脂肪酸脫氫酶AhFAD2-1B基因的啟動(dòng)子及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種花生A12脂肪酸脫氫酶 也?/說^-7感因啟動(dòng)子，同時(shí)還涉及也?/說^-7感因啟動(dòng)子的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 花生是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在世界食用油消費(fèi)及消遣食品中占有舉足 輕重的地位。籽仁含油量一般為46%_57%，其中油酸、亞油酸是最重要的組份，二者含量之 和一般占80%以上，兩者均為不飽和脂肪酸，分別含有1個(gè)和2個(gè)不飽和鍵。油酸含量或油 酸/亞油酸比值（0 /L)是衡量花生耐貯藏性及品質(zhì)的一個(gè)重要生化指標(biāo)，該值愈大，花生 耐貯藏性愈好，其品質(zhì)愈高。從對(duì)人體健康方面考慮，亞油酸的氧化產(chǎn)物具有導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣 化的潛在危險(xiǎn)，同時(shí)還產(chǎn)生難聞的氣味和腐敗惡臭的不適口感，油酸在降低收縮壓、保護(hù)低 密度脂蛋白、降低有害膽固醇、維持有益膽固醇(高密度脂蛋白）和減緩動(dòng)脈粥樣硬化等方 面發(fā)揮重要作用。而我國(guó)花生品種的油酸/亞油酸的比值普遍偏低，大果品種一般在1. 3 左右，小果品種一般在1. 0左右。
[0003]A12脂肪酸脫氫酶（delta12-fattyaciddesaturase,FAD2)是負(fù)責(zé)向油酸中 引入第二個(gè)雙鍵生成亞油酸的關(guān)鍵酶，決定了油籽中油酸和亞油酸的比例?；ㄉ写嬖? 個(gè)同源非等位基因（如和如你)，這2個(gè)基因在編碼區(qū)的DNA序列高度 同源（99%)，分別來源于花生區(qū)組A基因組和B基因組。另外，在花生基因組中還存在一些 柯似的假基因。柯似基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平的變化是導(dǎo)致花生高油酸性狀產(chǎn)生的原因。高 油酸天然突變體F435的也?堪因起始密碼子后第442位核苷酸有一個(gè)堿基A插入，導(dǎo) 致移碼突變，使翻譯提前終止。高油酸突變體M2-225和C458分別是在也?尸也以堪因起始 密碼子后997bp和665bp處存在MITE插入，導(dǎo)致基因功能喪失。也?/^/松4基因在448個(gè)堿 基出現(xiàn)G-A突變，導(dǎo)致高油酸性狀產(chǎn)生。Jung等研究證實(shí)，控制高油酸性狀的oil位點(diǎn) 和〇12位點(diǎn)分別編碼也?和也?因，花生高油酸性狀的產(chǎn)生是由于也?和 也?基因同時(shí)突變，導(dǎo)致其編碼的酶蛋白活性降低或功能喪失所致。目前對(duì)/基因 的研究主要集中在基因編碼區(qū)的功能研究上，對(duì)該基因啟動(dòng)子的研究鮮有報(bào)道。闡明該基 因及其假基因啟動(dòng)子的功能，對(duì)于研究柯似的功能、進(jìn)化模式及改良花生脂肪酸的組份及 品質(zhì)具有重要意義。
[0004]啟動(dòng)子包含多種重要順式作用元件參與基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)控下游基因的表達(dá)， 使得植物能夠適應(yīng)外界環(huán)境的變化及自身生長(zhǎng)發(fā)育的需要。因此對(duì)植物啟動(dòng)子的研究有助 于了解基因表達(dá)模式及其調(diào)控機(jī)理。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和基因工程研究的需要，人們 分離了大量的啟動(dòng)子，并對(duì)它們進(jìn)行了鑒定，獲得了一大批有應(yīng)用前景的啟動(dòng)子，按照啟動(dòng) 子的表達(dá)模式可分為三類：第一類是組成型啟動(dòng)子，這類啟動(dòng)子在各個(gè)器官、組織、不同的 發(fā)育階段和各種環(huán)境下都有轉(zhuǎn)錄活性；第二類是組織特異性啟動(dòng)子，這類啟動(dòng)子僅在特定 的細(xì)胞、組織和發(fā)育階段具有轉(zhuǎn)錄活性；第三類是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，這類啟動(dòng)子在特定的生物 或非生物信號(hào)誘導(dǎo)下具有轉(zhuǎn)錄活性。目前植物基因工程中廣泛應(yīng)用的是組成型啟動(dòng)子，它 們驅(qū)動(dòng)目的基因在植物各個(gè)組織和整個(gè)發(fā)育階段都表達(dá)，這造成了物質(zhì)和能量的浪費(fèi)，增 加了植物的代謝負(fù)擔(dān)，有時(shí)候影響植物的發(fā)育，甚至引起植物形態(tài)的改變。因此采用特異性 啟動(dòng)子取代組成型啟動(dòng)子，使外源基因能夠特異性的表達(dá)，是植物基因工程的重要內(nèi)容。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于：提供一種花生A12脂肪酸脫氫酶基因也^也^-7雄]啟動(dòng)子。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的：提供一種操作簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定可靠的花生A12脂肪酸脫氫 酶基因也?/說^-7萬啟動(dòng)子的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的再一個(gè)目的：提供一種含有植物高效表達(dá)啟動(dòng)子的重組載體，其含有所 述的啟動(dòng)子核苷酸序列。該載體大小適合，在植物中易與轉(zhuǎn)化，所帶有的標(biāo)記基因6K5表達(dá) 強(qiáng)度高，容易檢測(cè)。
[0008] 本發(fā)明還有一個(gè)目的：提供一種花生A12脂肪酸脫氫酶基因如柯似-7萬啟動(dòng)子在 種子、葉片、花萼和角果皮中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案： 一種分離的412脂肪酸脫氫酶也?/說^-7^因啟動(dòng)子/^_ ?#其序列是下列核苷酸序 列之一： (a) 序列表中SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列； (b) 在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與（a)的DNA序列雜交并且具有相同功能的核苷酸序列； (c) 與（a)或（b)的DNA序列具有90%以上的同源性，并且具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序 列。
[0010] -種花生u啟動(dòng)子的制備方法，包括以下步驟： (1) 利用SDS裂解法提取基因組DNA，所用引物為： PAhFAD2: 5 '-CGGGGTACCATGTTTCATAGAATTTAAGCTCAGACACG-3'PAhFAD2 ^： 5 '-GACATCTAGATGTTGTGTTGTTAAAGCTCCTGTTACCAATG-3'； (2) 以基因組DNA為模板，以 PAhFAD2 1備、PAhFAD2#為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25yL，包括：1XPCRbuffer、MgCl2 1.5mmol/L、dNTP0?2mmol/L、PfuTaq酶1.5 單位、模 板30~100ng，體系中每種引物濃度為0.5mol/L; 擴(kuò)增過程為：95°C預(yù)變性1min;94°C變性10s，55°C退火30s，72°C延伸2min，35 個(gè)循環(huán)；72 °C延伸10min; (3) PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量體積比為1. 0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，用凝膠回收試劑盒回收目的片 段；按回收片段、PMD18-T載體3:1的摩爾比混合，加入5個(gè)單位的T4DNA連接酶，10X反 應(yīng)緩沖液2. 5yL，用無菌水補(bǔ)充體積至25yL，16°C連接過夜，獲得連接液； (4) 用凍融法轉(zhuǎn)化DH5a菌株的感受態(tài)細(xì)胞，將連接液涂布于含有氨芐青霉素50mg/ L的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 °C培養(yǎng)過夜，挑選白斑，進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，將陽性重組子接種 于含氨芐青霉素50yg/mL的LB液體培養(yǎng)基，37°C200r/min振蕩培養(yǎng)過夜，小量堿法提 取質(zhì)粒，用I/XAaI雙酶切約1yg質(zhì)粒，0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；檢測(cè)將目的 片段正確連接到PMD18-T載體中的陽性重組克隆，獲得載體pMD18-尸^f即得到所述的 P/ihF/W2m啟動(dòng)子。
[0011] 所述的花生M啟動(dòng)子的制備方法，其中LB固體培養(yǎng)基的制備方法如下：分 別稱取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化鈉和8g瓊脂依次溶解于蒸餾水中，定容 于1000mL;然后分裝于500mL三角瓶中，121°C、6. 859X104Pa下高壓消毒15分鐘，4°C 冷減備用； LB液體培養(yǎng)基的制備方法如下：分別稱取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化 鈉溶解于蒸餾水中，定容于1000mL，然后分裝于500mL三角瓶中，121°C、6.859X104Pa下 高壓消毒15分鐘，4°C冷藏備用。
[0012] 含有權(quán)利要求1所述的花生A12脂肪酸脫氫酶如/-7^因啟動(dòng)子尸勺 重組載體。
[0013] 所述的花生A12脂肪酸脫氫酶如/因啟動(dòng)子的重組載體的構(gòu)建 方法，包括以下步驟： 首先用/辦al雙酶切克隆載體pMDlS-/^^^，同時(shí)用免乃/辦al雙酶切PBI-Z^^-GUS質(zhì)粒；酶切反應(yīng)在37°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行，反應(yīng)4~6小時(shí)后用質(zhì)量體積比為1% 的瓊脂糖膠電泳檢測(cè)； 將克隆載體pMD18-/V^ 75酶切下的3Kb的小片段和pBI- /^w-GUS酶切下的10Kb的大片段用DNA凝膠回收試劑盒回收；按3Kb的小片段、10Kb的大片段的摩爾濃度3:1的 比例混合，加入T4DNA連接酶5個(gè)單位、10X反應(yīng)緩沖液2yL，用無菌水補(bǔ)充體積至20 yL，16°C過夜； 用凍融法轉(zhuǎn)化DH5a菌株的感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上篩選， 16小時(shí)后挑取正常生長(zhǎng)的菌斑進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，挑取陽性菌落提質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗(yàn)證正確 的重組質(zhì)粒，命名為
[0014] 所述的花生A12脂肪酸脫氫酶^-7感因啟動(dòng)子尸7在種子中的應(yīng)用。
[0015] 所述的花生A12脂肪酸脫氫酶^-7感因啟動(dòng)子尸在葉片中的應(yīng)用。
[0016] 所述的花生A12脂肪酸脫氫酶^-7感因啟動(dòng)子尸在花萼中的應(yīng)用。
[0017] 所述的花生A12脂肪酸脫氫酶如/-7感因啟動(dòng)子尸^ 7在角果皮中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)： 1、本發(fā)明的啟動(dòng)子的時(shí)空表達(dá)模式可用于研究基因的表達(dá)形式，優(yōu)點(diǎn)在于，來源于植 物內(nèi)源的組織特異性啟動(dòng)子能夠精確定位所調(diào)控的基因，驅(qū)動(dòng)目的基因在轉(zhuǎn)基因植物的特 定組織或時(shí)期表達(dá)，避免造成植物自身能源和物質(zhì)的浪費(fèi)，提高外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中 的表達(dá)效率，限制其表達(dá)部位，可應(yīng)用于植物基因工程研究和花生的轉(zhuǎn)基因研究中。
[0019] 2、本發(fā)明的啟動(dòng)子能夠調(diào)控下游6K5基因表達(dá)，并通過組織化學(xué)分析，獲得具有 種子、葉片、花萼和角果皮中表達(dá)功能的花生啟動(dòng)子。
[0020] 3、本發(fā)明克隆到花生來源的從改善種子的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、抗病和轉(zhuǎn)基因安全 性防控等方面來考慮，這種啟動(dòng)子具有應(yīng)用潛力。用u替換pBI-Z^^-GUS質(zhì)粒上的 啟動(dòng)子序列，構(gòu)建PBI- 重組植物表達(dá)載體，其中的似堪因受的調(diào)控。 通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證明，該啟動(dòng)子在種子、葉片、花萼和角果皮中高強(qiáng)度驅(qū)動(dòng)6K5基因的表達(dá) 以及在其它組織中完全不驅(qū)動(dòng)6K5基因表達(dá)，因此可以用此啟動(dòng)子代替CaMV35S強(qiáng)啟動(dòng)子 來驅(qū)動(dòng)和種子發(fā)育、改善種子品質(zhì)相關(guān)的基因，使得該基因在種子中過量表達(dá)，創(chuàng)制營(yíng)養(yǎng)更 加豐富、含油量更高、品質(zhì)更高的種子；構(gòu)建含有該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的某些抗病、抗逆基因轉(zhuǎn)化 受體植株，提高作物的抗病抗逆能力；構(gòu)建含有該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的致死基因的載體，轉(zhuǎn)化受體 植株，人工創(chuàng)制種子致死轉(zhuǎn)基因植株，防控外源基因擴(kuò)散，可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植株的安全防控 領(lǐng)域。
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