專利名稱：生物標記用于評估β7整聯蛋白拮抗劑治療胃腸道炎性病癥的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及評估治療劑(或藥物)如整聯蛋白β 7拮抗劑用于治療胃腸道炎性病 癥的效果、功效、安全性和/或給藥的方法。具體地，本發(fā)明涉及使用患者外周血中的腸歸 巢(gut-homing)淋巴細胞水平、藥物在腸歸巢淋巴細胞上占據(occupancy)的水平，和/ 或β7整聯蛋白受體在腸歸巢淋巴細胞上的水平作為治療劑如β7整聯蛋白拮抗劑治療胃 腸道炎性病癥的效果、功效、安全性和/或給藥的指示物(“生物標記”)。此類方法包括例 如，使用這些生物標記的一種或多種評估患者對整聯蛋白β 7拮抗劑治療胃腸道病癥的應 答性。此外，本發(fā)明提供了使用此類生物標記設計藥物治療和/或給藥方案或者用于預后 的方法。
背景技術：
為了保護身體抵抗外來物質，免疫系統(tǒng)的細胞經由外周血在身體中循環(huán)并歸巢到 淋巴結和濃縮抗原的組織。通常，有兩種不同的歸巢系統(tǒng)，外周歸巢和粘膜歸巢，其提供了 對系統(tǒng)性或粘膜抗原的免疫性。最初在胃腸道位點中被激活的細胞將優(yōu)先歸巢到粘膜的組 織和節(jié)結。相反，在外周淋巴結中活化的細胞優(yōu)先返回到外周位點(Butcher et al. , Adv Immunol (1999))。循環(huán)中的細胞通過經毛細血管后微靜脈(HEV)外滲進入腸淋巴結和組 織。這通過淋巴細胞表面上的粘附分子和HEV上的受體(地址素)之間的相互作用發(fā)生 (Butcher et al. , Adv Immunol(1999))。整聯蛋白是α/β異二聚體細胞表面受體，其涉及從細胞粘附到基因調節(jié)的多 種細胞過程(Hynes, R. 0.，Cell, 1992,69 :11-25 ；禾口 Hemler，Μ. Ε.，Annu. Rev. Immunol.， 1990,8 :365-368)。在免疫系統(tǒng)中，整聯蛋白涉及炎癥過程中的淋巴細胞運輸、粘附和滲入 (Nakajima，H. et al.，J. Exp. Med.，1994，179 :1145-1154) 整聯蛋白的差別表達調節(jié)細 胞的粘附性質并且不同的整聯蛋白涉及不同的炎癥反應(Butcher，Ε. C. et al.，Science, 1996,272 :60-66)。含有β 7的整聯蛋白(如α4β7*αΕβ7)主要在單核細胞、淋巴細胞、 嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和巨噬細胞上表達但是不在嗜中性粒細胞上表達(Elices， Μ. J. et al.，Cell，1990,60 :577-584)。α 4 β 7整聯蛋白的主要配體是內皮表面蛋白粘 膜地址素細胞粘附分子(MAdCAM-I)和血管細胞粘附分子(VCAM-I) (Makarem, R. et al.， J. Biol. Chem.，1994，269 :4005-4011)。據報導在炎癥位點α 4 β 7整聯蛋白與毛細血管后 微靜脈(HEVs)上表達的MAdCAM-I和/或VCAM-I的結合導致白細胞和內皮的堅固粘附； 該堅固粘附步驟后是細胞外滲入發(fā)炎的組織(Chuluyan，H. Ε. et al.，Springer Semin. Immunopathol.，1995，16 :391404)。α Εβ 7整聯蛋白(其在上皮內淋巴細胞(IEL)上表 達)的主要配體是E-鈣黏著蛋白，據報導E-鈣黏著蛋白促進帶有αΕβ7的細胞粘附到上 皮細胞。盡管據報導E-鈣黏著蛋白在向腸的歸巢中不起作用，但是認為E-鈣黏著蛋白和 α Εβ 7之間的相互作用在淋巴細胞向腸上皮的拴系中起作用。IBD是大腸、并且在一些情況中是小腸的一組炎性、自身免疫病癥。IBD的主要形 式是局限性回腸炎(CD)和潰瘍性結腸炎(UC)。作為自身免疫疾病，IBD的特征是白細胞向胃腸道的增加的滲入，導致腸的增厚和細胞破壞。通過阻斷白細胞的歸巢抑制該滲入可以 下調與該疾病相關的炎癥和細胞破壞。據報導循環(huán)的粘膜歸巢淋巴細胞在具有結腸炎癥的 患者中發(fā)生改變(Meenan et al. Gut 1997;40:241-246)。據報導針對 α 4 β 7、MAdCAM-I 或VCAM-I的單克隆抗體在慢性炎性疾病如結腸炎(Viney et al.，J. Immunol.，1996，157 2488-2497)和炎性腸病(IBD ；Podalski,D. K.，N. Eng. J. Med. , 1991,325 :928-937 ；Powrie, F. et al.，Ther. Immunol.，1995,2 :115-123)的動物模型中是有效調節(jié)劑。據報導施用針對α Εβ 7的單克隆抗體在IL_2+小鼠中預防并減輕了免疫誘導的 結腸炎，提示炎性腸病的發(fā)作和保持取決于表達α Εβ 7的粘膜固有層(lamina propria) CD4+淋巴細胞的結腸定位(Ludviksson et al.，J Immunol. 1999,162(8) :4975-82)。據 報導抗-α 4抗體(那他珠單抗)在⑶患者治療中有效(Sandborn et al.，N Engl J Med 2005 ；353 =1912-25)并且據報導抗α4β7抗體(MLN-02)在UC患者中有效O^eagan et al.，N Engl J Med2005 ；352 =2499-507)。這些發(fā)現證實了 α 4β 7作為治療靶標并且支持 α 4β 7和MAdCAM-I之間的相互作用介導IBD的發(fā)病機制這一觀點。從而，β 7整聯蛋白的 拮抗劑作為治療IBD中的治療劑具有巨大潛力。為了設計具有希望的效果、安全性和/或功效的療法，重要的是評估患者對治療 劑如β7整聯蛋白拮抗劑治療的應答性和預后。因此，希望開發(fā)可以準確預測和/或追蹤 患者對治療劑治療的應答性的生物標記。此類預測對于設計在臨床試驗研究和疾病治療中 人類患者的有效治療方案是必需的。發(fā)明概述本發(fā)明涉及評估治療劑(或藥物)如整聯蛋白β 7拮抗劑用于治療胃腸道炎性病 癥患者的效果、功效、安全性、預后和/或給藥的方法。具體地，本發(fā)明涉及使用患者外周血 中的腸歸巢淋巴細胞水平、藥物在腸歸巢淋巴細胞上占據的水平，和/或β 7整聯蛋白受體 在腸歸巢淋巴細胞上的水平作為治療劑如β 7整聯蛋白拮抗劑治療胃腸道炎性病癥的效 果、功效、安全性、預后和/或給藥的指示物(或生物標記)。此類方法包括例如，使用這些 生物標記的一種或多種評估患者對整聯蛋白β7拮抗劑治療胃腸道病癥的應答性。此外， 本發(fā)明提供了使用此類生物標記設計藥物治療和/或給藥方案或者用于預后的方法。在一些方面，將用治療劑治療患者前的生物標記水平與患者治療期間和/或之后 該相同生物標記的水平比較，并且患者中該生物標記水平的改變(例如，升高或降低)是該 治療劑如β7整聯蛋白拮抗劑在治療患者中胃腸道炎性病癥中的效果、功效、安全性和/或 預后的指示。此外，本發(fā)明的此類方法可以用于設計用于治療患者中胃腸道炎性病癥的藥 物治療或給藥方案。一方面，本發(fā)明涉及確定整聯蛋白β 7拮抗劑在治療患者中胃腸道炎性病癥的功 效的方法，該方法包括比較用整聯蛋白β 7拮抗劑治療之后或期間從患者得到的樣品中生 物標記的量和治療前從患者得到的樣品中該生物標記的量，其中治療之后或期間與治療前 相比該生物標記的量的改變是該拮抗劑在治療患者中胃腸道病癥中的功效的指示。另一方面，本發(fā)明涉及預測胃腸道炎性病癥患者對整聯蛋白β 7拮抗劑治療的應 答性的方法，該方法包括比較用整聯蛋白β 7拮抗劑治療之后或期間從患者得到的樣品中 生物標記的量和治療前從患者得到的樣品中該生物標記的量，其中治療之后或期間與治療 前相比該生物標記的量的改變是所述患者對所述拮抗劑治療的應答性的指示。
在再一方面，本發(fā)明涉及確定整聯蛋白β 7拮抗劑用于治療患者中胃腸道炎性病 癥的給藥的方法，該方法包括基于用整聯蛋白β 7拮抗劑的劑量治療之后或期間從患者得 到的樣品中生物標記的量與治療前從患者得到的樣品中該生物標記的量的比較來調節(jié)整 聯蛋白β 7拮抗劑的劑量，其中治療之后或期間與治療前相比該生物標記的量的改變是對 用于治療患者中胃腸道疾病的整聯蛋白β 7拮抗劑的劑量的功效或應答性的指示。另一方面，本發(fā)明涉及確定整聯蛋白β 7拮抗劑用于治療患者中胃腸道炎性病癥 的給藥方案的方法，該方法包括基于用整聯蛋白β 7拮抗劑的給藥方案治療之后或期間從 患者得到的樣品中生物標記的量與治療前從患者得到的樣品中該生物標記的量的比較來 調節(jié)整聯蛋白β 7拮抗劑的給藥方案，其中治療之后或期間與治療前相比該生物標記的量 的改變是對用于治療患者中胃腸道疾病的整聯蛋白β7拮抗劑的給藥方案的功效或應答 性的指示。在一個實施方案中，生物標記的量的改變是增加。在另一實施方案中，生物標記的量的改變是減少。在再一個實施方案中，樣品是患者的外周血樣品。在一個實施方案中，在接受第一次劑量的整聯蛋白β 7拮抗劑后的100天內測量 接受整聯蛋白β 7拮抗劑的所述患者血樣中生物標記的量。在另一實施方案中，在施用整聯蛋白β 7拮抗劑約50天內測量接受整聯蛋白β 7 拮抗劑后所述患者血樣中生物標記的量。在再一個實施方案中，在施用整聯蛋白β 7拮抗劑約M小時內測量接受整聯蛋白 β7拮抗劑后所述患者血樣中生物標記的量。在一個實施方案中，胃腸道炎性病癥是炎性腸病。在進一步的實施方案中，所述炎性腸病是局限性回腸炎(CD)或潰瘍性結腸炎 (UC)。在另一實施方案中，整聯蛋白β 7拮抗劑是抗β 7整聯蛋白抗體。在另一實施方案中，所述患者是人。在一個實施方案中，所述改變的量是所述生物標記的量的至少約30%、約50%、 約一倍、或約三倍增加。在一個實施方案中，以約lmg/kg到100mg/kg的量施用抗β 7整聯蛋白抗體。在另一個實施方案中，所述量為5mg/kg-50mg//kg。在一個實施方案中，治療還包括施用有效量的一種或多種其他藥物。在進一步的實施方案中，所述其他藥物是免疫抑制劑、疼痛控制劑、止瀉藥、抗生 素或者一種或多種所述藥物的組合。在更進一步的實施方案中，所述免疫抑制劑是柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、 5-氨基水楊酸(5-ASA)、Metroidazole、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)、硫唑嘌呤 (Azathioprine)或 6-巰基嘌呤。在另一實施方案中，所述其他藥物是另一種抗β 7整聯蛋白抗體。在一個實施方案中，所述抗β 7整聯蛋白抗體腸胃外施用于所述患者。在進一步的實施方案中，抗β 7整聯蛋白抗體靜脈內和/或皮下施用于所述患者。在一個實施方案中，所述抗0 7整聯蛋白抗體以每1，2，3，4，5，6，8或12周至少一次的頻率施用。在進一步的實施方案中，所述抗β 7整聯蛋白抗體每周施用。在另一實施方案中，所述抗β 7抗體施用至少1，2，4，6，8，12，對，36，或52周。在一個實施方案中，抗體是單克隆的。在另一實施方案中，所述抗體是嵌合抗體、人抗體或人源化抗體。在另一實施方案中，所述抗體是抗體片段。在一個實施方案中，所述抗體抑制人β 7整聯蛋白亞基與第二種整聯蛋白亞基和 /或整聯蛋白配體的相互作用。在一個實施方案中，所述第二種整聯蛋白亞基是α4整聯蛋白亞基，并且其中所 述配體是MAdCAM，VCAM或纖連蛋白。在一個實施方案中，α 4整聯蛋白亞基來自人。在一個實施方案中，所述第二種整聯蛋白亞基是αΕ整聯蛋白亞基，并且其中所 述配體是E-鈣黏著蛋白。在一個實施方案中，所述配體來自人。在一個實施方案中，α E整聯蛋白亞基來自人。在另一實施方案中，抗β 7整聯蛋白抗體包含三個重鏈高變區(qū)(HVR-H1-H3)序列 和三個輕鏈高變區(qū)(HVR-L1-L3)序列，其中1、2、3、4、5或6個高變區(qū)(HVR)選自由下列組 成的組(i) HVR-Ll，包含序列 Al-Al 1，其中 Al-All 是 RASESVDRYLH(SEQ ID NO :1)」(ii)HVR-L2，包含序列 B1-B8，其中 B1-B8 是 KYASQSIS(SEQ IDNO 2)」(iii)HVR-L3，包含序列 C1-C10，其中 Cl-ClO 是 QQGNSLLPNT(SEQ ID NO :3)」(iv) HVR-Hl，包含序列 D1-D10，其中 Dl-DlO 是 GFFITNNYWG (SEQ ID NO :4)」(v)HVR-H2，包含序列 E1-E17，其中 E1-E17 是GYISYSGSTSYNPSLKS(SEQ ID NO 5)； 禾口(vi)HVR-H3，包含序列 F1-F11，其中 Fl-Fll 是 MTGSSGYFDF(SEQ ID NO 6)。在再一個實施方案中，所述抗體包含選自由HVR-L1，HVR-L2，HVR-L3，HVR-Hl, HVR-H2，和HVR-H3的六個高變區(qū)(HVRs)組成的組，其中(i) HVR-Ll 包含氨基酸序列 Al-Al 1，其中 Al-All 是 RASESVDTYLH(SEQ ID NO 1)； RASESVDSLLH(SEQ ID NO 7)，RASESVDTLLH(SEQ ID NO :8)，或 RASESVDDLLH(SEQ ID NO 9) 或SEQ ID NOs :1，7，8或9的變體，其中氨基酸A2選自由A，G，S，T和V組成的組和/或氨 基酸A3選自由S，G，I，K，N，P，Q，R和T組成的組，和/或A4選自由E，V，Q，A，D，G，H，I， K，L，N和R組成的組，和/或氨基酸A5選自由S，Y，A，D，G，H，I，K，N，P，R，T和V組成的 組，和/或氨基酸A6選自由V，R，I，A，G，K，L，M和Q組成的組，和/或氨基酸A7選自由D， V, S，A，E，G，H，I，K，L，N，P，S和T組成的組，和/或氨基酸A8選自由D，G，N，E，T，P和S 組成的組，和/或氨基酸A9選自由L，Y，I和M組成的組，和/或氨基酸AlO選自由L，A，I， M和V組成的組和/或氨基酸All選自由H，Y，F和S組成的組；(ii)HVR-L2 包含氨基酸序列 B1-B8，其中 B1-B8 是 KYASQSIS(SEQ ID NO 2), RYASQSIS (SEQ ID NO :67)，或XaaYASQSIS (SEQ IDNO :68)，其中 Xaa代表任意氨基酸，或 SEQ ID NOs :2，67 或 68 的變體，其中氨基酸 Bl 選自由 K，R，N，V，A，F，Q，H，P，I，L，Y 和)(aa (其中^代表任意氨基酸)組成的組，和/或氨基酸B4選自由S和D組成的組，和/或氨基 酸B5選自由Q和S組成的組，和/或氨基酸B6選自由S，D，L和R組成的組，和/或氨基酸 B7選自由I，V，E和K組成的組；(iii)HVR-L3 包含氨基酸序列 C1-C9，其中 C1-C9 是 QQGNSLPNT(SEQ ID NO :3)或 SEQ ID NO 3的變體其中氨基酸C8選自由N，V，W, Y，R，S，T，A，F，H，I L，M和Y組成的組；(iv) HVR-Hl 包含氨基酸序列 D1-D10 其中 D1-D10 是 GFFITNNYWG (SEQ ID NO 4)；(v) HVR-H2 包含氨基酸序列 Ε1-Ε17 其中 Ε1-Ε17 是 GHSYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO :5)，或SEQ ID NO 5的變體其中氨基酸Ε2選自由Y，F，V和D組成的組，和/或氨基酸 Ε6選自由S和G組成的組，和/或氨基酸ElO選自由S和Y組成的組，和/或氨基酸Ε12選 自由N，T，A和D組成的組，和/或氨基酸Ε13選自由P，H，D和A組成的組，和/或氨基酸 Ε15選自由L和V組成的組，和/或氨基酸Ε17選自由S和G組成的組；和(vi)HVR-H3 包含氨基酸序列 F2-F11 其中 F2-F11 是MTGSSGYFDF(SEQ ID NO :6)或 RTGSSGYFDF (SEQ ID NO 66)；或包含氨基酸序列 F1-F11，其中 F1-F11 是 AMTGSSGYFDF (SEQ ID NO :63)，ARTGSSGYFDF(SEQ ID NO :64)，或AQTGSSGYFDF (SEQ ID N0:65)，或 SEQ ID NOs 6，63，64，65或66的變體，其中氨基酸F2是R，M，A，E，G，Q，S，和/或氨基酸Fll選自由F 和Y組成的組。在另一實施方案中，所述抗體還包含構架，其中構架位置71處的氨基酸是R或A， 并且構架位置73處的氨基酸是N或T，并且構架位置78處的氨基酸是F或A或L。在另一實施方案中，所述抗體還包含重鏈人亞組III重鏈共有構架序列，其包含 位置71，73和/或78處的取代。在一個實施方案中，取代是R71A，N73T,，L78A或L78F。在另一實施方案中，序列HVR-H2位置El-El和HVR-H3位置Fl-Fll之間的構架序 列是 HFR3-1-HFR3-31，并且其中 HFR3-6 是 A 或 R, HFR3-8 是 N 或 T，HFR3_13 是 L 或 A 或 F。在再一個實施方案中，重鏈構架位置71包含氨基酸R或A，和/或重鏈構架位置 73包含T或N，和/或重鏈構架位置78包含F或A或L。序列包含重鏈構架位置71。在示例性實施方案中，抗體包含三個重鏈高變區(qū)(HVR-H1-H3)序列和三個輕鏈高 變區(qū)(HVR-L1-L3)序列，其中(i)HVR-Ll 包含 SEQ ID NO :7，SEQ ID NO 8 或 SEQ ID NO 9 ；(ii)HVR-L2 包含 SEQ ID NO 2 ；(iii)HVR-L3 包含 SEQ ID NO 3 ；(iv) HVR-Hl 包含 SEQ ID NO 4 ；(v)HVR-H2 包含 SEQ ID NO 5 ；禾口(vi)HVR-H3 包含 SEQ ID NO :6 或 SEQ ID NO 63 或 SEQ IDNO 64 或 SEQ ID NO: 66。在再一個示例性實施方案中，所述人源化抗體包含SEQ ID NO 25的輕鏈可變區(qū)序 列，和SEQ ID NO 26的重鏈可變區(qū)序列。在一個實施方案中，所述抗體結合到包含SEQ ID N0:10和SEQ IDN0:11，或SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 13的輕鏈和重鏈可變區(qū)序列的抗體的相同表位。一方面，本發(fā)明涉及設計用候選試劑治療診斷為胃腸道炎性病癥的人類患者的方法，包括基于響應所述候選試劑的治療有效增加非人受試者的外周血中生物標記的量的劑 量確定人類患者的有效劑量。在一個實施方案中，所述非人受試者是猴子。在另一方面，本發(fā)明涉及預測患者的炎性腸病的預后的方法，包括比較所述患者 血樣中腸歸巢淋巴細胞的量和外周歸巢淋巴細胞的量的比率與健康個體血樣中腸歸巢淋 巴細胞的量和外周歸巢淋巴細胞的量的比率，其中所述患者的比率與健康個體的比率相比 降低指示該疾病的預后。在另一方面，本發(fā)明涉及鑒定包含表達αΕβ7整聯蛋白的淋巴細胞和表達 α 4β 7整聯蛋白的淋巴細胞的淋巴細胞群體的方法，包括將所述淋巴細胞與分離的抗體結 合，所述分離的抗體與包含SEQ ID NO 25的輕鏈可變區(qū)序列和SEQ ID NO 26的重鏈可變 區(qū)序列的抗體結合相同的表位。在一個實施方案中，所述淋巴細胞在診斷為炎性腸病的患者的外周血中。在另一實施方案中，所述淋巴細胞在診斷為炎性腸病的患者腸的淋巴結和組織 中。附圖簡述

圖1顯示了獼猴外周血中⑶4+淋巴細胞亞型。圖2顯示了對獼猴給予12次靜脈內劑量的5，15，或50mg/kg rhuMAbBeta7或者 12次靜脈內和皮下劑量的載體后，外周血中組平均(士SD)⑶45RA_i3 7s⑶4+淋巴細胞。圖3顯示了對獼猴給予12次皮下劑量的15或50mg/kg rhuMAb Beta7或者12次 靜脈內和皮下劑量的載體后，外周血中組平均(士SD)CD45RA_i3 7s⑶4+淋巴細胞(絕對計 數，％BL)。圖4顯示了對獼猴給予12次靜脈內劑量的5，15，或50mg/kgrhuMAb Beta7或者 12次靜脈內和皮下劑量的載體后，外周血中組平均(士SD)⑶45RA_i3 7 ⑶4+淋巴細胞(絕 對計數，％BL)。圖5顯示了對獼猴給予12次皮下劑量的15或50mg/kg rhuMAb Beta7或者12次 靜脈內和皮下劑量的載體后，外周血中組平均(士SD)⑶45RA_i3 7 ⑶4+淋巴細胞(絕對計 數，％BL)。圖6顯示了對獼猴給予12次靜脈內劑量的5，15，或50mg/kgrhuMAb Beta7或者 12次靜脈內和皮下劑量的載體后，外周血中組平均(士SD)⑶45RA+i3 7 +⑶4+淋巴細胞(絕 對計數，％BL)。圖7顯示了對獼猴給予12次皮下劑量的15或50mg/kg rhuMAb Beta7或者12次 靜脈內和皮下劑量的載體后，外周血中組平均(士SD)⑶45RA+i3 7 +⑶4+淋巴細胞(絕對計 數，％BL)。圖8顯示了施用rhuMAb Beta7四次每周靜脈內劑量的25mg/kgrhuMAb Beta7或 載體后外周血中記憶/效應“腸歸巢”⑶45RA-i3 7s⑶4+淋巴細胞計數的暫時增加(絕對 計數，％BL)。圖9 (A-D)顯示了血清rhuMAb Beta7濃度(微克/微升)和在CD45RA- β 7 S記憶 /效應⑶45RA-⑶4+外周血淋巴細胞上β 7受體的占據。圖IO(A-D)顯示了外周血中‘腸歸巢，⑶45RA_i3 7s記憶/效應⑶4+淋巴細胞的暫時增加與⑶45RA- β 7 s記憶/效應⑶4+淋巴細胞上β 7受體的占據相關。圖11顯示了 rhuMAb Beta7抑制淋巴細胞體內歸巢到CD45RBhigh_重構的SCID 小鼠的發(fā)炎的結腸而不是脾臟。圖12A和12B顯示了如下的可變輕鏈和重鏈序列的比對輕鏈人亞組κ I共有序列(圖12A，SEQ ID NO 23)，重鏈人亞組III共有序列 (FIG. 12B, SEQ ID NO :24)，大鼠抗小鼠 β 7 抗體(Fib504)可變輕鏈(圖 12A，SEQ ID NO 10)，大鼠抗小鼠β 7抗體(Fib504)可變重鏈(圖12B，SEQID NO :11)，和人源化抗體變體 人源化hu504K移植可變輕鏈(圖12A，SEQID NO :25)，人源化hu504K移植可變重鏈(圖 12B, SEQ ID NO 26)，變體 hu504. 5 (對于變體 hu504. 5，hu504. 16，和 hu504. 32，從人源化 hu504K移植物(graft)的氨基酸變異在圖12A(輕鏈)和圖12B重鏈)中指出。圖13顯示了 12次皮下或靜脈內劑量的載體后獼猴中⑶45RA-Beta7S記憶/效應 ⑶4+淋巴細胞(絕對計數，％ BL)。圖14顯示了 12次靜脈內劑量的5mg/kg rhuMAb Beta7后獼猴中CD45RA_Beta7高 記憶/效應⑶4+淋巴細胞(絕對計數，0Z0 BL)。圖15顯示了 12次靜脈內劑量的15mg/kg rhuMAb Beta7后獼猴中CD45RA_Beta7 S記憶/效應⑶4+淋巴細胞(絕對計數，0Z0 BL)。圖16顯示了 12次靜脈內劑量的50mg/kg rhuMAb Beta7后獼猴中CD45RA_Beta7 S記憶/效應⑶4+淋巴細胞(絕對計數，0Z0 BL)。圖17顯示了 12次皮下劑量的15mg/kg rhuMAb Beta7后獼猴中CD45RA_Beta7高 記憶/效應⑶4+淋巴細胞(絕對計數，0Z0 BL)。圖18顯示了 12次皮下劑量的50mg/kg rhuMAb Beta7后獼猴中CD45RA_Beta7高 記憶/效應⑶4+淋巴細胞(絕對計數，0Z0 BL)。圖19顯示了 12次靜脈內劑量的5，15，或50mg/kg rhuMAb Beta7或12次靜脈內和 皮下劑量的載體后獼猴中⑶45RA_i3 7 s⑶4+淋巴細胞(1 ^ [%基線]，組平均士 SD) ；MOEF =等量熒光的分子。圖20顯示了 12次皮下劑量的15或50mg/kg rhuMAb Beta7或12次靜脈內和皮 下劑量的載體后獼猴中⑶45RA_i3 7s⑶4+淋巴細胞(1 ^ [%基線]，組平均士SD)M0EF = 等量熒光的分子。圖21顯示了 12次靜脈內劑量的5，15，或50mg/kg rhuMAb Beta7或12次靜脈內和 皮下劑量的載體后獼猴中⑶45RA+i3 7Φ⑶4+淋巴細胞(1 ^ [%基線]，組平均士SD) ；MOEF =等量熒光的分子。圖22顯示了 12次皮下劑量的15或50mg/kg rhuMAb Beta7或12次靜脈內和皮 下劑量的載體后⑶45RA+i3 7Φ⑶4+淋巴細胞(1 ^ [%基線]，組平均士SD) ；MOEF =等量熒 光的分子。圖23顯示了對獼猴四次每周靜脈內推注劑量的5或25mg/kgrhuMAb β 7后 rhuMAb β 7的平均(士 SD)血清濃度。圖24顯示了對獼猴四次每周靜脈內推注劑量的25mg/kg rhuMAb β 7后來自4只 痊愈動物的實際平均(士SD)血清濃度和rhuMAb β 7的模型預測的血清濃度。圖25顯示了獼猴外周血中⑶4 T-細胞亞型。
圖26顯示了對獼猴四次每周靜脈內推注劑量的載體或5或25mg/kgrhuMAb β 7后 平均(士SD)絕對外周血⑶45RA_i3 7s⑶4+Τ-細胞計數(表示為預劑量(predose)基線的 百分數)。圖27顯示了對獼猴四次每周靜脈內推注劑量的載體或5或25mg/kgrhuMAb β 7后 平均(士SD)絕對外周血⑶45RA+i3 7 +⑶4+Τ-細胞計數(表示為預劑量基線的百分數)。圖28顯示了對獼猴四次每周靜脈內推注劑量的載體或25mg/kgrhuMAb β 7后個體 絕對外周血⑶45RA_i3 7s⑶4+Τ-細胞計數(表示為預劑量基線的百分數)。圖29顯示了對獼猴四次每周靜脈內推注劑量的載體，5或25mg/kgrhuMAbi3 7后平 均(士SD)絕對外周血淋巴細胞計數(表示為預劑量基線的百分數)。圖30顯示了對每組獼猴四次每周靜脈內推注劑量的5或25mg/kgrhuMAb β 7后平 均(士SD)絕對外周血CD3+T細胞計數(表示為預劑量基線的百分數)。圖31顯示了對每組獼猴四次每周靜脈內推注劑量的5或25mg/kgrhuMAb β 7后平 均(士SD)絕對外周血CD20+B細胞計數(表示為預劑量基線的百分數)。圖32Α顯示了四次每周施用靜脈內推注劑量的25mg/kg rhuMAb β 7后個體獼猴中 隨時間rhuMAb β 7的血清濃度和未占據的外周血細胞之間的關系(動 物 23)。圖32B顯示了四次每周施用靜脈內推注劑量的25mg/kg rhuMAb β 7后個體獼猴中 隨時間rhuMAb β 7的血清濃度和未占據的外周血細胞之間的關系(動 物 24)。圖32C顯示了四次每周施用靜脈內推注劑量的25mg/kg rhuMAb β 7后個體獼猴中 隨時間rhuMAb β 7的血清濃度和未占據的外周血細胞之間的關系(動 物 25)。圖32D顯示了四次每周施用靜脈內推注劑量的25mg/kg rhuMAb β 7后個體獼猴中 隨時間rhuMAb β 7的血清濃度和未占據的外周血細胞之間的關系(動 物 26)。圖33顯示了四次每周施用靜脈內推注劑量的25mg/kg rhuMAb β 7后個體獼猴中 隨時間rhuMAb β 7的血清濃度和未占據的外周血⑶4+β 7s⑶45RA_T細胞之間的關系。圖34A顯示了四次每周靜脈內推注劑量的25mg/kg rhuMAb β 7后個體獼猴中隨時 間絕對β 7s-表達記憶/效應(⑶45RA—)⑶4+T-細胞和未占據的外周血⑶4+β 7s⑶45RAT 細胞之間的關系(動物23)。圖34B顯示了四次每周靜脈內推注劑量的25mg/kg rhuMAb β 7后個體獼猴中隨時 間絕對β 7s-表達記憶/效應(⑶45RA—)⑶4+T-細胞和未占據的外周血⑶4+β 7s⑶45RAT 細胞之間的關系(動物24)。圖34C顯示了四次每周靜脈內推注劑量的25mg/kg rhuMAb β 7后個體獼猴中隨時 間絕對β 7s-表達記憶/效應(⑶45RA—)⑶4+T-細胞和未占據的外周血⑶4+β 7s⑶45RAT 細胞之間的關系(動物25)。圖34D顯示了四次每周靜脈內推注劑量的25mg/kg rhuMAb β 7后個體獼猴中隨時 間絕對β 7s-表達記憶/效應(⑶45RA—)⑶4+T-細胞和未占據的外周血⑶4+β 7s⑶45RAT 細胞之間的關系(動物26)。
圖35顯示了平均絕對外周血OM+β 7SCD45RA_T細胞計數。圖36顯示了平均絕對外周血細胞計數。圖37顯示了平均絕對外周血CD4+β 7 φ CD45RA—T細胞計數。圖38顯示了平均絕對外周血⑶8+β 7 φ⑶45RA—T細胞計數。圖39顯示了 rhuMab β 7的血清濃度和可用的β 7_表達外周血^4+0 7髙^45肌飛 細胞之間的關系。圖40顯示了 rhuMab β 7的血清濃度和可用的β 7_表達外周血^8+0 7髙^45肌飛 細胞之間的關系。優(yōu)選實施方案詳述I.定義如本文所用，關于患者應答或者患者應答性，術語“預測”在本文中用于指患者將 有利地或不利地應答一種藥物或一組藥物的可能性。在一個實施方案中，預測涉及那些應 答的程度。在一個實施方案中，預測涉及在治療，例如用特定治療劑，如抗β 7-整聯蛋白抗 體治療后患者將是否存活或改善和/或將存活或改善，并且在一定時間內無疾病復發(fā)的概 率。例如，本發(fā)明的預測方法可臨床上用于通過為任何具體患者選擇最合適的治療方式用 于做出治療決定。本發(fā)明的預測方法是有價值的工具，用于預測患者是否可能有利地應答 治療方案，包括例如，施用給定的治療劑或組合、手術介入、類固醇治療等等，或者治療方案 后患者的長期存活是否可能?！爸委煛敝概R床介入，其試圖改變被治療的個體或細胞的自然過程，并且可以為了 預防或者在臨床病理的過程中進行。希望的治療效果包括預防疾病的發(fā)生或復發(fā)、減輕癥 狀、減少疾病的任何直接或間接病理學結果，減低疾病發(fā)展速率，減輕或緩和疾病狀態(tài)，和 緩和或者改善的預后?！爸委煼桨浮敝竸┝?、施用頻率或治療持續(xù)時間、加入或不加入第二種藥物的組合?！坝行е委煼桨浮敝笇邮茉撝委煹幕颊咛峁┯幸鎽鸬闹委煼桨浮！案淖冎委煛敝父淖冎委煼桨?，包括改變劑量、施用頻率或治療持續(xù)時間，和/或加 入第二種藥物?！盎颊邞稹被颉盎颊邞鹦浴笨梢杂萌魏伪砻鲗颊叩囊嫣幍慕K點評估，所述益處 包括但不限于，(1)在一定程度上抑制疾病發(fā)展，包括減慢和完全阻止；(2)疾病發(fā)作次數 的減少和/或癥狀減輕；(3)損傷大小的減??；(4)疾病細胞向臨近外周器官和/或組織的 滲入的抑制(即減少、減慢或完全停止)；(5)疾病擴散的抑制(即減少、減慢或完全停止)； (6)自身免疫應答的減少，其可以但不是必須導致疾病損傷的退化或消融；(7)在一定程度 上減輕與該病癥相關的一種或多種癥狀；(8)增加治療后無疾病表象的長度；和/或(9)減 少治療后給定時間點的死亡率。術語“應答性”指可測量的應答，包括完全應答(CR)和部 分應答(PR)?！巴耆珣稹被颉癈R”意指應答治療，炎癥的所有病征消失或者緩和。這不總是指疾 病已經被治愈?！安糠謶稹被蛘摺癙R”指應答治療，炎癥的嚴重性降低至少50%?；颊邔φ摰鞍爪?7拮抗劑治療的“有益應答”和類似措辭指由于用拮抗劑如抗 β 7整聯蛋白抗體的治療，賦予有危險患有或者患有胃腸道炎性病癥的患者臨床的或者治療益處。此類益處包括細胞或生物學應答、完全應答、部分應答、穩(wěn)定的疾病(沒有發(fā)展或 復發(fā))，或者由于拮抗劑治療，患者具有較晚復發(fā)的應答。當患者的應答性在治療期間不隨時間降低時，“患者保持對治療的應答性”。術語“診斷”在本文中指分子或病理學狀態(tài)、疾病或狀況的鑒定或分類。例如，“診 斷”可以指通過組織/器官涉及(例如，炎性腸病)，或通過其他特征(例如，特征為對治 療，如對整聯蛋白β7拮抗劑的治療的應答性的患者亞群)對特定類型的胃腸道炎性病癥 鑒定，更具體地，特定亞型的胃腸道炎性病癥的分類。術語“預后”在本文中用于指預測疾病癥狀的可能性，如胃腸道炎性病癥的復發(fā)、 加劇和藥物抗性。本文所用的術語“樣品”指得自或來自目的受試者的組合物，其含有待例如基于物 理、生化、化學和/或生理學特征表征和/或鑒定的細胞和/或其他分子實體。例如，短語 “疾病樣品”和其變體指從目的受試者得到的任何樣品，將預期或已知其含有待表征的細胞 和/或分子實體。樣品可以得自目的受試者的組織或者受試者的外周血。“ β 7整聯蛋白拮抗劑”或者“ β 7拮抗劑”指抑制β 7整聯蛋白的一種或多種生 物活性或阻斷其與一種或多種其相關分子結合的任何分子。本發(fā)明的拮抗劑可以用于調節(jié) β 7相關的效果的一個或多個方面，包括但不限于與α 4整聯蛋白亞基的結合、與α E整聯 蛋白亞基的結合、α 4β 7整聯蛋白與MAdCAM，VCAM-I或纖連蛋白的結合，和α Εβ 7整聯蛋 白與E-鈣黏著蛋白的結合。這些效果可以通過任何生物學相關的機理調節(jié)，包括破壞配體 與β 7亞基或者與α4β7或αEβ 二聚體整聯蛋白的結合，和/或通過破壞α和β整聯 蛋白亞基之間的結合，使得二聚體整聯蛋白的形成被抑制。在本發(fā)明的一個實施方案中， β 7拮抗劑是抗β 7整聯蛋白抗體(或抗β 7抗體)。在一個實施方案中，抗β 7整聯蛋白 抗體是人源化抗_ β 7整聯蛋白抗體，更具體地，重組人源化單克隆抗_ β 7抗體(或rhuMAb β7)。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗_β7抗體是抗-整聯蛋白β7拮抗抗體，其抑制或 阻斷β7亞基與α4整聯蛋白亞基的結合，與αΕ整聯蛋白亞基的結合，α4β7整聯蛋白 與MAdCAM，VCAM-I或纖連蛋白的結合，和α Εβ 7整聯蛋白與E-鈣黏著蛋白的結合?！?β 7亞基〃或〃.β. 7亞基〃指人.β. 7整聯蛋白亞基(Erie et al.， (1991)J. Biol. Chem. 266 :11009-11016)。β 7 亞基與 α 4 整聯蛋白亞基，如人.α . 4 亞基 (KiIger and Holzmann(1995) J. Mol. Biol. 73 :347_354)結合。據報導 α 4β 7 整聯蛋白在 多數成熟淋巴細胞，以及少數群體的胸腺細胞、骨髓細胞和肥大細胞上表達(Kilshaw and Murant (1991)Eur. J. Immunol. 212591-2597 ；Gurish et al.，(1992) 149 1964-1972 ；和 Shaw, S. K. and Brenner, Μ. B. (1995) Semin. Immunol. 7 335)。β 7 亞基也與 α E 亞基，如人 α E 整聯蛋白亞基結合(C印ek，K. L，et al. (1993) J. Immunol. 150 3459) α E β 7 整聯蛋 白在腸內上皮淋巴細胞(iIELs)上表達(Cepek, K. L. (1993)同上)?！?αΕ亞基〃或〃 αΕ整聯蛋白亞基〃或〃 .α.E亞基〃或〃 .α.E整聯蛋白 亞基〃或〃⑶103"指發(fā)現與上皮內淋巴細胞上的β 7整聯蛋白結合的整聯蛋白亞基， 所述α Εβ 7整聯蛋白介導iELs與表達E-鈣黏著蛋白的腸上皮的結合(C印ek，K. L. et al. (1993) J. Immunol. 150 3459 ；Shaw, S. K. and Brenner, Μ. B. (1995) Semin. Immunol. 7 335)?！?MAdCAM"或〃 MAdCAM-I 〃在本發(fā)明上下文中可互換使用并且指蛋白質粘膜地址素細胞粘附分子-1，其是單鏈多肽，包含短胞質尾區(qū)、跨膜區(qū)和由三個免疫球蛋白樣結 構域組成的細胞外序列。已經克隆了小鼠、人和獼猴MAdCAM-I的CDNA(Briskin，et al., (1993)Nature, 363 461-464 ；Shyjan et al.，(1996)J. Immunol. 156 :2851_2857)?！?VCAM-I “或〃血管細胞粘附分子-1" “ CD106"指α 4 β 7禾口 α4β1的配體， 在活化的內皮上表達并且在內皮-白細胞相互作用，如炎癥期間白細胞的結合和移行中是 重要的?！阿?5”指蛋白質酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的蛋白質。已知PTP是信號分子， 其調節(jié)多種細胞過程，包括細胞生長、分化、有絲分裂周期，和致癌性轉化。該PTP含 有細胞外結構域、單跨膜區(qū)段和兩個串聯胞質內催化結構域，從而屬于受體型ΡΤΡ。該 基因在造血細胞中特異表達。已經表明該PTP是T和B細胞抗原受體信號轉導的基 本調節(jié)子。它通過與抗原受體復合體的組分直接相互作用，或者通過活化抗原受體信 號轉導所需的多種Src家族激酶發(fā)揮功能。該PTP也抑制JAK激酶，從而作為細胞因 子受體信號轉導的調節(jié)子發(fā)揮功能。已經報導了該基因的四種選擇性剪接轉錄物變 體，其編碼不同的同種型(Tchilian EZ, Beverley PC(2002). “ CD45in memory and disease. " Arch. Immunol. Ther. Exp. (ffarsz. )50(2) :85_93. Ishikawa H, Tsuyama N, Abroun S,et al. (2004). " Interleukin-6,CD45 andthe src-kinases in myeloma cell proliferation. " Leuk. Lymphoma 44(9) :1477_81)0存在CD45 的多種同種型CD45RA，CD45RB, CD45RC, CD45RAB，CD45RAC，CD45RBC, ⑶45R0，⑶45R(ABC)。⑶45也是高度糖基化的。⑶45R是最長的蛋白質并且當從T細胞分 離時遷移到200kDa。B細胞也表達具有較高糖基化的⑶45R，使得分子量達到220kDa，所以 名為B220 ；為220kDa的B細胞同種型。B220表達不局限于B細胞，并且也可以在活化的T 細胞上、在樹突細胞的亞群(subset)和其他抗原呈遞細胞上表達。Stanton Τ, Boxall S， Bennett A, et al. (2004). " CD45 variant alleles :possibIyincreased frequency of a novel exon 4 CD45 polymorphism in HlVseropositive Ugandans. " Immunogenetics 56(2) :107-10o“腸歸巢淋巴細胞”指淋巴細胞的亞群(subgroup)，其具有選擇性歸巢到腸淋巴結 和組織但是不歸巢到外周淋巴結和組織的特征。該亞群的淋巴細胞的特征是多種細胞表 面分子組合的獨特表達模式，包括但不限于，⑶4，⑶45RA和Beta7的組合。典型地，至少兩
個亞群的外周血CD4+淋巴細胞可以基于CD45RA和Beta7，CD45RA- β 高，和CD45RA- β 低
⑶4+細胞的標記細分。⑶45RA— β7Λ⑶4+細胞優(yōu)先歸巢到腸淋巴結和組織，而⑶45RA— β/6
CD4+細胞優(yōu)先歸巢到外周淋巴結和組織(Rott etal. 1996 ；Rott et al. 1997 ；Williams et al. 1998 ；Roseet al. 1998 ；Williams andButcher 1997 ；Butcher et al. 1999)。腸歸巢淋
巴細胞因此是在流式細胞術測定法中被鑒定為⑶45RA— β7 ⑶4+的不同的亞群淋巴細胞。
鑒定該組淋巴細胞的方法是本領域公知的并且也詳細公開在本申請的實施例中。如本文關于細胞表面標記所用的，符號“ + ”指出細胞表面標記的陽性表達。例如， ⑶4+淋巴細胞是在它們的細胞表面上表達⑶4的一組淋巴細胞。如本文關于細胞表面標記所用的，符號“_”指出細胞表面標記的陰性表達。例如， ⑶45RA_淋巴細胞是在它們的細胞表面上不表達⑶45RA的一組淋巴細胞。
如本文關于細胞表面標記的表達所用的，符號“低”指出在淋巴細胞上細胞表面標 記的相對低水平的表達，而“高”指出在淋巴細胞上細胞表面標記的相對高水平的表達。在
流式細胞術中，β7 的強度高于β7 κ至少約 ο或loo倍。從而，如示例性實施方案中提供
的，⑶45RA— β7 ⑶4+和⑶45RA— β7高⑶4+淋巴細胞定位于流式細胞術分析的點圖或者直
方圖的不同部分，其中X軸是⑶45AR表達的強度，Y軸是Β7表達的強度?！巴庵軞w巢淋巴細胞”指淋巴細胞亞群，其具有歸巢到外周淋巴結和組織并且不歸 巢到腸淋巴結和組織的特征。在示例性實施方案中，如上面解釋，外周歸巢淋巴細胞是在流 式細胞術測定中被鑒定為⑶45RA_ β7 δ⑶4+細胞的特征性的一組淋巴細胞。鑒定該組淋巴 細胞的方法是本領域公知的并且在本申請中詳細公開。使用本領域已知的方法可以確定生物標記的“量”或“水平”。例如，在示例性實 施方案中，與患者對整聯蛋白β 7拮抗劑的治療的應答性相關的腸歸巢淋巴細胞的“量”或 “水平”是在生物樣品，優(yōu)選在外周血樣中可檢測的水平。腸歸巢淋巴細胞的量可通過本領 域技術人員已知的和本發(fā)明中公開的方法，如流式細胞術分析定量。在一些實施方案中，將生物標記的“升高”或“增加”量或水平與生物標記的參考/ 比較量進行比較。作為參考或比較量的值的函數，增加優(yōu)選大于約10%、優(yōu)選大于約30%、 優(yōu)選大于約50 %、優(yōu)選大于約100 %、優(yōu)選大于約300 %。例如，參考或比較量可以是治療前 生物標記的量，更具體地，可以是基線或者預劑量的量。例如，在一個實施方案中，腸歸巢淋巴細胞的“量”或“水平”表示淋巴細胞的數目 足夠增加使得本領域技術人員將認為在所述值測量的生物學特征的上下文內，增加是統(tǒng)計 學顯著的。作為淋巴細胞的參考/比較量的值的函數，增加優(yōu)選大于約10%、優(yōu)選大于約 30%、優(yōu)選大于約50%、優(yōu)選大于約100%、優(yōu)選大于約300%。在一些實施方案中，生物標記的“降低的”量或水平是與生物標記的參考/比較量 比較的。作為參考或比較量的值的函數，降低優(yōu)選小于約10%、優(yōu)選小于約30%、優(yōu)選小于 約50%、優(yōu)選小于約100%、優(yōu)選小于約300%。例如，參考或比較量可以是治療前生物標記 的量，尤其可以是基線或者預劑量的量。例如，“有效增加腸歸巢淋巴細胞的量的治療”指足夠增加淋巴細胞數目的治療， 使得本領域技術人員將認為所述增加在所述值度量的生物學特征的背景中是統(tǒng)計學顯著 的。作為治療前淋巴細胞的參考或比較量的值的函數，增加優(yōu)選大于約10%、優(yōu)選大于約 30%、優(yōu)選大于約50%、優(yōu)選大于約100%、優(yōu)選大于約300%。如本文所用的短語“不實質性改變”指輕微程度的改變，使得本領域技術人員將不 認為所述改變在所述值(如淋巴細胞的量)度量的生物學特征的背景中是統(tǒng)計學顯著的。 改變優(yōu)選小于約10%、優(yōu)選小于約5%、優(yōu)選小于約1%?！拔改c道炎性病癥"是一組慢性病征，其引起粘膜中的炎癥和/或潰瘍。這些 病癥包括例如，炎性腸病(例如，局限性回腸炎、潰瘍性結腸炎、不定結腸炎和傳染性結腸 炎)、粘膜炎(mucositis)(如口腔粘膜炎(oralmucositis)，胃腸道粘膜炎，鼻粘膜炎和直 腸炎)，壞死性小腸結腸炎(necrotizing enterocolitis)和食管炎(esophagitis)。在優(yōu) 選實施方案中，胃腸道炎性病癥是炎性腸病?！把仔阅c病”或“IBD”在本文中可互換使用，指腸的疾病，其引起炎癥和/或潰瘍并且包括但不限于局限性回腸炎和潰瘍性結腸炎?！熬窒扌曰啬c炎(CD) ”或“潰瘍性結腸炎(UC) ”是未知病因的慢性炎性腸病。不像 潰瘍性結腸炎，局限性回腸炎可以影響腸的任何部分。局限性回腸炎的最顯著特征是腸壁 的粒狀、淡紅_紫色edmatous增厚。隨著炎癥的發(fā)展，這些肉芽腫通常喪失其被限制的邊 界并且與周圍組織整合。腹瀉和腸的阻塞是顯著的臨床特征。隨著潰瘍性結腸炎，局限性 回腸炎的過程可以是連續(xù)的或復發(fā)的，輕微的或嚴重的，但是不像潰瘍性結腸炎，局限性回 腸炎不能通過腸的有關節(jié)段的切除治愈。多數局限性回腸炎患者需要在某個點手術，但是 隨后的復發(fā)是常見的并且通常需要連續(xù)的藥物治療。局限性回腸炎可涉及從嘴到肛門的消化道的任何部分，盡管通常其出現在回腸結 腸、小腸或結腸_肛門直腸區(qū)域。組織病理學上，該疾病表現為不連續(xù)的granulomatomas、 隱窩膿腫、龜裂和口瘡潰瘍。炎癥性浸潤物是混合的，由淋巴細胞(T和B細胞)、漿細胞、巨 噬細胞和嗜中性粒細胞組成。在分泌IgM-和IgG的漿細胞、巨噬細胞和嗜中性粒細胞中有 不成比例的增加?？寡装Y藥物柳氮磺吡啶和5-氨基水楊酸(5-ASA)可用于治療輕度活性的結腸局 限性回腸炎并且通常被建議保持該疾病的緩和。Metroidazole和環(huán)丙沙星的功效與柳氮磺 吡啶相似并且似乎尤其可用于治療肛周疾病。在更嚴重的病例中，皮質類固醇可有效治療 活性惡化并且可以甚至保持緩和。硫唑嘌呤(azathioprine)和6_巰基嘌呤已經在需要長 期施用皮質類固醇的患者中顯示出成功。還可能的是這些藥物在長期預防中起作用。不幸 的是，在一些患者中發(fā)揮作用前，存在非常長的延遲(長達六個月)?？垢篂a藥物也可以在 一些患者中提供癥狀減輕。營養(yǎng)療法或要素膳食可以改進患者的營養(yǎng)狀態(tài)并且誘導急性疾 病的癥狀改善，但是它不誘導持續(xù)的臨床緩和?？股赜糜谥委熇^發(fā)性小腸細菌過度生長 和治療化膿性并發(fā)癥?！皾冃越Y腸炎(UC) ”折磨大腸。該疾病的過程可以是持續(xù)的或復發(fā)的、輕微的或 嚴重的。最早的損傷是炎性浸潤，在腸腺(crypts of Lieberkuhn)基部形成膿腫。這些膨 脹的和破裂的隱窩的合并傾向于分離覆蓋的粘膜與其血液供應，導致潰瘍形成。該疾病的 癥狀包括腹部絞痛、下腹痛、直腸出血，和經常的稀的排泄物，其主要由血液、膿和粘液與極 少的糞便顆粒組成。急性、嚴重或慢性的持續(xù)性潰瘍性結腸炎可能需要全結腸切除術。UC的臨床特征是高度可變的，并且發(fā)作可以是隱伏的或突然的，并且可以包括腹 瀉、里急后重和復發(fā)性直腸出血?？赡馨l(fā)生整個結腸的爆發(fā)性累及、中毒性巨結腸、危及生 命的緊急狀況。腸外表現包括關節(jié)炎、pyoderma gangrenoum、葡萄膜炎和結節(jié)性紅斑.UC的治療包括用于輕微病例的柳氮磺吡啶和相關含水楊酸的藥物，在嚴重病例中 使用皮質類固醇藥物。水楊酸類藥或者皮質類固醇的局部使用在有時是有效的，尤其當疾 病局限于末端腸時，并且與全身性使用相比與降低的副作用有關。有時表示需要支持性措 施，如施用鐵和抗腹瀉劑。硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤和甲氨蝶呤有時也被建議用于頑固性皮質 類固醇依賴性病例。“有效劑量”指在必要的劑量和時間內，有效實現希望的治療或預防結果的量。本文使用的術語“患者”指想得到治療的任何單個動物，更優(yōu)選哺乳動物(包括此 類非人動物，如狗、貓、馬、兔、動物園動物、奶牛、豬、綿羊和非人靈長類)。最優(yōu)選地，本文的 患者是人。
術語“非人受試者”指任何單個非人動物，更優(yōu)選哺乳動物(包括此類非人動物， 如狗、貓、馬、兔、動物園動物、奶牛、豬、綿羊和非人靈長類)。術語“抗體”和“免疫球蛋白”以在最寬的意義上可互換使用，并且包括單克隆抗體 (例如，全長或完整的單克隆抗體)、多克隆抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性 抗體，只要它們顯示出希望的生物學活性)，并且也可以包括某些抗體片段(如本文更詳細 描述)。抗體可以是人、人源化的和/或親和力成熟的。“抗體片段”包括完整抗體的僅僅一部分，其中該部分優(yōu)選保留與該部分存在于完 整抗體中時通常相關功能的至少一種，優(yōu)選多數或全部。在一個實施方案中，抗體片段包含 完整抗體的抗原結合部位從而保持結合抗原的能力。在另一實施方案中，抗體片段，如包含 Fc區(qū)的抗體片段保留通常與該Fc區(qū)存在于完整抗體時相關的生物學功能的至少一種，如 FcRn結合、抗體半壽期調節(jié)、ADCC功能和補體結合。在一個實施方案中，抗體片段是單價抗 體，其具有基本上類似于完整抗體的體內半壽期。例如，此類抗體片段可以包含與能夠賦予 該片段的體內穩(wěn)定性的Fc序列連接的抗原結合臂。本文使用的術語“單克隆抗體”指從基本上同質性抗體群體得到的抗體，所述同質 性抗體即包含除了以少量存在的可能的天然發(fā)生突變之外相同群體的各抗體。單克隆抗體 是高度特異的，針對單一抗原。此外，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多 克隆抗體制劑相比，每種單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。本文的單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來自 特定物種或屬于特定抗體類別或亞類的抗體中對應序列相同或同源，鏈的剩余部分與來自 另一物種或屬于另一抗體類別或亞類的抗體中對應序列相同或同源，以及此類抗體的片 段，只要它們顯示出希望的生物活性(美國專利號4，816，567 ；和Morrison et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA81 :6851_6855(1984))。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式是含有來自非人免疫球蛋白的最小序列的 嵌合抗體。通常，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的高變區(qū)的殘基 被來自非人物種(供體抗體)如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物的高變區(qū)的殘基替換，所 述抗體具有希望的特異性、親和力和能力。在一些情況下，人免疫球蛋白的構架區(qū)(FR)殘 基被對應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可以包含在受體抗體或供體抗體中沒有發(fā)現 的殘基。進行這些修飾以進一步改良抗體性能。通常，人源化抗體將包含基本上所有的至 少一個、通常兩個可變結構域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應于非人免疫球蛋白的那 些高變環(huán)，并且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的那些FR。人源化抗體任選將 也包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，典型地為人免疫球蛋白的恒定區(qū)。關于進一步 的細節(jié)，見 Jones et al.，Nature 321 :522_525 (1986) ；Riechmann et al.，Nature332 323-329 (1988)；和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596 (1992)。也參見下面的綜述 文章禾口其中弓I用的參考文獻:Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 105-115(1998) ；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23 1035-1038 (1995) ；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5 :428_433(1994)?！叭丝贵w”是這樣的抗體，其包含對應于人產生的抗體的氨基酸序列或者使用本 文公開的任一種制備人抗體的技術制備。此類技術包括篩選人來源的組合文庫，如噬菌 體展示文庫(見，例如，Marks et al.，J. Mol. Biol.，222 :581_597 (1991)和 Hoogenboomet al.，Nucl. Acids Res.，19 :4133_4137 (1991))；使用人骨髓瘤和小鼠-人雜骨髓瘤細 胞系產生人單克隆抗體(見，例如，Kozbor J. Immunol. ,133 =3001(1984) ；Brodeur et al. , Monoclonalantibody Production Techniques and Applications, pp.55-93 (Marcel Dekker, Inc.，New York, 1987)；禾口 Boerner et al.，J. Immunol.，147 86(1991))；禾口在轉 基因動物(例如，小鼠)中產生單克隆抗體，所述轉基因動物能夠在不存在內源免疫球蛋 白產生的情況下產生人抗體的全部組成成分(見，例如，Jakobovits et al.，Proc. Natl. Acad. Sci USA,90 2551 (1993) Jakobovitset al. ， Nature, 362255(1993) ；Bruggermann et al. , Year in Immunol.，7 :33 (1993))。該人抗體的定義特別排除包含來自非人動物的 抗原結合殘基的人源化抗體?！胺蛛x的”抗體是已經被鑒定并分離和/或從其天然環(huán)境的組分回收的抗體。它 的天然環(huán)境的污染性組分是將干擾該抗體的診斷或治療用途的物質，并且可以包括酶、激 素和其他蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在優(yōu)選實施方案中，抗體將被純化到(1)如 通過Iowry方法測定，按抗體的重量計大于95%，并且最優(yōu)選按重量計大于99%，(2)通過 使用旋轉杯序列分析儀測定，足夠得到N-末端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度， 或(3)通過SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用考馬斯藍或者優(yōu)選使用銀染測定為同質 性。分離的抗體包括在重組細胞中的原位抗體，因為抗體的天然環(huán)境的至少一種組分將不 存在。然而，通常，將通過至少一個純化步驟制備分離的抗體。術語“高變區(qū)”、“HVR,“或"HV，“當用于本文時，指抗體可變結構域的在序 列上高變和/或形成結構上確定的環(huán)的區(qū)域。通常，抗體包含六個高變區(qū)；三個在VH(H1， H2，H3)中，三個在VL(L1，L2，L3)中。許多高變區(qū)描述在使用中并且被包括在本文中。 Kabat互補決定區(qū)(CDR)是基于序列變異性并且是最常用的(Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunologicallnterest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。而 Chothia 涉及結構環(huán)的位置(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196 :901_917 (1987))。AbM 高變區(qū)代表 Kabat CDRs 和 Chothia 結 構環(huán)之間的折衷，并且被Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件使用?！敖佑|”高變區(qū)是基 于可用的復雜晶體結構的分析。在下面指出了來自這些HVR的每一個的殘基。環(huán) KabatAbMChothia 接觸_LlL24-L34L24-L34L26--L32L30-L36
L2L50-L56L50-L56L50--L52L46-L55
L3L89-L97L89-L97L91--L96L89-L96
HlH31-H35BH26-H35BH26--H32H30-H35B (Kabat 編號)
HlH31-H35H26-H35H26--H32H30-H35 (Chothia 編號)
H2H50-H65H50-H58H53--H55H47-H58
H3H95-H102H95-H102H96--HlOlH93-H101
高變區(qū)可以包含如下的“延伸的高變區(qū)，， VL 中的 24-36 或 24-34 (Li)，46-56 或 49-56 或 50-56 或 52-56 (L2)和 89-97 (L3) 和 VH 中的 26-35 (Hl)，50-65 或 49-65 (H2)和 93-102，94-102 或 95-102 (H3)。對于這些定 義的每一個，可變結構域殘基根據Kabat等(上文)編號。
“構架”或“FR”殘基是除了如本文定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變結構域殘基?！叭斯灿袠嫾堋笔谴碓谝唤M(a selection of)人免疫球蛋白VL或VH構架序列 中最通常發(fā)生的氨基酸殘基的構架。通常，該組人免疫球蛋白VL或VH序列來自可變結構 域序列的亞型。通常，該序列亞型是如Kabat等中的亞型。在一個實施方案中，對于VL，該 亞型是如Kabat等中的亞型kappa I。在一個實施方案中，對于VH，該亞型是如Kabat等中 的亞型III。“親和力成熟的”抗體是在其一個或多個CDR中具有一個或多個改變的抗體，與不 具有那些改變的親本抗體相比，所述改變導致抗體對抗原的親和力的提高。優(yōu)選的親和力 成熟的抗體將對靶抗原具有納摩爾或甚至皮摩爾的親和力。通過本領域已知的方法產生親 和力成熟的抗體。Marks et al. Bio/Technology 10 :779_783 (1992)描述了通過 VH和 VL結 構域改組進行親和力成熟。Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci,USA 91:3809-3813(1994)； Schier et al.Gene 169 147-155 (1995) ；Ye1 ton et al. J. Immuno1.155 1994-2004(1995) Jackson et al. , J. Immunol. 154(7) :3310_9 (1995)；禾口 Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226 =889-896 (1992)描述了 CDR和/或構架殘基的隨機誘變。如本文使用的短語“基本上相似的”或“基本上相同的”表示兩個數值之間足夠高 度的相似性(通常一個與本發(fā)明的抗體有關，另一個與參考/比較抗體有關)，使得本領域 技術人員將認為在所述值測量的生物學特征背景中，所述兩個值之間的差異有很小的或者 沒有生物學和/或統(tǒng)計學顯著性(例如，Kd值)。作為參考/比較抗體的值的函數，所述兩 個值之間的差異優(yōu)選小于約50%、優(yōu)選小于約40%、優(yōu)選小于約30%、優(yōu)選小于約20%、優(yōu) 選小于約10%?！敖Y合親和力” 一般指分子(例如抗體)的單個結合位點和其結合配偶體(例如， 抗原)之間非共價相互作用的總和的強度。除非指出相反，本文所用的“結合親和力”指內 在的結合親和力，其反映了結合對(例如抗體和抗原)的成員之間的1 1相互作用。分 子X對其配偶體Y的親和力一般可通過解離常數(Kd)代表。親和力可以通過本領域公知 的方法，包括本文描述的那些方法測量。低親和力抗體一般緩慢結合抗原并且傾向于容易 解離，而高親和力抗體一般更快地結合抗原并且傾向于保持更長久的結合。多種測量結合 親和力的方法是本領域已知的，其任一種可用于本發(fā)明的目的。術語“可變的”指如下事實在多種抗體之間，可變結構域的某些部分的序列差別 很大，并且用于每種具體抗體對其具體抗原的結合和特異性。然而，可變性不是均勻分布在 抗體的可變結構域各處。它聚集在輕鏈和重鏈可變結構域中稱作高變區(qū)的三個區(qū)段中。可 變結構域的更高度保守的部分稱作構架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四 個FR，大部分采取β片層構型，通過三個高變區(qū)連接，它們形成環(huán)連接，在一些情況下，形 成β片層結構的一部分。每條鏈中的高變區(qū)通過FR緊密維持在一起，并且與來自其他鏈的 高變區(qū)一起，促進了形成抗體的抗原結合位點(見Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結合，但是顯示出多種效 應功能，如抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)?？贵w的木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱作“Fab”片段，每個具有 單個抗原結合位點，和殘留的“Fe”片段，其名稱反映了其能夠容易地結晶。胃蛋白酶處理產生了 F(ab' )2片段，其具有兩個抗原結合位點并且仍然能夠交聯抗原?！癋v”是含有完整的抗原識別和抗原結合位點的最小抗體片段。該區(qū)域由一條重鏈 和一條輕鏈可變結構域緊密的非共價結合形成的二聚體組成。在該構型中，每個可變結構 域的三個高變區(qū)相互作用以在二聚體的表面上確定抗原結合位點。這六個高變區(qū)共 同賦予抗體的抗原結合特異性。然而，即使單個可變結構域(或者包含僅僅對抗原特異的 三個高變區(qū)的Fv的一半)也具有識別和結合抗原的能力，盡管結合親和力低于完整的結合 位點。Fab片段也含有輕鏈的恒定結構域和重鏈的第一個恒定結構域(CHl)。Fab =片 段與Fab片段的不同之處是在重鏈CHl結構域的羧基末端加了一些殘基，包括來自抗體鉸 鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab' -SH是本文中對Fab'的名稱，其中恒定結構域的半胱 氨酸殘基帶有至少一個游離巰基。F(ab' )2抗體片段最初作為一對Fab'片段產生，所述 Fab'片段在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸。抗體片段的其他化學偶聯也是已知的。來自任何脊椎動物物種的抗體的“輕鏈”可以基于它們恒定結構域的氨基酸序列 歸屬于兩個明顯不同類型(稱作κ和λ)之一。取決于它們的重鏈恒定結構域的氨基酸序列，抗體(免疫球蛋白)可以歸屬于不 同類別。有五種主要類別的免疫球蛋白IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，這些類別的一些可以進 一步分為亞類(同種型)，例如，IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1JP IgA2。對應于免疫球蛋白的 不同類別的重鏈恒定結構域分別稱作α，δ，ε，Y和μ。不同類別的免疫球蛋白的亞基結 構和三維構型是公知的并且一般描述于例如Abbas et al. Cellular and Mo 1. Immunology， 4th ed. (W. B. Saunders, Co.，2000)?？贵w可以是更大的融合分子的一部分，所述融合分子 通過該抗體與一種或多種其他蛋白質或肽的共價或非共價結合形成。術語“全長抗體”、“完整抗體”和“全抗體”在本文中可互換使用，表示其基本上完 整形式的抗體，不是下面定義的抗體片段。這些術語尤其指具有含Fc區(qū)的重鏈的抗體。對于本文的目的，“裸抗體”是不綴合到細胞毒性部分或者放射性標記的抗體。本文使用的術語“Fe區(qū)”用于定義免疫球蛋白重鏈的C-末端區(qū)，包括天然序列Fc 區(qū)和可變Fc區(qū)。盡管免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)的邊界可變，但是人IgG重鏈Fc區(qū)通常被 定義為從Cys226或從Pro230位的氨基酸殘基延伸到其羧基末端。Fc區(qū)的C-末端賴氨酸 (根據EU編號系統(tǒng)的殘基447)可以例如在抗體的生產或純化期間去除，或者通過重組改造 編碼抗體的重鏈的核酸去除。因此，完整抗體的組成可以包含去除了所有K447殘基的抗體 群體、沒有去除K447殘基的抗體群體，和具有攜帶和沒有攜帶K447殘基的抗體的混合物的 抗體群體。除非指出相反，本文中免疫球蛋白重鏈中殘基的編號是如Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)(明確引入本文作為參考)中的 EU 索引編號?！叭鏚abat中的EU索引”指人IgGl EU抗體的殘基編號?！肮δ蹻c區(qū)”具有天然序列Fc區(qū)的“效應功能”。示例性“效應功能”包括Clq結 合、補體依賴性細胞毒性、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、吞噬作 用、細胞表面受體(例如，B細胞受體、BCR)的下調，等等。此類效應功能一般需要Fc區(qū)與 結合結構域(例如，抗體可變結構域)組合并且可以例如使用如本文公開的多種測定法評估。“天然序列Fc區(qū)”包含與自然中發(fā)現的Fc區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天 然序列人Fc區(qū)包括天然序列人IgGlFc區(qū)(非A和A同種異型)；天然序列人IgG2Fc區(qū)； 天然序列人IgG3Fc區(qū)；和天然序列人IgG4Fc區(qū)以及其天然存在的變體。“可變Fc區(qū)”包含由于至少一個氨基酸修飾，優(yōu)選一個或多個氨基酸取代而不同于 天然序列Fc區(qū)的氨基酸序列。優(yōu)選地，可變Fc區(qū)與天然序列Fc區(qū)或者與親本多肽的Fc 區(qū)相比具有至少一個氨基酸取代，例如，在天然序列Fc區(qū)或者親本多肽的Fc區(qū)中約1到約 10個氨基酸取代，優(yōu)選約1到約5個氨基酸取代。本文的變體Fc區(qū)將優(yōu)選具有與天然序列 Fc區(qū)和/或者與親本多肽的Fc區(qū)至少約80%同源性，最優(yōu)選地，與其至少約90%同源性， 更優(yōu)選與其至少約95%同源性。取決于它們重鏈恒定結構域的氨基酸序列，完整抗體可以歸屬于不同的“類別”。 有五種主要類別的完整抗體IgA，IgD, IgE, IgG，和IgM，這些類別的一些可以進一步分為 亞類(同種型)，例如，IgGl, IgG2，IgG3，IgG4，IgA,和IgA2。對應于抗體的不同類別的重 鏈恒定結構域分別稱作α，δ，ε，Y和μ。不同類別的免疫球蛋白的亞基結構和三維構 型是公知的?！翱贵w依賴性細胞介導的細胞毒性”和“ADCC”指細胞介導的反應，其中表達Fc 受體(FcRs)的非特異性細胞毒性細胞(例如，自然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬 細胞)識別靶細胞上結合的抗體并隨后引起靶細胞的裂解。介導ADCC的主要細胞NK細 胞僅僅表達Fc γ RIII，而單核細胞表達Fc γ RI，FcyRII和FcyRIII。造血細胞上FCR 表達在 Ravetch andKinet, Annu. Rev. Immunol 9 :457_92 (1991)的第 464 頁上表 3 中概 述。為了評估目的分子的ADCC活性，可以進行體外ADCC測定法，如美國專利號5，500, 362 或5，821，337中所述。此類測定法的有用的效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和自 然殺傷(NK)細胞。備選地或額外地，可以在體內，例如如Clynes et a 1. PNAS (USA) 95 652-656 (1998)中公開的動物模型中評估目的分子的ADCC活性?！叭诵毎笔潜磉_一種或多種FcRs并且執(zhí)行效應功能的白細胞。優(yōu)選地，所述 細胞表達至少Fc γ RIII并且執(zhí)行ADCC效應功能。介導ADCC的人白細胞的實例包括外周血 單核細胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞；PBMCs 和NK是優(yōu)選的。效應細胞可以從其天然來源分離，如從血液或本文所述的PBMC分離。術語“Fe受體”或“FcR”用于描述結合到抗體的Fc區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是天然 序列人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是結合IgG抗體(一種γ受體)的FcR并且包括Fc YRI， Fc γ RII和Fc γ RIII亞類的受體，包括等位變體和這些受體的選擇性剪接形式。FcyRII 受體包括FcyRIIA("活化受體")和FCYRIIB("抑制受體")，其具有相似氨基酸序 列，主要在其胞質結構域中不同?；罨荏wFc y RIIA在其胞質結構域中含有基于免疫受 體酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體Fc γ RIIB在其胞質結構域中含有基于免疫受體酪 氨酸的抑制基序(ITIM)(見 M. in DaSron, Annu. Rev. Immunol. 15 :203_234 (1997)中的綜 述)。FcRs 在 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991) ；Capel et al., Immunomethods 4:25—34(1994)；禾口 de Haas et al. , J. Lab. Clin. Med. 126 330-41 (1995) 中綜述。本文的術語“FcR”包括其他FcRs，包括在將來鑒定的那些FcRs。該術語還包 括新生兒受體FcRn，其負責將母親IgG轉移到胎兒(Guyer et al. , J. Immunol. 117 587(1976)和 Kim et al.，J. Immunol. 24 :249 (1994))，并調節(jié)免疫球蛋白的內穩(wěn)態(tài)。在 W000/42072(Presta，L.)和US2005/0014934A1 (Hinton et al.)中描述了對新生兒Fc 受體 (FcRn)具有改進的結合和延長的半壽期的抗體。這些抗體包含其中具有一個或多個取代 的Fc區(qū)，所述取代改善了 Fc區(qū)與FcRn的結合。例如，Fc區(qū)可以在238，250，256，265，272， 286，303，305，307，311，312，314，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424，428 或 434的一個或多個位置(殘基的Eu編號)上具有取代。優(yōu)選的具有改善的FcRn結合的包 含Fc區(qū)的抗體變體在其Fc區(qū)的位置307，380和434的一個、兩個或三個位置上包含氨基 酸取代(殘基的Eu編號)?！皢捂淔v”或“scFv”抗體片段包含抗體的V1^Pt結構域，其中這些結構域存在 于單條多肽鏈中。優(yōu)選地，Fv多肽還包含V1^Pt結構域之間的多肽接頭，其使得scFv 能夠形成抗原結合所需的結構。scFv的綜述見PlUckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg禾口 Moore 編著，Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)。HER2 抗體 scFv 片段描述于 W093/16185 ；美國專利號 5，571，894 ；和美 國專利號5，587,458。術語“雙抗體”指具有兩個抗原結合位點的小抗體片段，所述片段包含連接到相同 多肽鏈中的可變輕結構域的可變重結構域(Vh) (Vh-VJ。通過使用太短而允許兩個結 構域在相同鏈上配對的接頭，迫使結構域與另一鏈的互補結構域配對并產生兩個抗原結合 位點。雙抗體更完全描述于例如EP 404, 097 ；WO 93/11161 ；和Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :6444_6448(1993)?！坝H和力成熟的”抗體是在其一個或多個高變區(qū)中具有一個或多個改變的抗體，所 述改變導致與不具有那些改變的親本抗體相比，抗體對抗原的親和力提高。優(yōu)選的親和力 成熟的抗體將對靶抗原具有納摩爾甚至皮摩爾親和力。通過本領域已知的方法產生親和力 成熟的抗體。Marks et al. Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了通過 VH 和 VL 結構 域改組進行親和力成熟。Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)； Schier et al. Gene 169 147-155 (1995) ；Ye1 ton et al.J. Immuno1.155 1994-2004(1995) Jackson et al. ,J. Immunol. 154(7) :3310_9 (1995)；禾口 Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226 =889-896 (1992)描述了 CDR和/或構架殘基的隨機誘變。本文的“氨基酸序列變體”抗體是具有不同于主要種類抗體的氨基酸序列的抗體。 通常，氨基酸序列變體將與主要種類抗體有至少約70%同源性，優(yōu)選地，它們將與主要種類 抗體有至少約80%，更優(yōu)選至少約90%同源性。氨基酸序列變體在主要種類抗體的氨基酸 序列內部或相鄰的某些位置上具有取代、缺失和/或添加。本文的氨基酸序列變體的實例 包括酸性變體(如脫酰胺化抗體變體)、堿性變體、在其一條或兩條輕鏈上具有氨基末端前 導序列延伸(例如VHS-)的抗體、在其一條或兩條重鏈上具有C-末端賴氨酸殘基的抗體， 等等，并且包括重鏈和/或輕鏈的氨基酸序列變異的組合。本文的尤其重要的抗體變體是 這樣的抗體，其相對于主要種類抗體在其一條或兩條輕鏈上包含氨基末端前導序列延伸， 任選還包含其他氨基酸序列和/或糖基化差異。本文的“糖基化變體”抗體是具有連接到該抗體的一個或多個糖類部分的抗體，所 述糖類部分不同于連接到主要種類抗體的一個或多個糖類部分。本文的糖基化變體的實例 包括具有連接到其Fc區(qū)的Gl或G2寡糖結構而不是GO寡糖結構的抗體、具有連接到其一條或兩條輕鏈的一個或兩個糖類部分的抗體、沒有連接到該抗體的一條或兩條重鏈的糖類 的抗體，等等，和糖基化改變的組合。當抗體具有Fc區(qū)時，寡糖結構可以連接到該抗體的一 條或兩條重鏈，例如連接在殘基299 (298，殘基的Eu編號)。本文使用的術語“細胞毒性劑”指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物 質。該術語意在包括放射性同位素(例如，At211，I131, I125, y90，Re186, Re188, Sm153, Bi212，P32和 Lu的放射性同位素)、化學治療劑，和毒素，如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物來源 的酶活性毒素，包括其片段和/或變體。術語“細胞因子”是一種細胞群體釋放的蛋白質的總稱，其作為細胞間介體作用于 另一細胞。此類細胞因子的實例是淋巴因子、單核因子和常規(guī)的多肽激素。細胞因子包括 生長激素，如人生長激素、N-甲硫氨酰人生長激素、和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素； 胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如濾泡刺激激素(FSH)、促甲狀腺激素 (TSH)，和促黃體激素(LH)；肝臟生長因子；成纖維細胞生長因子；促乳素；胎盤催乳激素； 腫瘤壞死因子-α和-β ；副中腎管抑制物質；小鼠性腺促素關連肽；抑制素；激活蛋白；血 管內皮生長因子；整聯蛋白；血小板生成素(TPO)；神經生長因子，如NGF-β ；血小板生長 因子；轉化生長因子(TGFs)，如TGF-α和TGF-β ；胰島素樣生長因子-I和-II ；紅細胞生 成素(EPO)；骨誘導因子；干擾素，如干擾素_α，-β，和-Υ ；集落刺激因子(CSFs)，如巨噬 細胞-CSF(M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；和粒細胞-CSF(G-CSF)；白介素(ILs) 如 IL-1, IL-I α，IL-2, IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12 ；腫 瘤壞死因子，如TNF- α或TNF- β ；和其他多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。如本文所 用，術語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養(yǎng)物的蛋白質和天然序列細胞因子 的生物活性等同物。本文對于輔助療法所用的術語“免疫抑制劑”指抑制或者掩蔽在本文被治療 的受試者的免疫系統(tǒng)的物質。這將包括抑制細胞因子產生、下調或抑制自身抗原表達， 或者掩蔽MHC抗原的物質。此類物質的實例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶類 (見美國專利號4，665，077)；非類固醇抗炎藥物(NSAIDs)；更昔洛韋(ganciclovir)； 他克莫司(tacrolimus)；糖皮質激素(glucocorticoids)，如皮質醇(Cortisol)或酸 固酮(aldosterone)；抗炎物質，如環(huán)加氧酶抑制劑；5_脂加氧酶抑制劑；或白三烯受 體拮抗劑；嘌呤拮抗劑，如硫唑嘌呤或麥考酚酸酯(MMF)；烷化劑，如環(huán)磷酰胺；溴隱 亭(bromocryptine)；達那唑(danazol)；氨苯砜(dapsone)；戊二酸(其掩蔽 MHC 抗 原，如美國專利號4，120，649中所述)；MHC抗原和MHC片段的抗獨特型抗體；環(huán)孢菌素 (cyclosporine) ；6-巰基嘌呤；類固醇(steroids)，如皮質類固醇(corticosteroids) 或者糖皮質激素(glucocorticosteroids)或糖皮質激素類似物，例如，潑尼松 (prednisone)、甲潑尼龍(methylprednisolone)，包括 S0LU-MEDR0L. RTM、琥珀酸鈉甲基 強的松龍(methylprednisolonesodium succinate)，禾口地塞米松(dexamethasone) ；二 氫葉酸還原酶抑制劑，如甲氨蝶呤(methotrexate) ( 口服或皮下)；抗瘧疾劑，如氯喹 (chloroquine)和羥氯喹(hydroxychloroquine)；柳氮磺吡啶；來氟米特(Ieflunomide)； 細胞因子或細胞因子受體抗體或拮抗劑，包括抗干擾素-α，，或-Y抗體，抗腫瘤壞死 因子(TNF)-α抗體(英夫利昔單抗(REMICADE. RTM.)或阿達木單抗)，抗-TNF-α免疫 粘附素(依那西普)、抗-TNF-β抗體、抗白介素-2(IL-2)抗體和抗-IL-2受體抗體，和抗白介素-6 (IL-6)受體抗體和拮抗劑；抗-LFA-I抗體，包括抗-CDlla和抗-CD18抗體； 抗-L3T4抗體；異源抗淋巴細胞球蛋白；泛-T抗體，優(yōu)選抗-CD3或抗-CD4/CD4a抗體；含有 LFA-3結合結構域的可溶性肽(W0 90/08187，1990年7月26日公開)；鏈激酶；轉化生長 因子-β (TGF-β) ；streptodomase ；來自宿主的 RNA 或 DNA ;FK506 ；RS-61443 ；苯丁酸氮芥 (chlorambucil)；脫氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin) ；T-細胞受體 (Cohen et al.，美國專利號 5，114，721) ；T 細胞受體片段(Offner et al.，Science, 251 430-432(1991) ；WO 90/11294 ；Ianeway, Nature，341 :482 (1989)；和 WO 91/01133) ；BAFF 拮抗劑如BAFF或BR3抗體或免疫粘附素和zTNF4拮抗劑(綜述見Mackay and Mackay, Trends Immunol. ,23 113-5 (2002)，也參見下文的定義)；干擾T細胞輔助信號的生物制劑， 如抗-⑶40受體或抗-⑶40配體(⑶154)，包括⑶40-⑶40配體的封閉抗體(例如，Durie et al. ,Science,261 1328-30 (1993) ； Mohan et al.,J. Immunol.，154 1470-80(1995))禾口 CTLA4-Ig (Finck et al.，Science, 265 1225-7 (1994))；和 T-細胞受體抗體(EP 340，109) 如 T10B9。II.詳述A. Beta7整聯蛋白拮抗劑本發(fā)明涉及預測患者對β 7整聯蛋白拮抗劑治療的應答性的方法。潛在拮抗劑的 實例包括結合免疫球蛋白與β 7整聯蛋白的融合物的寡核苷酸，和尤其抗體，包括但不限 于，多克隆和單克隆抗體和抗體片段，單鏈抗體、抗獨特型抗體和此類抗體的嵌合或人源化 形式或片段，以及人抗體和抗體片段。備選地，潛在拮抗劑可以是密切相關的蛋白質，例如， β 7整聯蛋白的突變形式，其識別該配體但是不賦予效應，從而競爭性抑制β 7整聯蛋白的 作用。另一潛在β 7整聯蛋白拮抗劑是使用反義技術制備的反義RNA或DNA構建體，其 中例如反義RNA或DNA分子通過與被靶定的mRNA雜交而發(fā)揮作用以直接阻斷mRNA的翻譯 并阻止蛋白質翻譯。反義技術可以用于通過三螺旋形成或反義DNA或RNA控制基因表達，這 兩種方法都是基于多核苷酸與DNA或RNA的結合。例如，編碼本文的β7整聯蛋白的多核 苷酸序列的5’編碼部分用于設計長為約10到40個堿基對的反義RNA寡核苷酸。DNA寡核 苷酸被設計與涉及轉錄的基因的區(qū)域互補(三螺旋——見Lee et al. ,Nucl. Acids Res., 6 3073(1979) ；Cooney et al. , Science,241 456(1988) ；Dervan et al. , Science, 251 1360 (1991))，從而阻止轉錄和β 7整聯蛋白的產生。反義RNA寡核苷酸與mRNA在體內雜交 并阻斷mRNA分子翻譯成β 7整聯蛋白蛋白質(反義一Okano,Neurochem. ,56 =560(1991)； Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(CRC Press Boca Raton, Fla. , 1988) 0上述寡核苷酸也可以被遞送到細胞，從而可以在體內表達反義 RNA或DNA來抑制PRO多肽的產生。當使用反義DNA時，來自翻譯起始位點，例如靶基因核 苷酸序列的約-10到+10位置的寡脫氧核糖核苷酸是優(yōu)選的。其他潛在拮抗劑包括結合活性位點、配體或結合分子結合位點的小分子，從而阻 斷β 7整聯蛋白的正常生物學活性。小分子的實例包括但不限于，小肽或肽樣分子，優(yōu)選可 溶性肽，和合成的非肽酰有機或無機化合物。核酶是能夠催化RNA的特異性切割的酶促RNA分子。核酶通過與互補靶標RNA 的序列特異性雜交，接著發(fā)生內切核苷酸水解切割而發(fā)揮作用。通過已知的技術可以鑒定潛在RNA靶標內特定的核酶切割位點。細節(jié)見例如，Rossi, Current Biolozy,4 469-471 (1994)，和 PCT
發(fā)明者埃里克·加里·斯特法尼奇, 平良木初, 托馬斯·理查德·蓋爾茨雷希特, 王虹, 馬拉·布羅姆伯格·威廉姆斯 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司