專利名稱：測(cè)定被分析物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改善的、在固體底物上測(cè)定被分析物的方法。尤其，本發(fā)明方法適用于體液樣品，如唾液、血清、全血和尿樣。
通過免疫測(cè)定法測(cè)定各種體液中的物質(zhì)的方法是公知的并且經(jīng)常用于各種不同的目的。實(shí)例包括測(cè)定血、唾液、尿或其它體液樣品中的抗體以此作為病原體存在的指征，并由此診斷各種疾病。其它體液測(cè)定包括妊娠試驗(yàn)和為確定血中乙醇量的檢驗(yàn)。
盡管可通過測(cè)定大量液體來進(jìn)行這些檢驗(yàn)，但通過將樣品點(diǎn)在固定有用于被分析物的特異性結(jié)合試劑的固體底物上，然后測(cè)定特異性結(jié)合復(fù)合物的含量來進(jìn)行上述檢驗(yàn)通常更容易、更方便。這些檢驗(yàn)是很普及的，因?yàn)樗鼈兿鄬?duì)干凈并且操作簡(jiǎn)單。
然而，在固體底物上進(jìn)行檢驗(yàn)有某些不利之處。首先，在固體底物上進(jìn)行的很多測(cè)定中，有不盡人意數(shù)量的假陽性結(jié)果，即使樣品中沒有被分析物，假陽性結(jié)果也顯示含有被分析物。
第二個(gè)問題與使用多孔固體底物有關(guān)。理論上，這種底物是特別適用的，因?yàn)樗苁勾罅繕悠窂牡孜锉砻娉?，同時(shí)被分析物由于與固定在底物上的特異性結(jié)合分子結(jié)合而保留在其表面上。然而實(shí)際上有許多困難，因?yàn)闃悠吠ㄟ^底物的流動(dòng)一般是很慢的，使得有時(shí)測(cè)定要花費(fèi)20-30分鐘的時(shí)間。這對(duì)于要求很快知道結(jié)果的檢驗(yàn)尤其不利，例如，在會(huì)診期間，可由普通醫(yī)生通過其它方法進(jìn)行檢驗(yàn)的情形中。
上面討論的不利因素歸因于在很多樣品中存在不需要的顆粒物質(zhì)，包括細(xì)胞碎片，大的蛋白質(zhì)，粘多糖和其它大分子。已嘗試，通過在試圖測(cè)定特異性結(jié)合復(fù)合物之前過濾樣品來克服由樣品中這些不需要物質(zhì)產(chǎn)生的問題。
然而，令人意外的是，這樣做并非特別有效，并且仍然可得到不盡人意數(shù)量的假陽性結(jié)果，樣品通過底物流動(dòng)的時(shí)間仍然很長，甚至在將樣品加入底物之前過濾兩次樣品也是這樣。因此似乎粘蛋白和顆粒物質(zhì)的存在并非引起假陽性結(jié)果和樣品流動(dòng)時(shí)間長的全部原因。
然而，為解決假陽性結(jié)果和樣品流動(dòng)慢的問題而進(jìn)行了很多嘗試后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)這種測(cè)定涉及在被分析物和固定在多孔固體底物上的特異性結(jié)合分子之間的特異性結(jié)合復(fù)合物的測(cè)定時(shí)，通過在將樣品加到底物上之后擦拭底物表面，可簡(jiǎn)便而明顯地改善檢驗(yàn)的可靠性。這是絕對(duì)沒有料到的，因?yàn)樵?jīng)認(rèn)為，通過前面曾嘗試過的過濾步驟已除掉了所有的污染物，然而，現(xiàn)在看來似乎并非如此。
因此，本發(fā)明提供了一種用于測(cè)定體液樣品中被分析物的存在的方法，該方法包括使樣品與能夠與被分析物形成特異性結(jié)合復(fù)合物的特異性結(jié)合試劑相接觸，其中，特異性結(jié)合試劑被固定在多孔固體底物上；并測(cè)定特異結(jié)合復(fù)合物的含量；其特點(diǎn)是，在測(cè)定特異性結(jié)合復(fù)合物之前，擦拭底物表面以便除掉未吸附的污染物。
在試圖測(cè)定特異性結(jié)合復(fù)合物之前擦拭底物這一簡(jiǎn)單步驟對(duì)于測(cè)定的成功具有顯著的作用。樣品從底物上流動(dòng)所花費(fèi)的時(shí)間，從20-30分鐘減小到1-2分鐘并且?guī)缀跬耆思訇栃越Y(jié)果，同時(shí)仍保留測(cè)定對(duì)真正陽性結(jié)果的靈敏性。
可通過手工的方法進(jìn)行擦拭，或者，該過程也可以是自動(dòng)化的。通常，使用能吸收的物質(zhì)來擦拭底物，適宜物質(zhì)的實(shí)例包括棉花、棉絨和能吸收的紙。
擦拭步驟應(yīng)充分進(jìn)行，以便從底物表面除掉未與特異性結(jié)合分子結(jié)合的任何物質(zhì)。為了讓醫(yī)生清楚所有不需要的物質(zhì)都已除掉，可將著色劑加入樣品中。如果在將樣品轉(zhuǎn)稱到底物之前，將緩沖劑或表面活性劑溶液加到樣品中，那么可將著色劑包含在緩沖劑或表面活性劑溶液中，但并非必需這樣。
著色劑可以是象染料這樣的試劑，它對(duì)于粘蛋白、細(xì)胞碎片組分或保留在底物上、體液測(cè)定時(shí)引起很多假陽性問題的其它污染物是特異性的。然而，提供一種已染色的顆粒物質(zhì)如膠乳、瓊脂糖、聚苯乙烯或者不與污染物結(jié)合并由于顆粒太大不能通過多孔底物而簡(jiǎn)單地留在底物表面上的其它聚合物作為著色劑，這通常是更簡(jiǎn)單的。當(dāng)然，顆粒應(yīng)大于底物的孔徑，但也必須小于可使用的任何預(yù)濾器的孔徑。已發(fā)現(xiàn)，在很多情況下，使用直徑大約為3μm的顆粒是適宜的，因?yàn)檎缦挛闹幸敿?xì)地討論的那樣，在任何最初的純化步驟中，可選擇孔徑大于該值的濾器。染色顆粒與粘蛋白、當(dāng)較小的顆粒通過底物時(shí)可能引起假陽性問題的顆粒雜質(zhì)一起留在底物表面。
因此，當(dāng)使用著色劑時(shí)，對(duì)于醫(yī)生來說，從底物表面擦凈著色劑并因此確信所有的表面碎片都已從底物上除掉是件簡(jiǎn)單的事情。
樣品可包含任何體液，例如，唾液、全血、血清或尿，但對(duì)于唾液和全血而言，改善最大。因?yàn)榭偟目磥?，它們可能含有較大量的細(xì)胞碎片、高分子量的蛋白質(zhì)、粘多糖和其它不能通過多孔底物孔隙的高分子量物質(zhì)。
被分析物可以是任何能夠與特異性結(jié)合試劑反應(yīng)、形成特異性結(jié)合復(fù)合物的特異性結(jié)合分子。特異性結(jié)合復(fù)合物的實(shí)例包括抗體-抗原復(fù)合物，因此，被分析物可以是抗體或抗原。
如果被分析物是抗體，那么它可以是任何同型抗體并且可以是抗任何病原體的抗體。唾液或全血樣品的分析尤其適用于由病原體如幽門螺桿菌(Helicobacter pytori)(以前稱Campylobacter pylori)引起的腸感染的診斷。通過唾液或在全血中IgG的存在表明存在幽門螺桿菌感染，因此，如果試驗(yàn)的目的是檢測(cè)幽門螺桿菌感染，那么，被分析物可以是對(duì)幽門螺桿菌抗原具有特異性的IgG。
最廣義地使用“抗原”這一術(shù)語，它包括病原體細(xì)胞或病原體的同種，近種或異種提取物，所有這些都能與體液樣品中的特異性抗體結(jié)合。
當(dāng)特異性結(jié)合試劑為抗原時(shí)，它可以是蛋白質(zhì)，多糖或脂質(zhì)或其混合物。優(yōu)選且為抗原的特異性結(jié)合試劑包括蛋白質(zhì)、脂多糖或通過例如聲處理、加壓分解、洗滌提取或分級(jí)分離制備的病原體細(xì)胞提取物。
當(dāng)使用本發(fā)明方法來檢測(cè)幽門螺桿菌感染時(shí)，特異性結(jié)合試劑可以是由幽門螺桿菌衍生的抗原。在WO-A-9322682中公開了由幽門螺桿菌衍生的、適于用作本發(fā)明方法中的特異性結(jié)合試劑的抗原。然而，任何由幽門螺桿菌衍生的抗原都可用作特異性結(jié)合試劑。
如上所述，底物是多孔的，以便于大部分樣品流過它，同時(shí)，被分析樣品保留在表面上，被分析物在此處與特異性結(jié)合試劑特異性結(jié)合。底物可由硝化纖維素或其它物質(zhì)，例如聚合物象纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯構(gòu)成，但本發(fā)明不限于這些物質(zhì)。
然而，優(yōu)選地，底物為硝化纖維素膜并且孔徑大約為0.5-8μm，優(yōu)選大約1-2μm。
尤其優(yōu)選，用可吸收的芯給物質(zhì)裱背固體支撐物。通常，由于成本的原因，可吸收的紙往往是選擇的物質(zhì)，但任何可吸收的物質(zhì)都可用于該目的。
本發(fā)明所使用的特異性結(jié)合分子可以通過共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵(“被動(dòng)地”)結(jié)合到固體表面上。適宜的結(jié)合方法是本領(lǐng)域公知的并且通常由交聯(lián)、共價(jià)鍵結(jié)合或通過物理方法將抗原吸附到固體支撐物表面。
按照本發(fā)明方法，通過測(cè)定在被分析物和特異性結(jié)合試劑之間形成的復(fù)合物，判斷被分析物的存在。因此，某些類型的測(cè)定工具是確定特異性結(jié)合復(fù)合物存在(或者，如果需要，確定存在量)所必需的。
測(cè)定工具可以是與報(bào)道分子結(jié)合并且能夠與特異性結(jié)合復(fù)合物特異性結(jié)合的抗體。
如果要測(cè)定抗體，那么測(cè)定工具可包含對(duì)被分析抗體的所有同型抗體具特異性的被標(biāo)記的第二種抗體。在人類幽門螺桿菌檢驗(yàn)中，被分析抗體常常為IgG同型抗體并且此時(shí)，第二種抗體可以為抗人IgG。
從化學(xué)性質(zhì)來說，“報(bào)道分子”是具有分析、鑒定特性或提供能測(cè)定抗原-抗體結(jié)合的分析鑒定信號(hào)的分子或基團(tuán)。測(cè)定可以是定性的或定量的。在該種測(cè)定中所使用的報(bào)道分子可以是酶、熒光團(tuán)或含有放射性核素的分子(即放射性同位素)。在酶免疫測(cè)定中，通常通過戊二醛或高碘酸鹽，將酶連接到第二抗體上。然而很容易發(fā)現(xiàn)，存在各種不同的連接技術(shù)，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，這些技術(shù)都是容易獲得的。通常所使用的酶包括辣根過氧化物酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶等。通常選擇與特殊酶一起使用的發(fā)色團(tuán)，當(dāng)由相應(yīng)的酶水解時(shí)，產(chǎn)生可測(cè)定的顏色變化。根據(jù)所選擇的用途，發(fā)色團(tuán)可以是可溶的或不溶的。例如，5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽/氮藍(lán)四唑適用于與堿性磷酸酶共軛物一起使用；對(duì)于過氧化物酶共軛物來說，通常使用1，2-苯二胺-5-氨基水楊酸、3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺，聯(lián)甲苯胺或鄰聯(lián)茴香胺。使用熒光團(tuán)也是容易的，它產(chǎn)生熒光產(chǎn)物，而不是上述發(fā)色團(tuán)。熒光團(tuán)的實(shí)例為熒光黃和若丹明。當(dāng)通過用特定波長的光照射來激發(fā)時(shí)，由熒光染料標(biāo)記的抗體吸收光能，使分子處于激發(fā)狀態(tài)，然后以通?？捎霉鈱W(xué)顯微鏡目測(cè)的特定顏色發(fā)射光。
然而，本發(fā)明尤其適合用作急診檢查，通過該檢查，在幾分鐘內(nèi)便可獲得結(jié)果，并且在會(huì)診期間由普通醫(yī)生即可進(jìn)行。由于該原因，特別優(yōu)選的測(cè)定方法是盡可能簡(jiǎn)單并且不需要特殊設(shè)備的方法。因此，本發(fā)明優(yōu)選的報(bào)道分子為著色劑如膠態(tài)金或炭，聚苯乙烯或膠乳顆粒。
當(dāng)使用該種報(bào)道物質(zhì)時(shí)，除去未結(jié)合的第二種抗體是重要的，這樣可使得結(jié)合的第二種抗體與附著的著色劑清晰可見。因此，它尤其適用于由本發(fā)明中使用的可吸收墊裱背的多孔膜，因?yàn)槿魏味嘤嗟牡诙N抗體都將通過膜并吸收在墊中，在硝化纖維素膜的表面上只留下結(jié)合的第二種抗體和相關(guān)的著色劑。
如上所述，盡管尚未完全解決樣品流動(dòng)慢和假陽性結(jié)果的問題，但是本發(fā)明方法中包括一或多個(gè)最初過濾步驟通常是有利的。
典型地，本發(fā)明方法中所使用的濾器有效孔徑大約為1-15μm，優(yōu)選3-8μm。使用任何種類的濾器都可以達(dá)到這個(gè)要求，但優(yōu)選的種類為由塑料物質(zhì)制成并且實(shí)際孔徑大約為5-10μm的釉料(frit)濾器。在該種釉料濾器中，有效孔徑小于實(shí)際孔徑，因?yàn)橛粤蠟V器比較深并且孔不成一直線。
在過濾步驟之前可包括的另一步驟是初級(jí)分離步驟，在該步驟中，將樣品通過粗濾器，如棉花或棉絨墊。該步驟對(duì)降低唾液樣品的粘度特別有用，可能因?yàn)樗敉僖簶悠分写嬖诘拇蟛糠终扯嗵?，但該步驟同樣也有助于其它種類體液的測(cè)定。
有助于消除假陽性結(jié)果的進(jìn)一步改進(jìn)方法是在底物上提供一種能夠與測(cè)定試劑反應(yīng)的對(duì)照劑。該對(duì)照劑將存在于與特定結(jié)合分子不同的位置并且將能夠特異性地與測(cè)定試劑結(jié)合。因此，例如，如果測(cè)定試劑為抗人IgG，那么對(duì)照劑為人IgG。對(duì)照劑的存在是監(jiān)測(cè)本發(fā)明方法可行性的手段，因?yàn)槿绻礈y(cè)定到該對(duì)照劑，那么該測(cè)定方法顯然未能正常運(yùn)作。
在將樣品加到底物中之前，通常優(yōu)選用含緩沖劑和/或表面活性劑的溶液來處理它。就全血樣品而言，可使用賴氨酸緩沖劑。通常，緩沖劑pH大約為6.8-7.8，并且優(yōu)選大約為7.2。通常緩沖劑中將會(huì)有表面活性劑如非離子型聚氧乙烯醚，銷售商標(biāo)為TRITONX-100(UnionCarbide Chemicals and Plastics CO，Inc)，其體積含量可以為0.05-1％并且優(yōu)選大約為0.1％。
聯(lián)合使用擦拭步驟和緩沖劑可使全血樣品的流動(dòng)時(shí)間從20-30分鐘減小到120-180秒。
優(yōu)選地，當(dāng)體液為唾液時(shí)，用含有棕櫚酸和/或硬脂酸聚氧乙烯山梨糖醇衍生物并緩沖至pH大約為6.8-7.8、優(yōu)選大約為7.4的溶液來處理。
可得到適宜的表面活性劑，商標(biāo)為TWEEN40，TWEEN60，TWEEN61，TWEEN65和TWEEN80。
尤其優(yōu)選的是表面活性劑中含40％-65％的硬脂酸，含大約55％硬脂酸衍生物而其余為棕櫚酸衍生物的TWEEN60是尤其優(yōu)選的，它比其它表面活性劑提供明顯更可信的結(jié)果。
最好選擇表面活性劑的含量以使樣品以最快的速度流過底物。通常，當(dāng)表面活性劑的體積含量為0.1％-1％，典型地為0.5％時(shí)，流速是最大的。表面活性劑的這一含量對(duì)于消除非特異性結(jié)合并不特別影響特異性結(jié)合提供最佳結(jié)果，因此，利用本發(fā)明方法可獲得最佳測(cè)定閾。
為了使檢驗(yàn)樣品中的粘蛋白以及顆粒物質(zhì)與檢驗(yàn)試劑的非特異性結(jié)合達(dá)到最小，溶液中可以含有其它試劑。該試劑包括無機(jī)鹽如氯化鈉和蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白(BSA)。
所含氯化鈉的濃度大約為0.1-0.2M。特別優(yōu)選濃度的上限不超過0.2M，因?yàn)槌^該值就容易阻礙特異性結(jié)合。典型地，溶液中所含氯化鈉的濃度大約為0.125M。
如果含有BSA，那么其重量含量通常大約為0.05％-0.5％，優(yōu)選0.1％。
對(duì)處理血樣和唾液樣品來說，特別優(yōu)選磷酸鹽緩沖劑。而其它用來確保溶液的pH值在優(yōu)選范圍內(nèi)的緩沖劑的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
盡管鈉鹽通常提供最佳結(jié)果，但可使用任何水溶性鹽如鈉，鉀或銨鹽來制備緩沖溶液。已發(fā)現(xiàn)，用0.001-0.05M，優(yōu)選大約0.02M的磷酸鈉溶液可獲得有效的緩沖。
如上面簡(jiǎn)述過的，用來使要從底物表面擦拭掉的污染物可見的著色劑可包含在緩沖劑或表面活性劑溶液中。當(dāng)它包含在緩沖劑或表面活性劑溶液中時(shí)，顆粒著色劑的重量含量大約為0.005％-0.05％，優(yōu)選大約為0.01％-0.02％。然而，如果使用染料，其濃度可比該值略高。
包含著色劑的緩沖劑和/或表面活性劑溶液是新的并且其本身構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
因此，本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用來處理待測(cè)定體液樣品并包含表面活性劑和著色劑的緩沖溶液。
如上討論，對(duì)于某些污染物，著色劑可以是特異性的，它需要被除去，但最好含有著色的顆粒物質(zhì)如膠乳、瓊脂糖、聚苯乙烯或其它聚合物。當(dāng)然，顆粒應(yīng)大于底物的孔徑，但必須小于可使用的任何預(yù)濾器的孔徑。已發(fā)現(xiàn)，在很多情況下，使用直徑大約為3μm的顆粒是適宜的。
緩沖溶液可包含在用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的試劑盒中，該試劑盒本身構(gòu)成本發(fā)明的另一目的。
在本發(fā)明這一目的中，提供一試劑盒，它含有i.含有表面活性劑和著色劑的緩沖溶液；ii.固定在多孔底物上并且能與被分析物形成特異性結(jié)合復(fù)合物的特異性結(jié)合試劑；和iii.用于測(cè)定特異性結(jié)合復(fù)合物含量的測(cè)定試劑。
本發(fā)明尤其適用于測(cè)定抗幽門螺桿菌的抗體，該抗體可存在于幽門螺桿菌感染病人的唾液中。如上討論，幽門螺桿菌的異乎尋常之處在于，該感染引發(fā)唾液中IgG同型抗體。
因此，本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供用于測(cè)定對(duì)幽門螺桿菌具特異性的IgG的試劑盒，該試劑盒包含i.含有表面活性劑和著色劑的溶液；ii.由固定在多孔底物上的幽門螺桿菌衍生的抗原；和
iii.能夠特異性地與人IgG結(jié)合的被標(biāo)記抗體的溶液。
當(dāng)試劑盒用于全血或唾液樣品的測(cè)定時(shí)，優(yōu)選的溶液組分為本發(fā)明第一目的的方法中所描述的組分。優(yōu)選的底物和測(cè)定試劑也如本發(fā)明第一目的中所述。
試劑盒中也可以包含適合于待測(cè)體液的采集器械。也可以包含用于樣品初級(jí)過濾的粗濾器如棉花或棉絨墊并且它們可選擇性地構(gòu)成唾液采集器械的一部分。而且，試劑盒可包含用于除掉樣品中顆粒物質(zhì)的濾器。正如與第一目的的方法有關(guān)的論述所討論的那樣，濾器的有效孔徑大約為1-15μm，優(yōu)選3-8μm。使用任何種類的濾器都可達(dá)到該要求，但優(yōu)選由塑料材料制成的釉料濾器并且其典型的實(shí)際孔徑大約為5-10μm。
現(xiàn)參考下列實(shí)施例，詳細(xì)描述本發(fā)明。實(shí)施例1制備供唾液樣品使用的緩沖的表面活性劑溶液通過在室溫下將下列組分混合來制備緩沖的表面活性劑溶液0.02M磷酸鈉溶液 100ml氯化鈉0.73g牛血清白蛋白 0.1gTWEEN60TM0.5g深藍(lán)色膠乳顆粒(3.0μm直徑)0.1g深藍(lán)色膠乳顆粒購自Polymer Laboratories，UK.實(shí)施例2制備由幽門螺桿菌衍生的抗原按照WO-A-9322682實(shí)施例1中闡述的方法制備由幽門螺桿菌衍生的抗原。簡(jiǎn)而言之，制備幽門螺桿菌的粗品超聲處理物并分級(jí)分離。除掉440kDa的蛋白質(zhì)，剩下含265和340kDa蛋白質(zhì)的混合物。實(shí)施例3制備檢驗(yàn)裝置將1-5μl 0.05％(w/w)的實(shí)施例2抗原溶液點(diǎn)在底物上構(gòu)成檢驗(yàn)區(qū)。該底物為支撐在作為芯給材料的Schleicher&Schuell層析紙NO3469(購自Anderman&Co，KinstonuponThames，UK)裱背層上的1.2μmSARTORIUSTM硝化纖維素膜。
將1-5μl 0.005％(w/w)純化正常人IgG(Sigma ChemicalCompany Ltd，Poole，Dorset，UK)點(diǎn)到底物上不同于檢驗(yàn)區(qū)的對(duì)照區(qū)中。實(shí)施例4制備公開試劑在含有0.05％(體積)商標(biāo)名為TWEEN20的表面活性劑和0.1％(重量)BSA的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，將與山羊抗人IgG(重鏈和輕鏈)結(jié)合的膠態(tài)金(Biocell ResearchLaboratories，Cardiff，UK)稀釋到在520nm處光程長度為1cm時(shí)0.5個(gè)光密度單位，由此制備公開試劑。實(shí)施例5測(cè)定唾液樣品用商標(biāo)名為OMNISAL(Saliva Diagnostic System，Vancouver，Washington，USA)的采集器械來采集唾液(1ml)，其中，在也發(fā)揮粗濾器作用的墊中采集樣品。然后，將含有樣品的采集器械轉(zhuǎn)移到含1.0ml實(shí)施例1溶液的試管中。用排除大約5m顆粒的Porex Ultrafine血清分離器，將采集到的唾液過濾，然后加到實(shí)施例3中制備的檢驗(yàn)裝置上。
稀釋的唾液樣品流過硝化纖維素膜而進(jìn)入層析紙裱背層后，在底物表面形成藍(lán)色膠乳顆粒層。通過用棉絨徹底但輕輕地擦拭直至藍(lán)色消失來除掉該層。
然后，將0.5ml實(shí)施例4的公開試劑加到檢驗(yàn)裝置中。通過硝化纖維素膜將公開試劑排出，然后記錄檢驗(yàn)結(jié)果。
僅在對(duì)照區(qū)產(chǎn)生一個(gè)粉色點(diǎn)表明是可行的但為陰性檢驗(yàn)結(jié)果，而在檢驗(yàn)區(qū)和對(duì)照區(qū)都產(chǎn)生點(diǎn)的檢驗(yàn)表明為陽性結(jié)果。
該檢驗(yàn)可測(cè)定象0.8單位(在0-10級(jí))這樣低的抗幽門螺桿菌IgG的量并且不產(chǎn)生假陽性結(jié)果。實(shí)施例6制備供血液樣品使用的緩沖的表面活性劑溶液通過在室溫下混合下列組分來制備緩沖的表面活性劑溶液0.02M磷酸鈉溶液 100mlTRITONX-100 0.1ml深藍(lán)色膠乳顆粒(3.0μm直徑) 0.1g深藍(lán)色膠乳顆粒購自Polymer Laboratories，UK。實(shí)施例7測(cè)定血樣除了用UNISTIK2TM采集器械和VOLACTM肝素化玻璃試管采集血樣外，按照實(shí)施例5中的方法進(jìn)行測(cè)定。用實(shí)施例6的溶液而不是實(shí)施例1的溶液來處理血樣。
同樣，僅在對(duì)照區(qū)產(chǎn)生一個(gè)粉色點(diǎn)表明是可行的但為陰性的檢驗(yàn)結(jié)果，而在檢驗(yàn)區(qū)和對(duì)照區(qū)都產(chǎn)生一個(gè)點(diǎn)的檢驗(yàn)表明陽性結(jié)果。
該檢驗(yàn)可測(cè)定象0.8單位(在0-10級(jí))這樣低的抗幽門螺桿菌IgG的量。
權(quán)利要求
1.測(cè)定體液樣品中被分析物的存在的方法，該方法包括將樣品與能夠與被分析物形成特異性結(jié)合復(fù)合物的特異性結(jié)合試劑相接觸，其中將特異性結(jié)合試劑固定在多孔固體底物上；測(cè)定特異性結(jié)合復(fù)合物的含量；其特點(diǎn)是在測(cè)定特異性結(jié)合復(fù)合物之前，擦拭底物表面以除掉未吸附的污染物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中擦拭步驟手工進(jìn)行。
3.權(quán)利要求1的方法，其中擦拭步驟自動(dòng)化進(jìn)行。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中在擦拭步驟前，把將會(huì)保留在底物表面上的著色劑加到樣品中。
5.權(quán)利要求4的方法，其中著色劑包含直徑小于過濾步驟中所使用的任何濾器的孔徑但大于底物的孔徑的著色顆粒。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中，體液包括唾液，全血，血清或尿。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中，被分析物為抗體。
8.權(quán)利要求7的方法，其中，被分析物為對(duì)幽門螺桿菌抗原具特異性的抗體。
9.權(quán)利要求8的方法，其中，抗體為IgG同型抗體。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中，特異性結(jié)合分子為抗原。
11.權(quán)利要求10的方法，其中，抗原是由幽門螺桿菌衍生的。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法，其中，底物是由硝化纖維素，纖維素，聚丙烯酰胺，尼龍，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯形成的。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中，底物孔徑大約為0.5-8μm，優(yōu)選大約為1-2μm。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其中，由可吸收的芯給材料來裱背固體支撐物。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的方法，其中，用與報(bào)道分子結(jié)合并且能夠與特異性結(jié)合復(fù)合物特異性結(jié)合的抗體來測(cè)定特異性結(jié)合復(fù)合物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中，被分析物為幽門螺桿菌特異性IgG同型抗體并且用能夠與人IgG特異性結(jié)合的抗體來測(cè)定特異性結(jié)合復(fù)合物。
17.權(quán)利要求15或16的方法，其中，報(bào)道分子為酶，如辣根過氧化物酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶或堿性磷酸酶；熒光團(tuán)如熒光黃或羅丹明；含放射性核素的分子；或者著色劑，如膠態(tài)金或聚苯乙烯顆粒。
18.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的方法，它進(jìn)一步包括在試圖測(cè)定特異性結(jié)合復(fù)合物含量之前將樣品過濾的步驟。
19.權(quán)利要求18的方法，其中，濾器的有效孔徑大約為3-8μm。
20.權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的方法，它進(jìn)一步包括最初的粗濾步驟。
21.權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)中用于測(cè)定全血樣品的方法，該方法包括用緩沖的表面活性劑溶液來處理樣品的步驟，所述緩沖的表面活性劑溶液包含表面活性劑例如以TRITONX-100為商標(biāo)出售的非離子型聚氧乙烯醚，其體積含量為0.05％-1％，并且在將樣品加到底物上之前，緩沖至pH大約為6.8-7.8。
22.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的用于測(cè)定唾液樣品的方法，該方法包括用緩沖的表面活性劑溶液來處理樣品的步驟，所述緩沖的表面活性劑溶液包含棕櫚酸和/或硬脂酸的聚氧乙烯山梨糖醇酐衍生物并且在將樣品加到底物上之前緩沖至pH大約為6.8-7.8。
23.權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的方法，其中，在底物上固定有一種能按照與特異性結(jié)合復(fù)合物相同方法測(cè)定的對(duì)照劑。
24.權(quán)利要求23的方法，其中對(duì)照劑為人IgG。
25.用于處理待測(cè)體液樣品的緩沖溶液，它包含一種表面活性劑和一種在測(cè)定期間將留在底物表面上的著色劑。
26.權(quán)利要求25中的緩沖溶液，其中，著色劑包含直徑小于過濾步驟中所使用的任何濾器的孔徑但大于底物孔徑的著色顆粒。
27.權(quán)利要求25或26中的溶液，其中，顆粒包含膠乳，瓊脂糖，聚苯乙烯或其它聚合物。
28.一種試劑盒，它包含i權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)的緩沖溶液；ii.固定在多孔底物上并且能夠與被分析物形成特異性結(jié)合復(fù)合物的特異性結(jié)合試劑；和iii.測(cè)定特異性結(jié)合復(fù)合物的存在的測(cè)定試劑。
29.一種試劑盒，它包含i.權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)的緩沖溶液；ii.固定在多孔底物上的由幽門螺桿菌衍生的抗原；和iii.能夠與人IgG特異性結(jié)合的被標(biāo)記抗體的溶液。
30.權(quán)利要求28或29中的試劑盒，它進(jìn)一步包含下列中的一種或多種體液采集器械；粗濾器如棉花或棉絨墊，它可構(gòu)成采集器械的一部分；和用于除掉樣品中顆粒物質(zhì)的濾器。
全文摘要
本發(fā)明涉及改善的，測(cè)定體液樣品中被分析物的方法。在該方法中，將樣品與能夠與被分析物形成特異性結(jié)合復(fù)合物的特異性結(jié)合試劑相接觸，其中，將特異性結(jié)合試劑固定在多孔固體底物上。然后測(cè)定特異性結(jié)合復(fù)合物的含量。本發(fā)明方法附加步驟為在開始測(cè)定前，擦拭底物表面以便除掉未吸附的污染物，用著色劑可使未吸附的污染物在底物表面上顯色，結(jié)果很容易知道什么時(shí)候已除掉污染物。
文檔編號(hào)G01N33/52GK1147855SQ9519286
公開日1997年4月16日 申請(qǐng)日期1995年3月29日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月29日
發(fā)明者P·R·古德溫 申請(qǐng)人:科特克斯有限公司