本發(fā)明涉及體外診斷領(lǐng)域，尤其涉及一種尿液中細(xì)胞染色后快速顯色的染色劑及其使用方法。

背景技術(shù)：

尿液中的有形成分包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、管型、上皮細(xì)胞等多種成分。有形成分分析對泌尿系統(tǒng)、臨近生殖系統(tǒng)以及其它系統(tǒng)疾病的檢測具有重要意義。大量研究表明，尿液中的結(jié)晶、酵母菌會干擾尿紅細(xì)胞的分析，大量的粘液絲和菌絲可引起管型計(jì)數(shù)的假陽，白細(xì)胞和小吞噬細(xì)胞以及細(xì)胞核不明顯的白細(xì)胞和大紅細(xì)胞、白細(xì)胞與滴蟲、孢子和紅細(xì)胞形態(tài)相近，而透明管型和精子為無色，出現(xiàn)誤檢漏檢的幾率較大，因此化學(xué)染色對病理意義顆粒的鑒別意義重大。雖然現(xiàn)有的尿液中有形成分的染色方法較多，但均存在不足，比如sternheimer染色法、sternheimer-malbin染色法、burhe-muhlberg染色法和阿利新藍(lán)-中性紅染色法，不僅染色時間長（>1分鐘），同種細(xì)胞顯色不均一，且染色效果受尿液樣本的ph值限制，此外，復(fù)合染料染色容易出現(xiàn)顆粒干擾物；may-giemsa、瑞氏、吉氏、瑞吉復(fù)合染色法等固定染色法的樣本制備工藝復(fù)雜，不利于提高檢驗(yàn)的速度和實(shí)現(xiàn)自動化檢驗(yàn)的目的；蘇丹ⅲ染色法、碘染色法、過氧化物酶染色法、含鐵血黃素染色法等特殊染色法僅適用于尿液樣本中某一類有形成分的分析。

因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種尿液中細(xì)胞染色后快速顯色的染色劑及其使用方法，旨在解決現(xiàn)有的尿液細(xì)胞染色方法樣本制備工藝復(fù)雜、染色時間長、紅細(xì)胞形態(tài)受染色液影響且易發(fā)生聚集、以及不利于實(shí)現(xiàn)自動化檢測的問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種尿液中細(xì)胞染色后快速顯色的染色劑，其中，包括試劑a和試劑b，且試劑a和試劑b用量的質(zhì)量比為0.25~4，在染色劑中，

試劑a包括:

中性紅染料0.6~1.2g；

染料溶劑100g；

試劑b包括:

緩沖劑10mm~600mm；

細(xì)胞膜損傷劑0.1~8g；

絡(luò)合劑0~4g；

ph調(diào)節(jié)劑0.01~10g；

溶劑100g。

所述的尿液中細(xì)胞染色后快速顯色的染色劑，其中，所述染料溶劑為純化水和有機(jī)溶劑中的一種或多種。

所述的尿液中細(xì)胞染色后快速顯色的染色劑，其中，所述有機(jī)溶劑可為甲醇、乙醇、乙二醇、戊醇、丙三醇、二甲基亞砜中的一種或其組合物。

所述的尿液中細(xì)胞染色后快速顯色的染色劑，其中，所述緩沖劑為2-（n-嗎啡啉）乙磺酸、1，3-二[（三羥甲基）甲氨基]丙烷、哌嗪-1，4-二乙磺酸、3-（n-嗎啉基）丙磺酸、3-（n-嗎啉基）-2-羥基丙磺酸、磷酸氫二鈉-檸檬酸、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、巴比妥鈉-鹽酸、丙酸-丙酸鈉、乙酸-乙酸鈉中的一組或幾組的混合物。

所述的尿液中細(xì)胞染色后快速顯色的染色劑，其中，所述細(xì)胞膜損傷劑為下列有機(jī)化合物中的一種或多種：

ch3(ch2)n1coor，n1=0，1，2或3，其中r為na、h或k；

所述的尿液中細(xì)胞染色后快速顯色的染色劑，其中，所述絡(luò)合劑為檸檬酸、檸檬酸鹽或乙二胺四乙酸鹽。

一種尿液中細(xì)胞染色后快速顯色的染色劑的使用方法，其中，包括：

步驟s1、制備試劑a和試劑b；

步驟s2、先將制備的所述試劑a和試劑b按質(zhì)量比為0.25~4的比例混合得到染色劑，再將所述染色劑滴加到濃縮后或非濃縮的尿液樣本上；

步驟s3、染色5~30s后，得到染色后的尿液樣本。

所述的尿液中細(xì)胞染色后快速顯色的染色劑的使用方法，其中，試劑a和試劑b的制備方法分別為：

試劑a的制備：

a1、將溶液稀釋劑、染料溶劑及化學(xué)染料按所述順序加入到試劑瓶中，得到第一混合溶液a1；

a2、將上述含有第一混合溶液a1的試劑瓶置于搖床上充分溶解2~5小時，得到第二混合溶液a2；

a、對所述第二混合溶液a2進(jìn)行過濾，將濾液標(biāo)記為試劑a，并保存?zhèn)溆茫?/p>

試劑b的制備：

b1、將緩沖劑、絡(luò)合劑和細(xì)胞膜損傷劑加入純化水中，使其充分溶解得到第一混合溶液b1；

b2、向所述第一混合溶液b1中加入ph調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)ph值至4.8-7.0，得到第二混合溶液b2；

b、對所述第二混合溶液b2進(jìn)行過濾，將濾液標(biāo)記為試劑b，并保存?zhèn)溆谩?/p>

所述的尿液中細(xì)胞染色后快速顯色的染色劑的使用方法，其中，所述染色劑中試劑a和試劑b的質(zhì)量比為0.25~4。

所述的尿液中細(xì)胞染色后快速顯色的染色劑的使用方法，其中，所述染色劑與尿液樣本的體積比為1~8。

有益效果：本發(fā)明提供的尿液中細(xì)胞染色后快速顯色的試劑，不需對尿液中細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理就能對其直接染色，且顯色時間短，操作簡單、檢測效率高；此外，該染色劑不影響具有病理意義的紅細(xì)胞的形態(tài)，不會導(dǎo)致高濃度的紅細(xì)胞樣本發(fā)生聚集，有利于提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和實(shí)現(xiàn)自動化檢測的目的。

附圖說明

圖1、2、12為按照本發(fā)明中實(shí)施例4制備的染色劑及染色方法對尿液中的白細(xì)胞進(jìn)行染色的效果圖。

圖3、4、5為按照本發(fā)明中實(shí)施例1制備的染色劑及染色方法對尿液中的上皮細(xì)胞（含線索細(xì)胞圖4）進(jìn)行染色的效果圖。

圖6、7、8為按照本發(fā)明中實(shí)施例2制備的染色劑及染色方法對尿液中的管型進(jìn)行染色的效果圖。

圖9、10、11為按照本發(fā)明中實(shí)施例3制備的染色劑及染色方法對尿液中的紅細(xì)胞進(jìn)行染色的效果圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種尿液中細(xì)胞染色后快速顯色的染色劑及其使用方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明提供的尿液中細(xì)胞染色后快速顯色的染色劑，其中，包括試劑a和試劑b，且試劑a和試劑b的質(zhì)量比為0.25~4，在染色劑中，

試劑a包括:

中性紅染料0.6~1.2g；

染料溶劑100g；

試劑b包括:

緩沖劑10mm~600mm；

細(xì)胞膜損傷劑0.1~8g；

絡(luò)合劑0~4g；

ph調(diào)節(jié)劑0.01~10g；

溶劑100g。

其中，化學(xué)染料選擇能夠擴(kuò)散到細(xì)胞膜內(nèi)部，并將細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)區(qū)分的有機(jī)染料。化學(xué)染料與細(xì)胞相互作用的方式分為物理相互作用和化學(xué)相互作用，物理相互作用遵循相似相容原理，化學(xué)相互作用包括靜電相互作用、氫鍵相互作用、范德華力、疏水力和共價鍵，其中靜電相互作用最為常見，也是各種作用力中貢獻(xiàn)最大的一種。染料的擴(kuò)散速度受染料的分子量影響，分子量越大，擴(kuò)散速度越慢。

基于上述作用原理，本發(fā)明中，化學(xué)染料優(yōu)選中性紅染料，作為一種弱堿性染料，其在近中性和堿性條件下帶正電，與細(xì)胞內(nèi)含負(fù)電基團(tuán)的染色質(zhì)分子上的磷酸基團(tuán)，蛋白質(zhì)分子上的羧基及細(xì)胞膜上的唾液酸分子相互作用顯紅色。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)致密，著色深，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)染色質(zhì)和蛋白分布疏松，著色淺。根據(jù)染色后的細(xì)胞形態(tài)可以清晰地分辨各種細(xì)胞類型。此外，該染料的適用范圍廣，能夠?qū)δ蛞褐械陌准?xì)胞、上皮細(xì)胞、紅細(xì)胞、精子等多種成分進(jìn)行染色。本發(fā)明中，中性紅染料在a和b混合液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%~0.96%，合適用量的中性紅染料不僅能夠?qū)⒓?xì)胞進(jìn)行快速染色，而且染色后的細(xì)胞中，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，容易分辨，有利于提高檢驗(yàn)效率。

本發(fā)明溶劑為純化水和有機(jī)溶劑中的一種或多種，其作用是使化學(xué)染料能夠長期穩(wěn)定保存，并使制備的染色劑保持較好的染色效果。其中，純化水有利于增加鹽類的溶解度，同時能夠?qū)τ袡C(jī)溶劑進(jìn)行稀釋，防止有機(jī)溶劑過多引起尿液樣本中的紅細(xì)胞變形。此外，純化水用量的確定方法需滿足兩方面要求：其一是保證紅細(xì)胞不發(fā)生形變，其二是確保染液無析出物。本發(fā)明中，試劑a在a和b混合液中的用量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%~80%。所述染料溶劑的有機(jī)溶劑可為甲醇、乙醇、乙二醇、戊醇、丙三醇、二甲基亞砜（dmso）或其組合物。如甲醇-乙醇、乙二醇-甲醇、dmso-乙二醇、乙二醇-丙三醇或多種有機(jī)溶劑混合復(fù)配。有機(jī)溶劑與水之間也可以進(jìn)行復(fù)配后作為染料溶劑，如甲醇-水、乙醇-水、乙二醇-水、戊醇-水、丙三醇-水、二甲基亞砜（dmso）-水、乙二醇-甲醇-水、乙二醇-乙醇-水、乙二醇-丙三醇-水，丙三醇-甲醇-水，較佳的，乙二醇-水或乙二醇-甲醇-水作為染料溶劑的效果較好。

緩沖劑的主要作用是調(diào)節(jié)尿液ph值和滲透壓，維持紅細(xì)胞形態(tài)，同時保證相對恒定的染色環(huán)境，使染料對不同尿液樣本中的細(xì)胞的染色效果相近。對于尿液體系，選擇緩沖劑的緩沖范圍在ph=4.8-7.0為宜，優(yōu)選緩沖劑的緩沖范圍在ph=4.8-6.8，較佳的，選擇緩沖劑的緩沖范圍在ph=5.0-6.2。緩沖劑可使用2-（n-嗎啡啉）乙磺酸（mes）、1，3-二[（三（羥甲基）甲氨基]丙烷（bis-tris）、哌嗪-1，4-二乙磺酸（pipes）、3-（n-嗎啉基）丙磺酸（mops）、3-（n-嗎啉基）-2-羥基丙磺酸（mopso）中的一種；也可以為磷酸氫二鈉-檸檬酸、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉、tris-鹽酸、巴比妥鈉-鹽酸、丙酸-丙酸鈉、乙酸-乙酸鈉其中的一組，還可以為上述緩沖劑之間的復(fù)合緩沖體系。如選擇1，3-二[（三（羥甲基）甲氨基]丙烷（bis-tris）與丙酸-丙酸鈉的復(fù)配體系，能夠直接將尿液的ph值和滲透壓調(diào)整為較合適的值，便于后續(xù)染色過程的進(jìn)行。

緩沖劑發(fā)揮ph值調(diào)節(jié)作用時，在試劑a和試劑b混合后的溶液中，濃度為10mmol/l~600mmol/l較為合適；為保證較佳的染色效果，緩沖劑在試劑a和試劑b混合后的溶液中，濃度為10mmol/l~200mmol/l較為合適。

細(xì)胞膜損傷物質(zhì)是一種能夠破壞活細(xì)胞細(xì)胞膜屏障的有機(jī)化合物分子，其主要作用于磷脂雙分子層，即，將自身的疏水端嵌入磷脂雙分子層，使磷脂雙分子層排列松散，這樣，表面積增大的磷脂雙分子層便于小分子擴(kuò)散到細(xì)胞的內(nèi)部，如染料分子，其可以從受損細(xì)胞膜自由擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)部，對細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色。同時，要求細(xì)胞膜損傷物質(zhì)在作用于磷脂雙分子層時，不能影響細(xì)胞形態(tài)，尤其是不能影響脆弱的具有診斷意義的紅細(xì)胞的形態(tài)。細(xì)胞膜損傷物質(zhì)的用量以在顯微鏡下觀察5分鐘，紅細(xì)胞無明顯形變，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)不變?yōu)闇?zhǔn)。所述細(xì)胞膜損傷物質(zhì)可以為以下三類，分別為：

ch3(ch2)n1coor，其中，n1=0，1，2或3，r可以是na、h或者k；優(yōu)選的，當(dāng)n1=1或2時，細(xì)胞膜損傷物質(zhì)的效果較好，且當(dāng)細(xì)胞膜損傷物質(zhì)在試劑a和試劑b混合后的溶液中，質(zhì)量百分比為0.1%~8%時，優(yōu)選1-4%時，細(xì)胞損傷物質(zhì)能夠在保證具有診斷意義的細(xì)胞形態(tài)不受影響的前提下，提高染料分子的跨膜速度，對尿液中的細(xì)胞進(jìn)行快速染色。

絡(luò)合劑能和堿金屬、稀土元素和過渡金屬等形成穩(wěn)定的水溶性絡(luò)合物，其主要作用是減少尿液中無晶形鹽類對染色過程的干擾。在本發(fā)明中，絡(luò)合劑可以為檸檬酸鹽或乙二胺四乙酸（edta）鹽，絡(luò)合劑的用量為，在試劑a和試劑b混合后的溶液中，質(zhì)量濃度以0-4%為宜。

ph值調(diào)節(jié)劑，用來進(jìn)一步調(diào)整染色劑的ph值，確保染色的ph值環(huán)境，染色劑能夠快速對尿液中細(xì)胞進(jìn)行染色，且不會對其形態(tài)造成影響。優(yōu)選的，ph調(diào)節(jié)劑可以為乙酸、丙酸，鹽酸等，以將試劑b的ph值調(diào)至4.8-7.0。

溶劑b的作用是將加入的鹽類充分溶解，得到均一穩(wěn)定的試劑b，便于與試劑a配合應(yīng)用，進(jìn)而對尿液中的細(xì)胞進(jìn)行染色。本發(fā)明中，試劑b中的溶劑優(yōu)選為純化水，不僅對加入的不同物質(zhì)均有較好的溶解性，且不會對尿液中的細(xì)胞造成影響。

此外，本發(fā)明還提供一種尿液中細(xì)胞染色后快速顯色的染色劑的使用方法，包括：

步驟s1、制備試劑a和試劑b；

步驟s2、先將制備的上述試劑a和試劑b按質(zhì)量比為0.25~4的比例混合得到染色劑，再將上述染色劑滴加到濃縮后的尿液樣本上；

步驟s3、染色5~30s后，得到染色后的尿液樣本。

較佳的，制備試劑a的步驟包括：向試劑瓶中先加入染料溶劑，再加入化學(xué)染料，得到第一混合溶液a1，將上述含有第一混合溶液a1的試劑瓶置于搖床上充分溶解2~5小時，得到第二混合溶液a2，將上述第二混合溶液a2進(jìn)行過濾，將濾液標(biāo)記為試劑a，并保存?zhèn)溆?。制備試劑b的步驟包括：向溶劑純化水中加入緩沖劑、絡(luò)合劑和細(xì)胞膜損傷劑，充分溶解后得到第一混合溶液b1，然后用ph調(diào)節(jié)劑將上述第一混合溶液b1的ph值調(diào)至4.8-7.0，得到第二混合溶液b2，最后對上述第二混合溶液b2進(jìn)行過濾，將濾液標(biāo)記為試劑b，并保存?zhèn)溆谩?/p>

將制備好的上述試劑a和試劑b按質(zhì)量比為0.25~4的比例混合得到染色劑，再將上述染色劑滴加到非濃縮或濃縮后的尿液樣本上。優(yōu)選的，試劑a和試劑b的質(zhì)量比為0.67~1.5，試劑a和試劑b按照上述比例進(jìn)行混合時，染色劑溶液更加均一，性質(zhì)更加穩(wěn)定，染色速度更快。而染色劑與尿液樣本加入的體積比為1~8，這是因?yàn)?，?dāng)尿液與染色劑的體積比在上述范圍內(nèi)時，染色劑能夠快速有效地將尿液中的細(xì)胞進(jìn)行染色，且尿液中的細(xì)胞不會被加入的染色劑破壞原有的結(jié)構(gòu)和形態(tài)，有利于提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

向上述濃縮后的尿液中加入適量的染色劑后，染色5~30s，得到染色后的尿液樣本。此外，本發(fā)明中的方法染色液，不僅適用于顯微鏡鏡檢，同時可以應(yīng)用到流式數(shù)字圖像分析技術(shù)中，有利于提高檢測效率和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

實(shí)施例1

1、染色劑的制備

試劑a:

在棕色試劑瓶中按照先后順序加入5.00g甲醇、95.00g乙二醇和1.20g中性紅，得到第一混合溶液a1；之后，將裝有上述第一混合溶液a1的棕色試劑瓶置于搖床上，中速溶解3小時，使得藥品完全溶解，得到第二混合溶液a2；然后用0.22um濾膜對上述第二混合溶液a2進(jìn)行過濾，將過濾后的溶液標(biāo)記為試劑a，并置于棕色瓶中保存。

試劑b:

在試劑瓶中加入100.00g純化水、4.20g（200mm）的1，3-二[（三（羥甲基）甲氨基]丙烷（bis-tris）、8.00g丙酸鈉，充分溶解后得到第一混合溶液b；向上述第一混合溶液b1中加入丙酸，使溶液b1的ph值至5.50±0.05范圍內(nèi)（25±1℃）；然后用0.22μm濾膜對上述第二混合溶液b2進(jìn)行過濾，將過濾后的溶液標(biāo)記為試劑b，并置于試劑瓶中保存。

2、染色方法

將上述試劑a與試劑b以1:1質(zhì)量比例混合，搖勻配制成即用染色液。尿液樣本可以通過離心的方法濃縮，先將濃縮的尿液樣本放置在計(jì)數(shù)板中，然后將配好的染色液直接滴加到濃縮或非濃縮尿液樣本，染液與尿液樣本的比例為1：8，染色10s后即可得到染色后的尿液樣本。

實(shí)施例2

1、染色劑的制備

試劑a:

在棕色試劑瓶中按照先后順序加入100.00g乙二醇和1.20g中性紅，得到第一混合溶液a1；之后，將裝有上述第一混合溶液a1的棕色試劑瓶置于搖床上，中速溶解3小時，使得藥品完全溶解，得到第二混合溶液a2；然后用0.22um濾膜對上述第二混合溶液a2進(jìn)行過濾，將過濾后的溶液標(biāo)記為試劑a，并置于棕色瓶中保存。

試劑b:

在試劑瓶中加入100.00g純化水、2.10g（50mm）的2-（n-嗎啉）乙磺酸一水合物（mes）、4.00g丙酸鈉，4.00gedta-k2充分溶解后得到第一混合溶液b1；用丙酸將第一混合溶液b1的ph值調(diào)節(jié)至6.00±0.05范圍內(nèi)（25±1℃）；然后用0.22μm濾膜對上述第二混合溶液b2進(jìn)行過濾，將過濾后的溶液標(biāo)記為試劑b，并置于試劑瓶中保存。

2、染色方法

將上述試劑a與試劑b以0.25：1的質(zhì)量比進(jìn)行混合，搖勻后配制成即用的染色液。將通過離心法濃縮的尿液樣本放置在計(jì)數(shù)板中，然后將配好的染色液直接滴加到濃縮或非濃縮尿液樣本中，染液與尿液樣本的體積比為1：1，染色30s后即可得到染色后的尿液樣本。

實(shí)施例3

1、染色劑的制備

試劑a:

在棕色試劑瓶中按照先后順序加入100g丙三醇和0.6g中性紅，得到第一混合溶液a；之后，將裝有上述第一混合溶液a1的棕色試劑瓶置于搖床上，中速溶解3.5小時，使得藥品完全溶解，得到第二混合溶液a2；然后用0.22um濾膜對上述第二混合溶液a2進(jìn)行過濾，將過濾后的溶液標(biāo)記為試劑a，并置于棕色瓶中保存。

試劑b:

在試劑瓶中加入100g純化水、0.61g（50mm）的三羥甲基氨基甲烷（tris）、8g丙酸鈉和1.9g檸檬酸，充分溶解后得到第一混合溶液b1；用丙酸將第一混合溶液b1的ph值調(diào)節(jié)至6.70±0.05范圍內(nèi)（25±1℃）；然后用0.22μm濾膜對上述第二混合溶液b2進(jìn)行過濾，將過濾后的溶液標(biāo)記為試劑b，并置于試劑瓶中保存。

2、染色方法

將上述試劑a與試劑b以4：1的質(zhì)量比進(jìn)行混合，搖勻后即配制成即用的染色液。將通過離心法濃縮的尿液樣本放置在計(jì)數(shù)板中，然后將配好的染色液直接滴加到濃縮或非濃縮尿液樣本中，染液與尿液樣本的體積比為3：7，染色5s后即可得到染色后的尿液樣本。

實(shí)施例4

1、染色劑的制備

試劑a:

在棕色試劑瓶中按照先后順序加入5g甲醇、95g乙二醇和0.8中性紅，得到第一混合溶液a1；之后，將裝有上述第一混合溶液a1的棕色試劑瓶置于搖床上，中速溶解4小時，使得藥品完全溶解，得到第二混合溶液a2；然后用0.22um濾膜對上述第二混合溶液a2進(jìn)行過濾，將過濾后的溶液標(biāo)記為試劑a，并置于棕色瓶中保存。

試劑b:

在試劑瓶中加入100g純化水、4gbis-tris、8g丙酸鈉，充分溶解后得到第一混合溶液b1；使用丙酸將第一混合溶液b1的ph值調(diào)節(jié)至5.00±0.05范圍內(nèi)（25±1℃）；然后用0.22μm濾膜對上述第二混合溶液b2進(jìn)行過濾，將過濾后的溶液標(biāo)記為試劑b，并置于試劑瓶中保存。

2、染色方法

將上述試劑a與試劑b以3：2的質(zhì)量比進(jìn)行混合，搖勻后即配制成即用的染色液。將通過離心法濃縮的尿液樣本放置在計(jì)數(shù)板中，然后將配好的染色液直接滴加到濃縮或非濃縮尿液樣本中，染液與尿液樣本的體積比為1：6，染色20s后即可得到染色后的尿液樣本。

實(shí)施例5

1、染色劑的制備

試劑a:

在棕色試劑瓶中按照先后順序加入5g甲醇、95g乙二醇和1.2g中性紅，之后，將裝有上述第一混合溶液a1的棕色試劑瓶置于搖床上，中速溶解5小時，使得藥品完全溶解，得到第二混合溶液a2；然后用0.22um濾膜對上述第二混合溶液a2進(jìn)行過濾，將過濾后的溶液標(biāo)記為試劑a，并置于棕色瓶中保存。

試劑b:

在試劑瓶中加入100g純化水、3gbis-tris、6g丙酸鈉，充分溶解后得到第一混合溶液b1；用乙酸將第一混合溶液b1的ph值調(diào)節(jié)5.80±0.05范圍內(nèi)（25±1℃）；然后用0.22μm濾膜對上述第二混合溶液b2進(jìn)行過濾，將過濾后的溶液標(biāo)記為試劑b，并置于試劑瓶中保存。

2、染色方法

將上述試劑a與試劑b以2：3的質(zhì)量比進(jìn)行混合，搖勻后即配制成即用的染色液。將通過離心法濃縮的尿液樣本放置在計(jì)數(shù)板中，然后將配好的染色液直接滴加到濃縮或非濃縮尿液樣本中，染液與尿液樣本的體積比為1：4，染色15s后即可得到染色后的尿液樣本。

本發(fā)明中，從圖1和圖2可以看出，白細(xì)胞細(xì)胞核因染色質(zhì)密集，染成深紅色，細(xì)胞核邊界清晰，細(xì)胞漿因染色質(zhì)及蛋白成分相對較少，染色淡。

圖3、4、5中可以看出，上皮細(xì)胞細(xì)胞核因染色質(zhì)密集，染成深紅色，細(xì)胞核邊界清晰，細(xì)胞漿因染色質(zhì)及蛋白成分相對較少，染色淡。

圖6和圖7中可以看出，管型表面糖蛋白染色淡，內(nèi)含物因含有蛋白成分，染色深，清晰可辨。

圖8中可以看出，滴蟲淡染，染料增加了樣本和背景的對比度，所以可見滴蟲鞭毛和泡狀核，易與染色后的白細(xì)胞鑒別；

圖9中可以看出，染料增加了樣本和背景的對比度，精子的核和尾巴染色后清晰可見，易與不染色的酵母菌鑒別。

圖10和圖11中可以看出，尿液中的紅細(xì)胞不染色或淡染，紅細(xì)胞輪廓清晰。

圖12可以看出粘液絲和酵母菌不染色，但染色背景因染料的作用，略帶顏色，照片對比度加深，使得不染色的酵母菌易與白細(xì)胞鑒別。

可以認(rèn)為，本發(fā)明的尿液中細(xì)胞染色后快速顯色的染色劑及其使用方法對于尿液中的不同細(xì)胞，均具有較好的染色效果。

綜上所述，本發(fā)明提供了一種尿液中細(xì)胞染色后快速顯色的試劑及其使用方法，該染色劑能夠?qū)δ蛞褐械募?xì)胞進(jìn)行快速染色，不損壞紅細(xì)胞的形態(tài)，且使用方法簡單，染色后的細(xì)胞顯色均一，不僅能提高人工鏡檢的效率和準(zhǔn)確度，對流式細(xì)胞-數(shù)碼彩色成像技術(shù)的開發(fā)意義深遠(yuǎn)。

應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的應(yīng)用不限于上述的舉例，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。