該溫度攪拌90分鐘。該反應(yīng)用水淬滅，然后在DCM(200mL)和HCl溶液(1M，100mL)之間分配。水層用DCM萃取(2×200mL)。合并的有機(jī)層用飽和碳酸氫鈉溶液(100mL)、鹽水(200mL)洗滌，用Na2SO4干燥，過(guò)濾且真空濃縮以得到2-甲基環(huán)戊-2-烯醇和2-甲基環(huán)戊-2-烯酮(27.0g)的混合物，其為黃色油狀物。步驟3：將2-甲基環(huán)戊-2-烯醇(27.0g)和氧化錳(IV)(5.0g)在乙醚(200mL)中的混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。將混合物過(guò)濾且濾液真空濃縮。殘余物真空蒸餾以得到2-甲基環(huán)戊-2-烯酮(16.5g)，其為無(wú)色油狀物。步驟4：向(R)-1-甲基-3,3-二苯基六氫吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧雜氮雜硼雜環(huán)戊烯(oxazaborole)(1M在甲苯中，31.8mL)在無(wú)水THF(20mL)中的溶液中小心添加2-甲基環(huán)戊-2-烯酮(15.3g)和BH3(1M在THF中，111mL)。將混合物攪拌1小時(shí)。添加甲醇(150ml)且所得混合物用鹽水稀釋。水層用DCM萃取(2×200mL)。合并的有機(jī)層用Na2SO4干燥，過(guò)濾且真空濃縮以得到(S)-2-甲基環(huán)戊-2-烯醇(ee％未知，16.0g)，其為黃色油狀物。步驟5：在N2下向(S)-2-甲基環(huán)戊-2-烯醇(16.0g)和異二氫吲哚-1,3-二酮(36.0g)在THF(240mL)中的溶液中添加三苯基膦(77.0g)。將混合物冷卻至0℃。將二異丙基偶氮二甲酸酯(63.4mL)滴加至混合物。攪拌30分鐘后，將混合物在0℃攪拌過(guò)夜。去除溶劑且殘余物通過(guò)柱色譜法純化(用PE:EA＝10:1洗脫)以得到粗產(chǎn)物，其通過(guò)SFC純化以得到(R)-2-(2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)異二氫吲哚-1,3-二酮(10.6g，>98％ee)，其為白色固體。手性HPLC(柱：AD-H，4.6*250mm，5μm，MeOH/CO2＝10％，柱溫度：40℃，CO2流速：2.7mL/min)：tR＝2.17分鐘，ee％：>98％；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm7.83(dd，J＝5.4，3.1Hz，2H)，7.76-7.61(m，2H)，5.68(s，1H)，5.21(d，J＝7.4Hz，1H)，2.69(dd，J＝5.7，3.5Hz，1H)，2.42-2.30(m，2H)，2.22-2.12(m，1H)，1.61(s，3H)；MS(ES+)m/z228(MH+)。步驟6：向(R)-2-(2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)異二氫吲哚-1,3-二酮(10.7g)在乙醇(150mL)中的溶液中添加肼.H2O(3.0mL)。回流3小時(shí)后，將反應(yīng)混合物冷卻至室溫。將沉淀過(guò)濾且濾餅用EtOH(10mL)沖洗。向該濾液添加二噁烷中的HCl(4M，5mL)且將混合物濃縮。所得殘余物溶于水，然后冷凍干燥以得到(R)-2-甲基環(huán)戊-2-烯胺的鹽酸鹽(6.3g)，其為棕色固體，將其用于下一步而不用純化。步驟7：向(R)-2-甲基環(huán)戊-2-烯胺鹽酸鹽(420mg)在甲苯(30mL)中的溶液中添加三光氣(560mg)。所得混合物在110℃攪拌6小時(shí)。該混合物然后冷卻至室溫以得到(R)-5-異氰酸酯基-1-甲基環(huán)戊-1-烯的甲苯溶液。該溶液應(yīng)每次新鮮合成。步驟8：在0℃向(R)-2-甲基環(huán)戊-2-烯胺鹽酸鹽(23mg)在DCM(3mL)和飽和NaHCO3水溶液(3mL)中的溶液中添加碳酸二(三氯甲基)酯(18mg)。在0℃至25℃將混合物攪拌2小時(shí)。分離所得兩層，且水層用DCM萃取(60mL)。合并的有機(jī)層用鹽水(15mL)洗滌，用Na2SO4干燥，過(guò)濾且在減壓下濃縮以得到(R)-5-異氰酸酯基-1-甲基環(huán)戊-1-烯(20mg)，其為白色固體，其直接用于下一步而不用進(jìn)一步純化。MS(ES+)m/z141(MH+)(M：含氫氧化銨的脲衍生物)。中間體F3：2-(叔丁基)-7-(叔丁基磺?；?-6-氯苯并[d]噁唑步驟1：向2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-硫醇(3.0g)在DMF(30mL)中的溶液中添加2-碘丙烷(2.1g)。將混合物在100℃攪拌2小時(shí)。冷卻后，去除溶劑。殘余物通過(guò)柱色譜法純化以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-(異丙基硫基)苯并[d]噁唑(3.5g)。步驟2：在15℃向2-(叔丁基)-6-氯-7-(異丙基硫基)苯并[d]噁唑(3.5g)在DCM(40mL)中的溶液中添加mCPBA(5.3g)。將混合物在15℃攪拌48小時(shí)，然后用飽和Na2SO3溶液淬滅。有機(jī)層用Na2SO4干燥，過(guò)濾且濃縮。殘余物通過(guò)柱色譜法純化以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-(異丙基磺?；?苯并[d]噁唑(3.6g)。MS(ES+)m/z316(MH+)。步驟3：向2-(叔丁基)-6-氯-7-(異丙基磺?；?苯并[d]噁唑(3.0g)在THF(10mL)中的溶液中添加LiHMDS(1M在THF中，31.7mL)。將混合物在-78℃攪拌10分鐘，然后添加碘甲烷(6.74g)。將混合物在-78℃攪拌10分鐘，然后用NH4Cl水溶液和HCl水溶液(10％)淬滅。將混合物用EA萃取。有機(jī)層用鹽水洗滌，用Na2SO4干燥且濃縮。粗產(chǎn)物通過(guò)柱色譜法純化以得到2-(叔丁基)-7-(叔丁基磺?；?-6-氯苯并[d]噁唑(F3，2.8g)。MS(ES+)m/z330(MH+)。式(G)的化合物：1-(4-氯-2-羥基-3-((反-3-(吡咯烷-1-基)環(huán)丁基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲三氟乙酸鹽向6-氨基-3-氯-2-((反-3-(吡咯烷-1-基)環(huán)丁基)磺?；?苯酚(中間體G1，80mg)在吡啶(5mL)中的溶液中滴加(R)-5-異氰酸酯基-1-甲基環(huán)戊-1-烯(中間體F2，74mg)在甲苯(5mL)中的溶液。將混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。將混合物濃縮且所得殘余物重溶于DMF(8mL)且通過(guò)MDAP純化以得到1-(4-氯-2-羥基-3-((反-3-(吡咯烷-1-基)環(huán)丁基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲的三氟乙酸鹽(21mg)，其為白色固體。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm10.44(br.s.，2H)，8.28(br.s.，1H)，8.18(d，J＝8.8Hz，1H)，7.13(d，J＝8.8Hz，1H)，7.10(d，J＝8.6Hz，1H)，5.52(s，1H)，4.49-4.62(m，2H)，4.02(quin，J＝7.5Hz，1H)，2.82-3.23(m，2H)，2.64-2.80(m，5H)，2.11-2.36(m，3H)，1.80-2.08(m，4H)，1.67(s，3H)，1.45-1.64(m，1H)；MS(ES+)m/z454(MH+)。中間體G1：6-氨基-3-氯-2-(((1r,3r)-3-(吡咯烷-1-基)環(huán)丁基)磺?；?苯酚步驟1：在0℃在氮?dú)夥障蝽?3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺?；?環(huán)丁醇(中間體G2，3.0g)在DCM(30mL)中的溶液中添加TEA(2.6g)和甲烷磺酰氯(1.2g)。所得混合物在該溫度攪拌30分鐘。將混合物用NaHCO3水溶液淬滅，用DCM萃取(2×30mL)。洗滌合并的有機(jī)相，干燥且濃縮以得到甲磺酸順-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺?；?環(huán)丁基酯(2.6g)。MS(ES+)m/z422(MH+)。步驟2：向甲磺酸順-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺?；?環(huán)丁基酯(2.4g)在DMF(30mL)中的溶液中添加碳酸鉀(1.6g)和吡咯烷(0.5g)。將混合物在80℃攪拌過(guò)夜。添加水(20mL)。粗產(chǎn)物用EA萃取(3×80mL)。合并的有機(jī)相用鹽水洗滌，過(guò)濾且濃縮以得到粗產(chǎn)物，其通過(guò)柱色譜法純化(用PE:EA＝2:1洗脫)為2-(叔丁基)-6-氯-7-((反-3-(吡咯烷-1-基)環(huán)丁基)磺?；?苯并[d]噁唑(2.0g)。MS(ES+)m/z397(MH+)。步驟3：將2-(叔丁基)-6-氯-7-((反-3-(吡咯烷-1-基)環(huán)丁基)磺?；?苯并[d]噁唑(2.0g)溶于二噁烷的HCl中(50mL)和水(50mL)中。在120℃將反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜。去除溶劑以得到粗產(chǎn)物(1.5g)，將其與相同反應(yīng)的另一批次合并，該反應(yīng)使用2-(叔丁基)-6-氯-7-((反-3-(吡咯烷-1-基)環(huán)丁基)磺?；?苯并[d]噁唑(1.3g)作為起始原料。混合物通過(guò)制備型HPLC純化以得到標(biāo)題化合物(614mg)。MS(ES+)m/z331(MH+)。中間體G2：順-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)環(huán)丁醇步驟1：向2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-硫醇(25.0g)在DMF(250mL)中的溶液中添加4-溴丁-1-烯(16.8g)，然后添加K2CO3(21.4g)。所得混合物在60℃攪拌4小時(shí)。冷卻后，將其倒入水(1L)中，且用EA萃取(2×200mL)。合并的有機(jī)層用水和鹽水洗滌。用Na2SO4干燥后，將有機(jī)層濃縮以得到7-(丁-3-烯-1-基硫基)-2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑(27.6g)。MS(ES+)m/z296(MH+)。步驟2：向冰-水冷卻的7-(丁-3-烯-1-基硫基)-2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑(27.6g)在DCM(400mL)中的溶液中分批添加mCPBA(84.0g)。在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜后，添加NaHCO3水溶液和Na2S2O3水溶液。將混合物用DCM萃取(2×500mL)。合并的有機(jī)層用水和鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過(guò)濾且濃縮。粗產(chǎn)物通過(guò)柱色譜法純化(用PE:EA＝1:0至7:3洗脫)以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((2-(氧雜環(huán)丙烷-2-基)乙基)磺?；?苯并[d]噁唑(26.0g)。步驟3：在-70℃向2-(叔丁基)-6-氯-7-((2-(氧雜環(huán)丙烷-2-基)乙基)磺?；?苯并[d]噁唑(10.0g)在THF(200mL)中的溶液中添加甲基溴化鎂(3M在醚中，38.8mL)。將混合物緩慢加熱且在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。將反應(yīng)混合物倒入NH4Cl水溶液，且用EA萃取(2×200mL)。合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，用Na2SO4干燥且過(guò)濾。去除溶劑后，粗產(chǎn)物通過(guò)柱色譜法純化(用PE:EA＝4:1至3:2洗脫)以得到順-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺?；?環(huán)丁醇(7.2g)。式(H)的化合物：1-(4-氯-3-((反-3-(二甲基氨基)環(huán)丁基)磺酰基)-2-羥基苯基)-3-((R)-2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲三氟乙酸鹽向6-氨基-3-氯-2-((反-3-(二甲基氨基)環(huán)丁基)磺?；?苯酚(中間體H1，100mg)在吡啶(5mL)中的溶液中添加新鮮的在甲苯(5mL)中的(R)-5-異氰酸酯基-1-甲基環(huán)戊-1-烯(中間體F2，40mg)。將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，然后用水(5mL)淬滅。去除溶劑。殘余物通過(guò)MDAP純化(酸性條件)以得到1-(4-氯-3-((反-3-(二甲基氨基)環(huán)丁基)磺?；?-2-羥基苯基)-3-((R)-2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲的三氟乙酸鹽(40mg)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm10.46(br.s.，1H)，8.32(s，1H)，8.16(d，J＝8.8Hz，1H)，7.06-7.17(m，2H)，5.52(s，1H)，4.50-4.58(m，1H)，4.40-4.50(m，1H)，3.98(quin，J＝7.9Hz，1H)，2.62-2.82(m，10H)，2.11-2.36(m，3H)，1.67(s，3H)，1.49-1.59(m，1H)；MS(ES+)m/z428(MH+)。中間體H1：6-氨基-3-氯-2-((反-3-(二甲基氨基)環(huán)丁基)磺酰基)苯酚步驟1：在室溫將碳酸鉀(262mg)添加至甲磺酸順-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺?；?環(huán)丁基酯(中間體H2；200mg)和二甲基胺鹽酸鹽(77mg)在DMF(3mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物在100℃攪拌12小時(shí)，然后與相同反應(yīng)的另一批次合并，該反應(yīng)使用甲磺酸順-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺?；?環(huán)丁基酯(200mg)作為起始原料。合并的混合物用EA(50mL)稀釋。有機(jī)相用水(2×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥且濃縮以得到反-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺?；?-N,N-二甲基環(huán)丁胺(250mg)，其為棕色油狀物。MS(ES+)m/z371(MH+)。步驟2：在室溫將HCl水溶液(35％，5mL)添加至反-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)-N,N-二甲基環(huán)丁胺(550mg)在1,4-二噁烷(10mL)和水(10mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物在120℃攪拌3小時(shí)，然后與相同反應(yīng)的另一批次合并，該反應(yīng)使用反-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)-N,N-二甲基環(huán)丁胺(400mg)作為起始原料。將合并的混合物濃縮。殘余物溶于MeOH。添加NaHCO3水溶液直到pH＝8。將混合物濃縮。所得殘余物通過(guò)柱色譜法純化(用洗脫DCM:MeOH＝50:1)以得到標(biāo)題化合物(220mg)，其為黑色油狀物。MS(ES+)m/z305(MH+)。中間體H2：甲磺酸順-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺?；?環(huán)丁基酯在0℃向順-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)環(huán)丁醇(中間體G2，1.0g)和N,N-二乙基丙-2-胺(0.9mL)在DCM(20mL)中的溶液中添加甲磺酰氯(0.3mL)。將混合物在0℃攪拌4小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物倒入水中且用DCM萃取(2×50mL)。洗滌合并的有機(jī)相，干燥且濃縮以得到甲磺酸順-3-((2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-基)磺酰基)環(huán)丁基酯(1.3g)，其為無(wú)色固體。MS(ES+)m/z422(MH+)。式(I)的化合物：(R)-1-(4-氯-3-((1,1-二氟乙基)磺酰基)-2-羥基苯基)-3-(2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲向6-氨基-3-氯-2-((1,1-二氟乙基)磺?；?苯酚(中間體I1，84mg)在吡啶(5mL)中的溶液中添加(R)-5-異氰酸酯基-1-甲基環(huán)戊-1-烯(中間體F2，0.15M在甲苯中，4mL)。將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。將混合物濃縮且殘余物溶于DMF(8mL)且通過(guò)MDAP純化以得到(R)-1-(4-氯-3-((1,1-二氟乙基)磺?；?-2-羥基苯基)-3-(2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲(15mg)，其為白色固體。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm10.53(br.s.，1H)，8.28(s，1H)，8.26(d，J＝9.0Hz，1H)，7.17(d，J＝8.8Hz，1H)，7.07(d，J＝8.3Hz，1H)，5.52(br.s.，1H)，4.44-4.62(m，1H)，2.23-2.36(m，2H)，2.16-2.23(m，1H)，2.09(t，J＝19.2Hz，3H)，1.67(s，3H)，1.47-1.59(m，1H)；MS(ES+)m/z395(MH+)。中間體I1：6-氨基-3-氯-2-((1,1-二氟乙基)磺?；?苯酚步驟1：向在-78℃攪拌的2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7-硫醇(6.0g)和氫氧化鉀(13.9g)在乙腈(80mL)和水(80mL)中的溶液中一次性添加(溴代二氟甲基)膦酸二乙基酯(11.9g)。將混合物溫?zé)嶂潦覝厍覕嚢?0分鐘。添加EA(200mL)。分離有機(jī)相。水相用EA萃取(2×100mL)。合并有機(jī)層，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾且濃縮以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((二氟甲基)硫基)苯并[d]噁唑(7.2g)，其為無(wú)色油狀物。MS(ES+)m/z292(MH+)。步驟2：在0℃向2-(叔丁基)-6-氯-7-((二氟甲基)硫基)苯并[d]噁唑(7.2g)在DCM(200mL)中的溶液中添加mCPBA(19.5g)且攪拌2小時(shí)。由于起始原料沒有消耗完全，添加另外的mCPBA(19.5g)。將混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。然后添加Na2SO3水溶液。分離有機(jī)相，用飽和碳酸鈉溶液和鹽水洗滌。所得溶液用硫酸鈉干燥，過(guò)濾且濃縮。殘余物通過(guò)柱色譜法純化(用PE:EA＝1:0-2:3洗脫)以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((二氟甲基)磺?；?苯并[d]噁唑(3.2g)，其為白色固體。MS(ES+)m/z324(MH+)。步驟3：向2-(叔丁基)-6-氯-7-((二氟甲基)磺?；?苯并[d]噁唑(2.2g)和碘甲烷(4.2mL)在THF(30mL)和HMPA(27mL)中的溶液中添加LDA(2M在THF中，13.5mL)。將混合物在-50℃攪拌30分鐘?；旌衔锶缓笥蔑柡蚇H4Cl溶液和10％HCl溶液中和。添加EA(50mL)。有機(jī)層用鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥且真空濃縮。粗產(chǎn)物與相同反應(yīng)的另一批次合并，該反應(yīng)使用2-(叔丁基)-6-氯-7-((二氟甲基)磺酰基)苯并[d]噁唑(1.0g)作為起始原料。粗產(chǎn)物通過(guò)柱色譜法純化(用PE:EA＝1:0-3:2洗脫)以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((1,1-二氟乙基)磺?；?苯并[d]噁唑(1.0g)，其為白色固體。MS(ES+)m/z338(MH+)。步驟4：向2-(叔丁基)-6-氯-7-((1,1-二氟乙基)磺酰基)苯并[d]噁唑(1.0g)在1,4-二噁烷(20mL)中的溶液中添加濃HCl溶液(20mL)?；旌衔镌?10℃回流4小時(shí)，然后濃縮。所得殘余物溶于EA(20mL)。溶液的pH用TEA調(diào)節(jié)至8。將混合物濃縮。殘余物通過(guò)柱色譜法純化(用PE:EA＝1:0至1:4洗脫)以得到標(biāo)題化合物(1.0g)，其為淺棕色固體。MS(ES+)m/z272(MH+)。式(J)的化合物：1-(4-氯-2-羥基-3-(((S)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺?；?苯基)-3-((R)-2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲和式(C)的化合物：1-(4-氯-2-羥基-3-(((R)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲向6-氨基-3-氯-2-((3-甲基四氫呋喃-3-基)磺?；?苯酚(中間體JC1，3000mg)在吡啶(20mL)中的溶液中添加(R)-5-異氰酸酯基-1-甲基環(huán)戊-1-烯(中間體F2，2279mg)。所得混合物在40℃攪拌12小時(shí)。添加冷卻水(30mL)且水層用DCM萃取(2×100mL)。合并的有機(jī)層用Na2SO4干燥，過(guò)濾且濃縮以得到1-(4-氯-2-羥基-3-((3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲(4.1g)，其為黑色固體。一部分該化合物(3.0g)通過(guò)SFC和MDAP在酸性條件純化以得到純的兩種對(duì)映異構(gòu)體：1-(4-氯-2-羥基-3-(((S)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺?；?苯基)-3-((R)-2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲(式(J)的化合物，666mg)和1-(4-氯-2-羥基-3-(((R)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺?；?苯基)-3-((R)-2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-基)脲(式(C)的化合物，626mg)。式(J)的化合物：HPLC(ChiralpakIC柱(4.6*250mm，5uM)，1:1ACN/IPA(包含0.5％DEA)，CO2流速：2.55mL/min；共溶劑流速：0.45mL/min；反壓：120巴)；tr＝16.9min；>93％ee；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm10.53(s，1H)，8.36(d，J＝8.8Hz，1H)，8.17(s，1H)，7.14(d，J＝8.8Hz，1H)，7.05(d，J＝8.3Hz，1H)，5.51(s，1H)，4.49-4.63(m，1H)，4.33(d，J＝10.3Hz，1H)，3.76-3.89(m，2H)，3.61(d，J＝10.0Hz，1H)，2.68(dt，J＝13.3，7.9Hz，1H)，2.10-2.35(m，3H)，1.91-2.02(m，1H)，1.67(s，3H)，1.44-1.58(m，4H)；MS(ES+)m/z415(MH+)；式(C)的化合物：HPLC(ChiralpakIC柱(4.6*250mm，5uM)，1:1ACN/IPA(包含0.5％DEA)，CO2流速：2.55mL/min；共溶劑流速：0.45mL/min；反壓：120巴)；tr＝14.3min；>99％ee；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm10.52(s，1H)，8.36(d，J＝9.0Hz，1H)，8.17(s，1H)，7.14(d，J＝8.8Hz，1H)，7.05(d，J＝8.3Hz，1H)，5.51(s，1H)，4.49-4.61(m，1H)，4.33(d，J＝10.0Hz，1H)，3.75-3.91(m，2H)，3.61(d，J＝10.0Hz，1H)，2.68(dt，J＝13.3，7.9Hz，1H)，2.09-2.37(m，3H)，1.90-2.02(m，1H)，1.67(s，3H)，1.42-1.59(m，4H)；MS(ES+)m/z415(MH+)；中間體JC1：6-氨基-3-氯-2-((3-甲基四氫呋喃-3-基)磺?；?苯酚步驟1：向四氫呋喃-3-醇(5.0g)在DCM(100mL)中的冰-水冷卻的溶液中添加TEA(11.9mL)和MsCl(4.9mL)。所得反應(yīng)混合物在0℃攪拌3小時(shí)，然后用NaHCO3水溶液淬滅。將混合物用EA萃取(2×100mL)。將合并的有機(jī)相洗滌，干燥，過(guò)濾且濃縮以得到甲磺酸四氫呋喃-3-基酯(6.2g)。步驟2：向2-(叔丁基)-6-氯苯并[d]噁唑-7硫醇鈉(11.8g)在DMF(100mL)中的溶液中添加甲磺酸四氫呋喃-3-基酯(6.2g)和K2CO3(7.7g)。所得反應(yīng)混合物在80℃攪拌過(guò)夜。冷卻后，將其倒入水(500mL)中且用EA萃取(2×150mL)。將合并的有機(jī)相洗滌，干燥且濃縮以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((四氫呋喃-3-基)硫基)苯并[d]噁唑(11.4g)。步驟3：向2-(叔丁基)-6-氯-7-((四氫呋喃-3-基)硫基)苯并[d]噁唑(7.4g)在DCM(200mL)中的冰-水冷卻的溶液中添加mCPBA(11.7g)。所得混合物在室溫?cái)嚢?天，然后用NaHCO3水溶液和Na2S2O3水溶液淬滅。將混合物用EA萃取(2×200mL)。將合并的有機(jī)相洗滌，干燥且濃縮。殘余物通過(guò)柱色譜法純化(用PE中的0-40％EA洗脫)以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((四氫呋喃-3-基)磺?；?苯并[d]噁唑(4.3g)。MS(ES+)m/z344(MH+)。步驟4：向2-(叔丁基)-6-氯-7-((四氫呋喃-3-基)磺?；?苯并[d]噁唑(4.3g)和MeI(2.0mL)在THF(100mL)中的干冰-乙醇冷卻的溶液中添加LiHMDS(1M在THF中，31.3mL)。所得混合物緩慢加熱且在室溫?cái)嚢?0分鐘。添加NH4Cl水溶液。將混合物用EA萃取(2×150mL)。將合并的有機(jī)相洗滌，干燥且濃縮以得到2-(叔丁基)-6-氯-7-((3-甲基四氫呋喃-3-基)磺?；?苯并[d]噁唑(4.4g)。MS(ES+)m/z358(MH+)。步驟5：向2-(叔丁基)-6-氯-7-((3-甲基四氫呋喃-3-基)磺?；?苯并[d]噁唑(4.4g)在1,4-二噁烷(150mL)中的溶液中添加HCl水溶液(37％，30.3mL)。將混合物在120℃回流過(guò)夜，然后濃縮。殘余物溶于水(100mL)。溶液的pH用NaHCO3水溶液調(diào)節(jié)至8，且用EA萃取。將有機(jī)相洗滌且濃縮。所得殘余物通過(guò)柱色譜法純化(用PE中的0-80％EA的梯度洗脫)以得到標(biāo)題化合物(2.4g)。MS(ES+)m/z292(MH+)。式(K)的化合物：1-(4-氯-2-羥基-3-(((S)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺?；?苯基)-3-((R)-2-氯環(huán)戊-2-烯-1-基)脲和式(L)的化合物：1-(4-氯-2-羥基-3-(((R)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-氯環(huán)戊-2-烯-1-基)脲向6-氨基-3-氯-2-((3-甲基四氫呋喃-3-基)磺?；?苯酚(中間體JC1，600mg)在吡啶(20mL)中的溶液中添加在甲苯(20mL)中的新鮮的(R)-1-氯-5-異氰酸酯基環(huán)戊-1-烯(中間體E2，443mg)。將混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。所得溶液用水(5mL)淬滅且濃縮。殘余物用MDAP純化(酸性條件)以得到1-(4-氯-2-羥基-3-((3-甲基四氫呋喃-3-基)磺?；?苯基)-3-((R)-2-氯環(huán)戊-2-烯-1-基)脲(205mg)。將一部分該化合物(160mg)通過(guò)手性分離純化(AD-H(4.6*250mm,5um)，共溶劑MeOH，1％DEA)，然后通過(guò)MDAP(酸性條件)純化以得到1-(4-氯-2-羥基-3-(((S)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺酰基)苯基)-3-((R)-2-氯環(huán)戊-2-烯-1-基)脲和1-(4-氯-2-羥基-3-(((R)-3-甲基四氫呋喃-3-基)磺?；?苯基)-3-((R)-2-氯環(huán)戊-2-烯-1-基)脲(分別為式(K)的化合物和式(L)的化合物，37mg和31mg)，其為紫羅蘭色固體。異構(gòu)體1：HPLC(AD-H柱(4.6*250mm，5uM)，IPA(包含0.1％DEA)，CO2流速：2.25mL/min；共溶劑流速：0.75mL/min；反壓：149巴)；tr＝4.7min；>99％ee；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm10.49(s，1H)，8.37(d，J＝8.9Hz，1H)，8.25(s，1H)，7.38(d，J＝8.8Hz，1H)，7.16(d，J＝8.9Hz，1H)，5.99(d，J＝1.7Hz，1H)，4.73(s，1H)，4.34(d，J＝10.1Hz，1H)，3.72-3.97(m，2H)，3.61(d，J＝10.1Hz，1H)，2.67(m，1H)，2.18-2.47(m，3H)，1.84-2.04(m，1H)，1.57-1.78(m，1H)，1.49(s，3H)；MS(ES+)m/z435(MH+)。異構(gòu)體2：HPLC(AD-H柱(4.6*250mm，5uM)，IPA(包含0.1％DEA)，CO2流速：2.25mL/min；共溶劑流速：0.75mL/min；反壓：149巴)；tr＝5.5min；>93％ee；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm10.49(s，1H)，8.37(d，J＝8.9Hz，1H)，8.24(s，1H)，7.37(d，J＝8.7Hz，1H)，7.16(d，J＝8.9Hz，1H)，5.99(s，1H)，4.73(s，1H)，4.34(d，J＝10.1Hz，1H)，3.71-3.96(m，2H)，3.61(d，J＝10.1Hz，1H)，2.62-2.78(m，1H)，2.19-2.44(m，3H)，1.84-2.06(m，1H)，1.56-1.78(m，1H)，1.49(s，3H)；MS(ES+)m/z435(MH+)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3