一種單組份tmb顯色液及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物體外診斷試劑，特別是設(shè)及一種單組份TMB顯色液及其制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法巧LISA)具有快速、敏感、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，成為蛋白 質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域主流技術(shù)之一。W化ISA間接法為例，其主要的工作原理為：抗原包被酶標(biāo)板， 形成固相載體。如果樣本中存在相應(yīng)的IgG抗體，該抗體與酶標(biāo)板上固定的抗原相結(jié)合， 從而形成抗原-IgG抗體的免疫復(fù)合物，其余未結(jié)合成分經(jīng)洗涂被除去。加入辣根過氧化 物酶（HR巧標(biāo)記的抗人IgG抗體進(jìn)行第二步解育，與上述免疫復(fù)合物相結(jié)合形成新的免 疫復(fù)合物抗原-IgG抗體-抗人IgG-HRP，經(jīng)洗涂除去未結(jié)合成分后加入TMB底物液進(jìn)行 顯色反應(yīng)，該反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，加入終止液終止顯色反應(yīng)，溶液從藍(lán)色變?yōu)辄S色，顏色強(qiáng) 度與抗體含量成正比。檢測(cè)過程中，用酶標(biāo)儀在450nm/630nm波長(zhǎng)進(jìn)行讀數(shù)，記錄結(jié)果； 根據(jù)所測(cè)得的吸光度值數(shù)據(jù)，與對(duì)照品進(jìn)行比較，從而判斷待測(cè)樣品中抗體的水平。其中 TMB(3, 3'，5, 5'TetramethylBenzidine,即 3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺）W其高效、無毒、 不致癌、穩(wěn)定性佳等特點(diǎn)，為化ISA檢測(cè)中最常用的顯色底物。
[0003] 目前國(guó)內(nèi)上市的酶聯(lián)免疫法試劑盒多采用雙組份TMB顯色底物，即分A液和B液， 使用之前等體積混勻，由于TMB與過氧化物分開兩瓶，具體有穩(wěn)定、靈敏的特點(diǎn)。然而使用 多年后，缺點(diǎn)逐漸顯露：操作時(shí)多加一種溶液，既耗費(fèi)時(shí)間，又增加出錯(cuò)率；需要多一個(gè)試 劑瓶，增加成本，造成資源浪費(fèi)；混合過程容易產(chǎn)生不均勻，批間質(zhì)量差別較大，從而影響檢 測(cè)結(jié)果。目前國(guó)外同類產(chǎn)品多采用單組份TMB顯色底物，然而其售價(jià)昂貴，難W采用進(jìn)口原 料來進(jìn)行試劑盒產(chǎn)業(yè)化。
[0004] TMB-2肥1 (3, 3'，5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺二鹽酸）形式雖然可溶于水，甚至達(dá)到1%的 濃度，很容易就可根據(jù)試劑需要配制成濃度較高的溶液，然而所獲得的溶液容易產(chǎn)品分層 和沉淀。因此在實(shí)際應(yīng)用中更多時(shí)候是使用3, 3'，5, 5' 一四甲基聯(lián)苯胺（TMB)。由于TMB 一般不易溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。所W在TMB顯色液配制時(shí)，常用有機(jī)溶劑幫助溶解，如 最常用的二甲基亞抓值MS0)、乙醇，化及二甲基甲獻(xiàn)胺值MF)、甲醇、丙酬等。運(yùn)類有機(jī)溶劑 多易揮發(fā)、易被人體吸收等特點(diǎn)，多為蛋白變性劑，有潛在的神經(jīng)毒性或致癌性等危害。在 提倡健康和環(huán)保的今天，有機(jī)溶劑的大量使用，可能給操作者帶來健康威脅，也將給環(huán)境帶 來不可估量的損害。近年來，更多的研究在于非有機(jī)溶劑的TMB溶液體系。 陽〇化]表1示出了現(xiàn)有技術(shù)中各種TMB顯色液的組成W及TMB終濃度和過氧化氨的終 濃度，其中申請(qǐng)?zhí)枮?01210560589. 1的發(fā)明專利申請(qǐng)描述了一種單組份TMB顯色液的制 備方法："其中由A液和B液等體積混合后得到，所述A液各組分的摩爾濃度為：巧樣酸 0. 01-0. 5mol/l，憐酸氨二鋼 0. 01-0. 5mol/l，過氧化氨 0. 01-0. 5mol/l，邸14 0. 1-lmmol/ L;所述B液包括TMB、肥1和聚乙締化咯燒酬，所述TMB的摩爾濃度為0. 1-lmmol/L，所述 肥1的摩爾濃度為0. 01-0. 5mol/l，所述聚乙締化咯燒酬的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1-10%。本發(fā)明調(diào) 整了TMB的溶解體系，增加TMB的溶解度，聚乙締化咯燒酬，使單相TMB溶液在2~8度保 存溫度下，能保存2年。"
[0006] 表1中申請(qǐng)?zhí)枮?01210560589. 1發(fā)明專利有如下特點(diǎn)：（1)對(duì)重要成份聚乙締化 咯燒酬（polyvinylpyrrolidone，簡(jiǎn)稱PVP)的分子量等重要參數(shù)描述不詳盡。聚乙締化 咯燒酬，相對(duì)分子質(zhì)量從數(shù)千至一百萬W上的均聚物、共聚物和交聯(lián)聚合物系列產(chǎn)品，并W 其優(yōu)異獨(dú)特的性能獲得廣泛應(yīng)用。PVP按其平均分子量大小分為四級(jí)，習(xí)慣上常WK值表 示，不同的K值分別代表相應(yīng)的PVP平均分子量范圍。K值實(shí)際上是與PVP水溶液的相對(duì) 粘度有關(guān)的特征值，而粘度又是與高聚物分子量有關(guān)的物理量，因此可W用K值來表征PVP 的平均分子量。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越強(qiáng)。不同的分子量的性質(zhì)各異，溶解 度各不同，如不詳細(xì)規(guī)定，難W精確重復(fù)實(shí)驗(yàn)。（2)實(shí)施例1中，B液中過氧化氨濃度最高達(dá) 0. 5111〇1/1，終濃度為0. 25111〇1/1，運(yùn)大大超過目前所有相關(guān)專利或產(chǎn)品中的相關(guān)描述（見表 1)，超過一般認(rèn)可的"1-lOmM"。過氧化氨濃度一般與TMB含量對(duì)應(yīng)，過多量則引起本底極大 的提高，導(dǎo)致產(chǎn)品不穩(wěn)定。
[0007] 表 1


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供穩(wěn)定性高、保存時(shí)間長(zhǎng)、環(huán)保型的單組份TMB顯 色液，本發(fā)明還提供了所述單組份TMB顯色液的制備方法。
[0010] 本發(fā)明提供了一種單組份TMB顯色液，其由A液和B液混合而成；所述A液是由過 氧化脈溶于巧樣酸-巧樣酸鋼緩沖液制備而成；所述B液是由聚乙締醇、聚乙締化咯燒酬、 TMB和甘油溶于巧樣酸-巧樣酸鋼緩沖液制備而成。
[0011] 所述過氧化脈在A液中的濃度為2-20mmol/L。 陽012] 所述聚乙締醇在B液中的質(zhì)量體積比為0. 4-1. 0%，所述聚乙締化咯燒酬在B液中 的質(zhì)量體積比為5-10 %，所述TMB在B液中的質(zhì)量體積比為0. 04-0. 1 %，所述甘油在B液 中的體積比1-2%。
[0013] 所述巧樣酸-巧樣酸鋼緩沖液的濃度為0.Imol/L。
[0014] 所述A液和B液W1:1的體積比混合而成。
[0015] 本發(fā)明還提供了所述的單組份TMB顯色液的制備方法，包括如下步驟：
[0016] (1)A液：取巧樣酸-巧樣酸鋼緩沖液，加入過氧化脈，攬拌使之充分溶解，W巧樣 酸-巧樣酸鋼緩沖液定容，避光密封暫存。
[0017] (2)B液：稱取聚乙締醇，邊攬拌邊將其加入巧樣酸-巧樣酸鋼緩沖液中，將其溶解 直到溶液不再含有微小顆粒；加入聚乙締化咯燒酬，使之充分溶解；降至室溫后，加入TMB， 攬拌使充分溶解；最后，加入甘油，攬拌使之充分溶解；W巧樣酸-巧樣酸鋼緩沖液定容。 陽〇1引 （3)將A液和B液混合均勻。
[0019] (4)過濾獲得均一的溶液，即為單組份TMB顯色液。
[0020] 所述巧樣酸-巧樣酸鋼緩沖液的濃度為0.Imol/L，抑為3. 5-3. 8。
[0021] 所述過氧化脈在A液中的濃度為2-20mmol/L。
[0022] 所述聚乙締醇在B液中的質(zhì)量體積比為0. 4-1. 0%，所述聚乙締化咯燒酬在B液中 的質(zhì)量體積比為5-10 %，所述TMB在B液中的質(zhì)量體積比為0. 04-0. 1 %，所述甘油在B液 中的體積比1-2%。
[0023] 所述步驟（3)中的A液和B液是W1:1的體積比混合而成，所述步驟（4)中的過 濾是采用孔徑20-60ym的濾紙。
[0024] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)勢(shì)：
[00巧]1、本發(fā)明的單組份TMB顯色液采用巧樣酸-巧樣酸鋼緩沖體系，可維持較低的酸 性環(huán)境（pH3. 5-3. 8)，促進(jìn)TMB的溶解；巧樣酸鋼可馨合二價(jià)離子，消除溶液中離子的干擾， 可維持顯色底物在溶液中的穩(wěn)定性。
[00%] 2、本發(fā)明的單組份TMB顯色液采用非有機(jī)溶劑體系，可保護(hù)操作者遠(yuǎn)離有機(jī)溶劑 的危害，并減少對(duì)環(huán)境的損害。
[0027] 3、引入安全的聚乙締醇及聚乙締化咯燒酬助溶TMB，使本發(fā)明的單組份TMB顯色 液形成穩(wěn)定的水溶液體系。
[002引 4.采用穩(wěn)定的過氧化脈作為氧化物，在聚乙締醇及聚乙締化咯燒酬共同作用下， 使本發(fā)明的單組份TMB顯色液更加穩(wěn)定。
[0029] 5.甘油在冷藏環(huán)境具有一定的抗凍效果，配合其它組分使用可W使本發(fā)明的單組 份TMB顯色液在2-8 °C保存24個(gè)月。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 本發(fā)明提供了一種單組份TMB顯色液，由A液和B液W1:1的體積比混合而成。
[0031] 所述A液是由過氧化脈溶于巧樣酸-巧樣酸鋼緩沖液制備而成；
[0032] 所述B液是由聚乙締醇、聚乙締化咯燒酬、TMB和甘油溶于巧樣酸-巧樣酸鋼緩沖 液制備而成。
[0033] 優(yōu)選的，所述過氧化脈占A液的濃度為2-20mmol/l，所述巧樣酸-巧樣酸鋼緩沖液 的濃度為0.Imol/L。
[0034] 優(yōu)選的，所述聚乙締醇占B液的質(zhì)量體積比（w/v)為0. 4-1.0%，所述聚乙締化 咯燒酬占B液的質(zhì)量體積比（w/v)為5-10 %，所述TMB占B液的質(zhì)量體積比（w/v)為 0. 04-0. 1 %，所述甘油占B液的體積比（v/v) 1-2%，所述巧樣酸-巧樣酸鋼緩沖液的濃度為 0.Imol/L。
[0035] 所述巧樣酸-巧樣酸鋼緩沖液的濃度為為0.Imol/L，抑為3. 5-3. 8,是一種低抑 緩沖體系，巧樣酸鋼是一種馨合劑，可W增加顯色底物的穩(wěn)定性，使顯色底物的保存期延 長(zhǎng)。本發(fā)明單組份顯色底物的制備采用低抑緩沖體系，再配合其它助溶劑聚乙締醇和聚乙 締化咯燒酬一起使用，更容易形成穩(wěn)定的體系。
[0036] 本發(fā)明采用聚乙締醇（PVA)和聚乙締化咯燒酬（PV巧作為助溶劑。
[0037] 所述聚乙締醇是一種高分子聚合物，不溶于丙酬、醋酸乙醋、甲醇、乙二醇等有機(jī) 溶劑，微溶于二甲基亞諷，聚乙締醇含有許多醇基，具有極性，且可與水形成氨鍵，故溶于 水；同時(shí)其又是一種極安全的高分子有機(jī)物，對(duì)人體無毒，無副作用，具有良好的生物相容 性，也可用作穩(wěn)定劑、分散劑、乳化劑等。本發(fā)明在配方中加入了聚乙締醇，可幫助TMB的 溶解和穩(wěn)定存在，且安全可靠；本發(fā)明優(yōu)選采用聚乙締醇1788,1788表示聚合度為1700,醇 解度為88%，運(yùn)樣就更易溶解、粘度性中且成本低。為了完全溶解PVA1788 -般需加熱到 65-75°C，一般配制不超過5-8% (m/v)，濃度過高容易膠化。
[0038] 所述聚乙締化咯燒酬（PV巧是一種水溶性聚酷胺，PVP溶于水、含氯溶劑、乙 醇、胺、硝基燒控W及低分子脂肪酸，與大多數(shù)無機(jī)鹽和多種樹脂相溶，不溶于丙酬、乙酸 等；PVP不易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，在正常條件下膽存，干燥的PVP是很穩(wěn)定的；PVP具有優(yōu)良的 生理惰性和生物相容性，對(duì)皮膚、眼睛無刺激，無過敏反應(yīng)，無毒。本發(fā)明采用PVP作助 溶劑，可幫助TMB溶解，同時(shí)使之穩(wěn)定存在，且安全無毒。本發(fā)明優(yōu)選采用聚乙締化咯燒 酬K-30,其在水中的溶解度可達(dá)Ig/ml，醇解度為87. 0-89. 0% (mol/mol)、平均分子量為 45, 000-58, 000,其更易獲得和易溶解。
[0039] 本發(fā)明的顯色底物TMB適用于W過氧化物為酶促反應(yīng)底物的顯色系統(tǒng)中。其中所 述的過氧化物為1-lOmM的過氧化脈（也稱過氧化尿素，下同），較過氧化氨穩(wěn)定，W此類物 質(zhì)為底物的酶為辣根過氧化酶（HRP)。
[0040] 所述甘油與其它組分配合使用，可增加冷藏條件下的穩(wěn)定性。
[0041] 本發(fā)明還提供了上述單組份TMB顯色液的制備方法，包括如下步驟：
[0042] (1)A液：取900ml巧樣