一種基于乳酸氧化酶電極膜的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于乳酸氧化酶電極膜的制備方法以及通過上述制備方法制得的乳酸氧化酶電極膜。將本發(fā)明的乳酸氧化酶電極膜用作乳酸傳感器的組件，可以有效阻止樣本中的還原性電活性物質(zhì)到達電極表面發(fā)生氧化反應產(chǎn)生電信號，從而增大了電極的抗干擾能力；再者，由于采用適當孔徑的聚碳酸酯膜作為擴散限制膜，提高了乳酸檢測的線性且擴大了檢測范圍。
【專利說明】
一種基于乳酸氧化酶電極膜的制備方法及其產(chǎn)品

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及酶電極領域，具體涉及一種基于乳酸氧化酶電極膜的制備方法及其產(chǎn)品O

【背景技術】
[0002]乳酸為人體內(nèi)糖無氧降解的最終產(chǎn)物，乳酸中毒是代謝性酸中毒中最常見的類型之一，表現(xiàn)為血乳酸濃度增高。通過測量人體血液中的乳酸含量不僅可以揭示某些疾病的嚴重程度，便于診斷和治療，也可以用于運動醫(yī)學，科學的控制運動員的訓練強度，達到最佳訓練效果。
[0003]目前，血液乳酸檢測主要是通過大型血液生化分析儀，這種方法不僅需血量較多，測量時間也較長，不能滿足急診對病人快速診斷的需求。
[0004]酶電極法是將含有酶的凝膠涂布于某種離子選擇性電極的敏感膜上，所構成的電極稱為酶電極。酶電極與樣本或試劑接觸后，酶會催化響應底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物，產(chǎn)物經(jīng)酶凝膠層擴散至離子選擇電極的敏感膜上，在適當?shù)碾妷合掳l(fā)生得失電子的氧化還原反應，從而產(chǎn)生響應的電信號。該信號與底物濃度之間有一定的對應關系，從而可以計算出底物的濃度。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:本發(fā)明的第一個目的是提供一種基于乳酸氧化酶電極膜的制備方法。本發(fā)明的第二個目的是提供上述乳酸氧化酶電極膜。將這種電極膜與流動注入式氧電極組成乳酸傳感器，可提高傳感器的使用性能，可快速方便的檢測血液中乳酸含量，應用于醫(yī)療器械和臨床檢測等生物醫(yī)學領域。
[0006]技術方案:為了解決上述問題，本發(fā)明的技術方案是提供一種基于乳酸氧化酶電極膜的制備方法，包括以下步驟廣3或者步驟廣4:
1)將醋酸纖維素溶解于環(huán)己酮中，得到1%?5%的無色醋酸纖維素成膜液，并將得到的成膜液均勻平鋪在玻璃平板表面，待在空氣中晾干即得一層醋酸纖維素薄膜；
2)將乳酸氧化酶溶解在含有0.4ml 1mM PBS,0.4ml 2.5%戊二醛和1.6ml 150mM草酸鈉的混合溶液中，攪拌均勻后再加入0.1ml 0.5mM甘氨酸得到混合物，將混合物超濾至0.4ml，最后加入0.4ml含穩(wěn)定劑的1mM咪唑緩沖液混勻得到乳酸氧化酶終濃度為20?50mg/ml的酶液；
3)將步驟2)配制的酶液滴加到步驟I)制得的醋酸纖維素薄膜表面，并將第一層聚碳酸酯膜貼合其上，將多余溶液擠出，晾干后即得雙層乳酸氧化酶電極膜；
4)將含50?120mg/ml牛血清白蛋白和0.2?0.5%戊二醛的混合物滴加至步驟3)制得的雙層乳酸氧化酶膜的第一層聚碳酸酯膜上得到帶有混合物的雙層乳酸氧化酶膜，再用第二層聚碳酸酯膜貼合在帶有混合物的雙層乳酸氧化酶膜上，并將多余溶液擠出，晾干后即得三層乳酸氧化酶電極膜。
[0007]其中，所述步驟I)中的醋酸纖維素薄膜厚度為2?10mm。
[0008]其中，所述步驟2)中的穩(wěn)定劑為海藻糖、蔗糖、甲殼素中的一種，其含量為109^50%。
[0009]其中，所述步驟3)中第一層聚碳酸酯膜的孔徑為10?30nm、厚度為5?15mm。
[0010]其中，所述步驟4)中第二層聚碳酸酯膜的孔徑為15?50nm、厚度為4?20mm。
[0011]由所述的制備方法得到的乳酸氧化酶電極膜，為雙層酶電極膜或者三層酶電極膜。
[0012]其中，所述雙層酶電極膜包括醋酸纖維素薄膜和第一層聚碳酸酯膜，其中，醋酸纖維素薄膜和第一層聚碳酸酯膜中間夾附乳酸氧化酶層。
[0013]其中，所述三層酶電極膜包括醋酸纖維素薄膜、第一層聚碳酸酯膜和第二層聚碳酸酯膜，其中，醋酸纖維素薄膜和第一層聚碳酸酯膜中間夾附乳酸氧化酶層，第一層聚碳酸酯膜和第二層聚碳酸酯膜中間夾附牛血清白蛋白/戊二醛層。
[0014]有益效果:本發(fā)明由于采用適當孔徑的聚碳酸酯(PC)膜作為擴散限制膜，降低了乳酸分子的擴散速度，而氧氣卻可以完全通過，使乳酸分子的擴散過程成為整個反應的控制過程，酶膜內(nèi)的乳酸濃度始終保持在較低的濃度范圍內(nèi)，同時氧氣足量，可使酶膜內(nèi)較低濃度的乳酸完全被氧化，達到擴大乳酸電極檢測范圍和提高線性的目的；同時，由于外膜聚碳酸酯(PC)膜和內(nèi)膜醋酸纖維素(CA)膜的物理阻隔，故可以有效阻止樣本中的還原性電活性物質(zhì)到達電極表面發(fā)生氧化反應，從而增大了電極的抗干擾能力；再者，由于外膜聚碳酸酯(PC)膜的孔徑較小，還可以有效防止乳酸氧化酶大分子的泄漏，延長電極的使用壽命。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明實施例1的結構示意圖；
圖2為本發(fā)明實施例2的結構示意圖；
圖3為本發(fā)明乳酸濃度與傳感器響應電壓(mV)值關系圖。
[0016]

【具體實施方式】
[0017]下面結合附圖對本發(fā)明作更進一步的說明。
[0018]實施例1
一種基于乳酸氧化酶電極膜的制備方法，第一步，將醋酸纖維素(CA)溶解于環(huán)己酮中，得到1%的無色CA成膜液，并將得到的成膜液均勻平鋪在玻璃平板表面，待在空氣中晾干即得一層厚度為2mm的CA薄膜I ;第二步，配制含0.4ml 1mM PBS,0.4ml 2.5%戊二醛和1.6ml 150mM草酸鈉的混合溶液，并加入一定量的乳酸氧化酶(L0D)，攪拌均勻后再加入
0.1ml 0.5mM甘氨酸，將混合物超濾至0.4ml，最后加入0.4ml含10%海藻糖的1mM咪唑緩沖液，混勻得到LOD終濃度為20mg/ml的酶液；第三步，將第二步配制的溶液滴加到第一步制得的CA薄膜I表面得到單層乳酸氧化酶膜，并將孔徑10nm、厚度5mm的第一層聚碳酸酯(PO膜3貼合在單層乳酸氧化酶膜上，將多余溶液擠出，晾干后即得雙層乳酸氧化酶膜。
[0019]如圖1，由上述制備方法制得的乳酸氧化酶電極膜為雙層酶電極膜，所述雙層酶電極膜包括醋酸纖維素薄膜I和第一層聚碳酸酯膜3，其中，醋酸纖維素薄膜I和第一層聚碳酸酯膜3中間夾附乳酸氧化酶層2。
[0020]如圖1中，當樣品中的乳酸分子流經(jīng)電極通道時，直接穿過第一層聚碳酸酯膜3與乳酸氧化酶層2中的乳酸氧化酶(LOD)反應，生成的過氧化氫繼續(xù)穿過醋酸纖維素薄膜I到達處于電解質(zhì)溶液6之中的Pt電極4表面發(fā)生氧化還原反應,產(chǎn)生電信號,AgCl/Ag電極5作為反應的陰極。產(chǎn)生的電信號的強弱與樣品中乳酸濃度的大小呈正相關，從而可以計算出樣品中的乳酸濃度。
[0021]實施例2:
一種基于乳酸氧化酶電極膜的制備方法，第一步，將醋酸纖維素(CA)溶解于環(huán)己酮中，得到1%的無色CA成膜液，并將得到的成膜液均勻平鋪在玻璃平板表面，待在空氣中晾干即得一層厚度為2mm的CA薄膜I ;第二步，配制含0.4ml 1mM PBS,0.4ml 2.5%戊二醛和1.6ml 150mM草酸鈉的混合溶液，并加入一定量的乳酸氧化酶(L0D)，攪拌均勻后再加入
0.1ml 0.5mM甘氨酸，將混合物超濾至0.4ml，最后加入0.4ml含10%海藻糖的1mM咪唑緩沖液，混勻得到LOD終濃度為20mg/ml的酶液；第三步，將第二步配制的溶液滴加到第一步制得的CA薄膜I表面得到單層乳酸氧化酶膜，并將孔徑20nm、厚度1mm的第一層聚碳酸酯(PC)膜3貼合在單層乳酸氧化酶膜上，將多余溶液擠出，晾干后即得雙層乳酸氧化酶膜;第四步，將含50mg/ml牛血清白蛋白(BSA)和0.2%戊二醛的混合物滴加至制得的雙層酶膜的第一層PC膜3，用孔徑50nm、厚度1mm的第二層PC膜8貼合在帶有混合物的雙層乳酸氧化酶膜上，并將多余溶液擠出，中間形成一層膜為牛血清白蛋白/戊二醛層7，晾干后即得三層乳酸氧化酶電極膜。
[0022]如圖2，由上述制備方法制得的乳酸氧化酶電極膜為三層酶電極膜，所述三層酶電極膜包括醋酸纖維素薄膜1、第一層聚碳酸酯膜3和第二層聚碳酸酯膜8，其中，醋酸纖維素薄膜I和第一層聚碳酸酯膜3中間夾附乳酸氧化酶層2，第一層聚碳酸酯膜3和第二層聚碳酸酯膜8中間夾附牛血清白蛋白/戊二醛層7。
[0023]如圖2，樣品中的乳酸分子流經(jīng)電極通道時，首先穿過最外層的PC膜8和BSA/戊二醛層7到達第一層PC膜3，再穿過第一層PC膜3與乳酸氧化酶層2中的乳酸氧化酶(LOD)反應，生成的過氧化氫繼續(xù)穿過醋酸纖維素(CA)薄膜I到達處于電解質(zhì)溶液6之中的Pt電極4表面發(fā)生氧化還原反應,產(chǎn)生電信號,AgCl/Ag電極5作為反應的陰極。產(chǎn)生的電信號的強弱與樣品中乳酸濃度的大小呈正相關，從而可以計算出樣品中的乳酸濃度。
[0024]實施例3
一種基于乳酸氧化酶電極膜的制備方法，第一步，將醋酸纖維素(CA)溶解于環(huán)己酮中，得到5%的無色CA成膜液，并將得到的成膜液均勻平鋪在玻璃平板表面，待在空氣中晾干即得一層厚度為1mm的CA薄膜I ;第二步，配制含0.4ml 1mM PBS,0.4ml 2.5%戊二醛和1.6ml 150mM草酸鈉的混合溶液，并加入一定量的乳酸氧化酶(L0D)，攪拌均勻后再加入
0.1ml 0.5mM甘氨酸，將混合物超濾至0.4ml，最后加入0.4ml含50%蔗糖的1mM咪唑緩沖液，混勻得到LOD終濃度為50mg/ml的酶液；第三步，將第二步配制的溶液滴加到第一步制得的CA薄膜I表面得到單層乳酸氧化酶膜，并將孔徑15nm、厚度1mm的第一層聚碳酸酯(PO膜3貼合在單層乳酸氧化酶膜上，將多余溶液擠出，晾干后即得雙層乳酸氧化酶膜。
[0025]實施例4
一種基于乳酸氧化酶電極膜的制備方法，第一步，將醋酸纖維素(CA)溶解于環(huán)己酮中，得到5%的無色CA成膜液，并將得到的成膜液均勻平鋪在玻璃平板表面，待在空氣中晾干即得一層厚度為1mm的CA薄膜I ;第二步，配制含0.4ml 1mM PBS,0.4ml 2.5%戊二醛和1.6ml 150mM草酸鈉的混合溶液，并加入一定量的乳酸氧化酶(LOD)，攪拌均勻后再加入
0.1ml 0.5mM甘氨酸，將混合物超濾至0.4ml，最后加入0.4ml含30%蔗糖的1mM咪唑緩沖液，混勻得到LOD終濃度為50mg/ml的酶液；第三步，將第二步配制的溶液滴加到第一步制得的CA薄膜I表面得到單層乳酸氧化酶膜，并將孔徑15nm、厚度15mm的第一層聚碳酸酯(PC)膜3貼合在單層乳酸氧化酶膜上，將多余溶液擠出，晾干后即得雙層乳酸氧化酶膜；第四步，將含120mg/ml牛血清白蛋白(BSA)和0.5%戊二醛的混合物滴加至制得的雙層酶膜的第一層PC膜3，用孔徑30nm、厚度15mm的第二層PC膜8貼合在帶有混合物的雙層乳酸氧化酶膜上，并將多余溶液擠出，中間形成一層膜為牛血清白蛋白/戊二醛層7，晾干后即得三層乳酸氧化酶電極膜。
[0026]實施例5
將實施例4中制備得到的電極膜與流動注入式氧電極組成如圖2所示的乳酸傳感器，當樣品中的乳酸分子流經(jīng)電極通道時，先穿過第二層聚碳酸酯膜8和牛血清白蛋白/戊二醛層7后，再穿過第一層聚碳酸酯膜3與乳酸氧化酶層2中的乳酸氧化酶(LOD)反應，生成的過氧化氫繼續(xù)穿過醋酸纖維素薄膜I到達處于電解質(zhì)溶液6之中的Pt電極4表面發(fā)生氧化還原反應，產(chǎn)生電流信號，AgCl/Ag電極5作為反應的陰極。產(chǎn)生的電流信號經(jīng)過處理轉(zhuǎn)化為電壓信號，其強弱與樣品中乳酸濃度的大小呈正相關，從而可以計算出樣品中的乳酸濃度。將濃度分別為0.5，2，4，10，20 mM的乳酸溶液注入至上述制備得到的乳酸傳感器中，30s內(nèi)在0.7V電壓下測試，每一個濃度平行測試三次，乳酸濃度與傳感器響應mV值關系如圖3所示，可見，乳酸濃度與傳感器響應mV值之間呈良好的線性關系，因此只需測出傳感器響應mV值即可方便快速的測出乳酸的含量。這種電極膜在4°C下干燥密封保存6個月酶的活性仍可達初始的95%，用其制備的乳酸傳感器的線性范圍為(Γ25 mM，使用壽命長達 15d。
[0027]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出:對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種基于乳酸氧化酶電極膜的制備方法，其特征在于，包括以下步驟Γ3或者步驟Γ4: 1)將醋酸纖維素溶解于環(huán)己酮中，得到1%?5%的無色醋酸纖維素成膜液，并將得到的成膜液均勻平鋪在玻璃平板表面，待在空氣中晾干即得一層醋酸纖維素薄膜； 2)將乳酸氧化酶溶解在含有0.4ml 1mM PBS,0.4ml 2.5%戊二醛和1.6ml 150mM草酸鈉的混合溶液中，攪拌均勻后再加入0.1ml 0.5mM甘氨酸得到混合物，將混合物超濾至0.4ml，最后加入0.4ml含穩(wěn)定劑的1mM咪唑緩沖液混勻得到乳酸氧化酶終濃度為20?50mg/ml的酶液； 3)將步驟2)配制的酶液滴加到步驟I)制得的醋酸纖維素薄膜表面，并將第一層聚碳酸酯膜貼合其上，將多余溶液擠出，晾干后即得雙層乳酸氧化酶電極膜； 4)將含50?120mg/ml牛血清白蛋白和0.2?0.5%戊二醛的混合物滴加至步驟3)制得的雙層乳酸氧化酶膜的第一層聚碳酸酯膜上得到帶有混合物的雙層乳酸氧化酶膜，再用第二層聚碳酸酯膜貼合在帶有混合物的雙層乳酸氧化酶膜上，并將多余溶液擠出，晾干后即得三層乳酸氧化酶電極膜。
2.根據(jù)權利要求1所述的基于乳酸氧化酶電極膜的制備方法，其特征在于，所述步驟O中的醋酸纖維素薄膜厚度為2?10mm。
3.根據(jù)權利要求1所述的基于乳酸氧化酶電極膜的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中的穩(wěn)定劑為海藻糖、鹿糖、甲殼素中的一種，其含量為10%?50%。
4.根據(jù)權利要求1所述的基于乳酸氧化酶電極膜的制備方法，其特征在于，所述步驟3)中第一層聚碳酸酯膜的孔徑為10?30nm、厚度為5?15mm。
5.根據(jù)權利要求1所述的基于乳酸氧化酶電極膜的制備方法，其特征在于，所述步驟4)中第二層聚碳酸酯膜的孔徑為15?50nm、厚度為4?20mm。
6.由權利要求Γ5任一項所述的制備方法得到的乳酸氧化酶電極膜，其特征在于，所述乳酸氧化酶電極膜為雙層乳酸氧化酶電極膜或者三層乳酸氧化酶電極膜。
7.根據(jù)權利要求6所述的乳酸氧化酶電極膜，其特征在于，所述雙層乳酸氧化酶電極膜包括醋酸纖維素薄膜和第一層聚碳酸酯膜，其中，醋酸纖維素薄膜和第一層聚碳酸酯膜中間夾附乳酸氧化酶層。
8.根據(jù)權利要求6所述的乳酸氧化酶電極膜，其特征在于，所述三層乳酸氧化酶電極膜包括醋酸纖維素薄膜、第一層聚碳酸酯膜和第二層聚碳酸酯膜，其中，醋酸纖維素薄膜和第一層聚碳酸酯膜中間夾附乳酸氧化酶層，第一層聚碳酸酯膜和第二層聚碳酸酯膜中間夾附牛血清白蛋白/戊二醛層。
【文檔編號】G01N27/327GK104198556SQ201410393649
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月11日 優(yōu)先權日:2014年8月11日
【發(fā)明者】吳曉靜, 韓東成, 劉凱, 楊益明, 淳林 申請人:南京普朗醫(yī)療設備有限公司