Kindlin-2,Myosin-9和AnnexinⅡ三蛋白聯(lián)合預(yù)測食管鱗癌患者預(yù)后試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測石蠟包埋組織中目的蛋白表達(dá)情況的試劑。本發(fā)明解決該技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供了一種評價食管鱗癌患者預(yù)后信息的檢測試劑盒。該試劑盒包括3種目的蛋白的抗體-Annexin II、Kindlin-2和Myosin-9抗體，還包括山羊血清、0.01M檸檬酸鹽修復(fù)液、3％H2O2、Polymer增強劑、Polymer聚合物、DAB顯色試劑、PBS溶液。使用該試劑盒可評價食管鱗癌患者的預(yù)后，比國際TNM分期簡單、易行，且敏感性及特異性均比較高，以及更適用于國人的食管鱗癌預(yù)后評估。
【專利說明】Kindi in-2，Myosin-9和Annexin I I三蛋白聯(lián)合預(yù)測食管 鱗癌患者預(yù)后試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及聯(lián)合多個蛋白抗體，并利用免疫組織化學(xué)超敏型二步法，去檢測食管 鱗癌患者標(biāo)本的表達(dá)情況，進而預(yù)測患者預(yù)后的試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 食管鱗狀細(xì)胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma，ESCC)，簡稱食管鱗癌， 在我國是一種常見的上消化道惡性腫瘤，在國人的惡性腫瘤死亡率中位居第四位。全世界 每年40余萬的新發(fā)食管鱗癌病例中，一半以上發(fā)生在我國，我國也是世界上公認(rèn)的食管鱗 癌第一高發(fā)國。上世紀(jì)70年代，在全國范圍內(nèi)實施了惡性腫瘤普查，確立河北磁縣、河南林 縣、山西陽泉、四川鹽亭、廣東潮汕和江蘇淮安等地區(qū)為中國食管鱗癌六大高發(fā)區(qū)。
[0003] 準(zhǔn)確預(yù)測食管鱗癌患者的預(yù)后對于臨床進一步的治療和隨訪具有重要意義。然 而，目前除了國際?m分期外，還沒有一種簡便有效的方法可以更加準(zhǔn)確地預(yù)測食管鱗癌 患者的預(yù)后。然而，TNM分期預(yù)測患者的預(yù)后比較繁瑣，需要準(zhǔn)確地評價腫瘤的浸潤深度、轉(zhuǎn) 移淋巴結(jié)的個數(shù)、腫瘤有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，況且國際?!分期的制定缺少大量國人食管鱗癌 的病例資料，因此在評價我國患者的預(yù)后時適用性比較差，而本發(fā)明所采用的3個指標(biāo)聯(lián) 合預(yù)測患者預(yù)后的試劑盒比單個指標(biāo)檢測具有更高的預(yù)測效果，并且本發(fā)明所基于的免疫 組織化學(xué)超敏型二步法是一種成熟可靠、可在基層醫(yī)院廣泛使用的方法。本試劑盒中3種 蛋白抗體的背景介紹如下：
[0004] Annexin II是f丐調(diào)結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞的生長和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。最近許多研究表 明，Annexins表達(dá)易位與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，分化程度不同Annexins表達(dá)也不同。由于其 作用廣泛，包括細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接、細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架的連接、細(xì)胞運動和內(nèi)吞作用、 幾乎腫瘤病理狀態(tài)所有進程，Annexins會是一個很好的腫瘤發(fā)生發(fā)展的診斷或預(yù)后指標(biāo)。 研究發(fā)現(xiàn)，Annexin II在前列腺癌是下調(diào)表達(dá)的，但在前列腺癌細(xì)胞系中是上調(diào)表達(dá)的；在 肝細(xì)胞癌、腸癌、乳腺癌和食管鱗癌等等也是上調(diào)表達(dá)的。我們的實驗結(jié)果同Zhang X和 Feng JG等人，在食管鱗癌中呈過表達(dá)。
[0005] Kindlin-2是粘著斑蛋白，參與整合素的激活。關(guān)于Kindlin-2的研究比較 少，目前一些研究表明，Kindlin-I與Kindlin-3的基因缺失可導(dǎo)致某些遺傳性疾病，而 Kindlin-2不存在基因缺陷相關(guān)疾病。Kindlin-2在乳腺癌細(xì)胞系和組織中、胃癌細(xì)胞 系呈過表達(dá)；而在子宮平滑肌瘤細(xì)胞系和大腸癌細(xì)胞系中呈下調(diào)表達(dá)，并抑制細(xì)胞的侵 襲；而在前列腺癌細(xì)胞系中表達(dá)不一，但是在前列腺癌對順鉬敏感起到重要的作用，針對 Kindlin-2藥物靶點可改善療效和減少藥物劑量。然而，在國人惡性腫瘤死亡率居第四位的 食管鱗癌中，Kindlin-2的表達(dá)情況如何及其與患者預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。本發(fā)明的前期 研究發(fā)現(xiàn)Kindlin-2在食管鱗癌組織中高表達(dá)并與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。
[0006] Myosin-9屬于非肌肉組織肌球蛋白家族，也叫Myosin IIA重鏈，與胞質(zhì)分裂、細(xì) 胞運動和維持細(xì)胞形態(tài)有關(guān)。許多研究表明，MYH9基因易位、突變或融合均可導(dǎo)致嚴(yán)重遺 傳性疾病。Myosin IIA在肺腺癌、食管鱗癌中呈過表達(dá)，與不良預(yù)后有關(guān)；在乳腺癌細(xì)胞系 MCF-7中是其細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵蛋白，并表明是抗侵襲治療的候選靶點；胃癌中通過直接靶 向作用MYH9抑制癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。我們的實驗結(jié)果與Xia ZK等人一致。
[0007] 雖然上述每種蛋白均具有預(yù)測食管鱗癌患者預(yù)后的能力，但把3種蛋白聯(lián)合起來 預(yù)測食管鱗癌患者的預(yù)后則具有更強的判斷效能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于免疫組織化學(xué)方法的3個蛋白抗體 聯(lián)合預(yù)測食管鱗癌患者預(yù)后的試劑盒。
[0009] 其中，上述的免疫組織化學(xué)方法主要是檢測中性福爾馬林固定和石蠟包埋的標(biāo) 本。
[0010] 其中，上述試劑盒主要包括3種蛋白抗體，分別是Annexin II、Kindlin-2和 Myosin-9 抗體。
[0011] 其中，上述試劑盒還包括：山羊血清，0. OlM朽1檬酸鹽修復(fù)液,3% H2O2, Polymer增 強劑，Polymer聚合物，DAB顯色試劑，PBS溶液。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1是Annexin II蛋白在不同表達(dá)人群的Kaplan-Meier生存曲線（P = 0? 0014)。 圖2是Kindlin-2蛋白在不同表達(dá)人群的Kaplan-Meier生存曲線（P = 0. 053)。圖3是 Myosin-9蛋白在不同表達(dá)人群的Kaplan-Meier生存曲線（P = 0? 015)。圖4是3種蛋白 聯(lián)合后，判斷該人群的Kaplan-Meier生存曲線（P = 0.000)。圖5是ROC曲線（注：3種蛋 白聯(lián)合后形成的曲線下面積為〇. 617)。

【具體實施方式】
[0013] 我們收集了 110例2000-2006年的食管鱗癌患者的手術(shù)標(biāo)本存檔蠟塊。下面結(jié)合 附圖實施例作進一步詳細(xì)描述。
[0014] 免疫組織化學(xué)超敏型二步法步驟如下：
[0015] 標(biāo)本經(jīng)連續(xù)切片、二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，用超敏型二步法檢測目的蛋白的 表達(dá)。
[0016] 具體方法如下：
[0017] (1)切片經(jīng)0. OlM檸檬酸鹽修復(fù)液抗原修復(fù)、3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶、山 羊血清封閉后，分別與Annexin II、Kindlin-2和Myosin-9抗體4°C孵育過夜；
[0018] (2)切片與Polymer增強劑和Polymer聚合物分別孵育后經(jīng)DAB顯色；
[0019] (3)切片經(jīng)蘇木素復(fù)染核，梯度酒精脫水，二甲苯透明和中性樹膠封片；
[0020] (4)切片在完成上述每步后均經(jīng)PBS溶液洗滌。
[0021] 所有的免疫染色切片經(jīng)2位病理醫(yī)師采用盲法獨立評分。腫瘤細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃 色顆粒被認(rèn)為是陽性信號。染色強度分為4級：0,陰性；1，弱染色；2,中度染色；3,強染色。 陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分為5級：0,0?5% ;1，6?25%;2,26?50% ;3,51?75% ;4,彡76%。 每個標(biāo)本的總分?jǐn)?shù)是由腫瘤細(xì)胞染色強度和腫瘤細(xì)胞陽性百分?jǐn)?shù)兩部分的乘積得出的，范 圍是O?12。為了方便統(tǒng)計，我們把所有病例分為低表達(dá)和高表達(dá)2組，O代表低表達(dá)組，I 代表高表達(dá)組，其cut-off值根據(jù)X-tiIe軟件確定。Annexin II :0?2. 5分為低表達(dá)組， 3?12分為高表達(dá)組；Kindlin-2 :0?6分為低表達(dá)組，7?12分為高表達(dá)組；Myosin-9 : 〇?7分為低表達(dá)組，8?12分為高表達(dá)組。
[0022] 3個指標(biāo)聯(lián)合起來判斷食管鱗癌患者預(yù)后的方程式如下：
[0023] Y = ^XA+^XB+^XC，其中為系數(shù)，通過單變量Cox回歸可以得出數(shù)值， Y = 0? 808XA+0. 522XB+0. 829XC ;A、B、C 分別為該例標(biāo)本中 Annexin II、Kindlin-2、 Myosin-9蛋白的表達(dá)狀態(tài)，0代表低表達(dá)，1代表高表達(dá)。計算出每例標(biāo)本的Y值后按照從 小到大的順序排列,其中位于中間位置的病例對應(yīng)的Y值為cut-off值，即0. 808。小于等 于該值的病例為低危組，高于該值的病例為高危組，這樣分成2組后再進行單因素統(tǒng)計分 析。此外，也可以通過繪制ROC曲線去比較每個蛋白形成的曲線下面積（AUC)的大小。
[0024] 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理：
[0025] 使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。各蛋白的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大 小、腫瘤位置、腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、?M分期、治療之間的關(guān)系使用 theKendall' s tau-b檢驗；各蛋白的表達(dá)與患者的生存時間的關(guān)系使用Kaplan-Meier生 存分析；預(yù)測影響患者預(yù)后的獨立危險因素使用Cox比例風(fēng)險回歸模型；每種蛋白預(yù)測食 管鱗癌患者預(yù)后的效能使用ROC曲線；P < 0. 05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)顯著性。
[0026] 結(jié)果顯示：
[0027] 3個蛋白的表達(dá)都與食管鱗癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。各臨床指標(biāo)與各蛋白的 Cox風(fēng)險回歸模型預(yù)測患者的獨立危險因素如下：
[0028] 3個蛋白聯(lián)合后可作為判斷食管鱗癌預(yù)后的獨立預(yù)后因子。
[0029]

【權(quán)利要求】
1. 一種預(yù)測食管鱗癌患者預(yù)后的試劑盒，其特征在于試劑盒中包括抗Annexin II、抗 Kindlin-2和抗Myosin-9三種蛋白抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)測食管鱗癌患者預(yù)后的試劑盒，其特征在于：試劑盒中還 包括山羊血清、0? 01M檸檬酸鹽修復(fù)液、3% H202、Polymer增強劑、Polymer聚合物、DAB顯色 試劑、PBS溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其應(yīng)用在于聯(lián)合預(yù)測食管鱗癌患者的預(yù)后。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于使用試劑盒所檢測的標(biāo)本為中性福爾馬林 固定和石蠟包埋的組織蠟塊。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于：所使用的檢測方法為免疫組織化學(xué) 超敏型二步法。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項所述的應(yīng)用，其特征在于預(yù)測食管鱗癌患者預(yù)后的方法包 括如下步驟：標(biāo)本經(jīng)切片、脫蠟、水化后用超敏型二步法檢測目的蛋白的表達(dá)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于預(yù)測食管鱗癌患者預(yù)后的方法具體如 下：切片經(jīng)脫蠟至水、抗原修復(fù)、滅活內(nèi)源性過氧化物酶和山羊血清封閉后，分別與一抗 Annexin II、Kindlin-2和Myosin-9在保濕盒內(nèi)孵育過夜；隨后分別與Polymer增強劑和 Polymer聚合物孵育后經(jīng)DAB顯色和蘇木素復(fù)染細(xì)胞核；最后經(jīng)酒精脫水和二甲苯透明后 用中性樹膠封片，并對每張免疫組化染色切片進行評分。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3-7任一項所述的應(yīng)用，其特征在于：每種蛋白表達(dá)高低的cut-off 值由X-tile軟件確定，其中Annexin II的cut-off值是3分，Kindlin-2的cut-off值是 7 分，Myosin-9 的 cut-off 值是 8 分。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3-8任一項所述的應(yīng)用，其特征在于：每例標(biāo)本在應(yīng)用3種抗體分別 檢測后，其3種蛋白聯(lián)合表達(dá)的計算公式為y= hxA+e2xB+e3xc，其中為系數(shù)，可 以通過Cox回歸得出，故該公式轉(zhuǎn)換為Y = 0. 808XA+0. 522XB+0. 829XC ;A、B、C分別為該 例標(biāo)本中Annexin II、Kindlin-2、Myosin_9蛋白的表達(dá)狀態(tài)，0代表低表達(dá)，1代表高表達(dá)； 在計算出每例標(biāo)本的Y值后按照從小到大的順序排列，其中位于中間位置的標(biāo)本所對應(yīng)的 Y值為cut-off值，即0. 808,那么低于該值的病例為低危組，高于該值的病例為高危組。
10. 根據(jù)權(quán)利要求3-9任一項所述的應(yīng)用，其特征在于：評價個體食管鱗癌患者預(yù)后的 信息時，只需把該患者3個蛋白的免疫組化得分所對應(yīng)的表達(dá)狀態(tài)代入公式中，就可以得 出Y值，然后與我們確定的cut-off值0. 808比較，小于該值的患者屬于低危組，其5年生 存率為53. 5%，而大于該值的患者屬于高危組，其5年生存率為21. 0%。
【文檔編號】G01N33/68GK104407151SQ201410693622
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】許麗艷, 曹卉慧, 許秀娥, 吳健誼, 李恩民 申請人:汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院