一種肌苷酸脫氫酶基因缺陷型的節(jié)桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種肌苷酸脫氫酶基因缺陷型的 節(jié)桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物育種是以提高微生物菌株生產(chǎn)性能為目標(biāo)，人為改造微生物菌株的遺傳性 能的過程。主要是通過阻斷代謝支路或者增強(qiáng)目標(biāo)基因的表達(dá)來實現(xiàn)，對于代謝途徑的阻 斷，傳統(tǒng)的方法是通過誘變，篩選缺陷型突變株，該方法工作量大、篩選過程繁瑣，并且存在 回復(fù)突變率高、菌株發(fā)酵性能不穩(wěn)定的缺點。隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，通過分子生物學(xué)的手 段從基因組上進(jìn)行定點敲除成為了最佳選擇。基因敲除又分為多種方法，其中以同源重組 法最為成熟。在
[0003] 生物細(xì)胞中，DNA或RNA分子間或分子內(nèi)的同源序列能在自然條件下以一定的頻 率發(fā)生重新組合，這個過程稱為同源重組（HomologousRecombination)。同源重組的頻率 與DNA或RNA序列的同源程度（即序列的相似程度）、同源區(qū)域大小以及生物個體的遺傳特 性密切相關(guān)，一般而言，同源程度越高、同源區(qū)域越大，重組的頻率就越高。為了快速、高效 的篩選到目的基因敲除的重組子，需要盡可能延長敲除質(zhì)粒的同源臂。然而常規(guī)的構(gòu)建方 法是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來獲得同源臂，受到DNA聚合酶保真度和測序長度的限制，無法 獲得太長的同源臂，目前普遍應(yīng)用的同源臂的長度約為50~5000bp。但是由于微生物基因 比較復(fù)雜，即使同源臂的長度為2000~5000,發(fā)生重組的概率仍然很低。因此需要尋找一 種獲得較長同源臂的方法，提高同源重組的效率。
[0004]cAMP作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，其生物合成受到嚴(yán)格的代謝調(diào)控。為使其過量積累， 只有運用代謝工程的手段，去除代謝通路中不必要的分支途徑，促使碳流流向目的產(chǎn)物積 累的方向；或者切除產(chǎn)物的分解途徑，避免發(fā)酵過程中產(chǎn)物的降解。IMP是嘌呤類核苷酸合 成途徑中的代謝節(jié)點，起到重要的流量分配作用。選育肌苷酸脫氫酶（EC1. 1. 1. 205,簡稱 MPDH)缺失的突變株，可以阻斷MP到XMP的支路代謝，避免進(jìn)入GMP循環(huán)造成的代謝流 浪費，保證代謝流向AMP循環(huán)的方向進(jìn)行。而且從代謝途徑上分析，頂PDH缺失還能夠解除 GMP、XMP對PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的反饋抑制，進(jìn)一步加強(qiáng)嘌呤核苷從頭合成途徑的通量。作為節(jié) 桿菌生長代謝的重要基因，利用普通的同源重組的方法很難將肌苷酸脫氫酶基因敲除，因 此，需要尋找一種能夠高效敲除該基因的方法，同時，不引入抗性基因、能穩(wěn)定遺傳的肌苷 酸脫氫酶缺陷型菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種遺傳穩(wěn)定肌苷酸脫氫酶基因缺陷型的節(jié)桿 菌。
[0006]本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是，提供一種利用大片段同源重組質(zhì)粒敲除節(jié)桿菌肌 苷酸脫氫酶基因的方法。
[0007] 本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是，提供上述肌苷酸脫氫酶基因缺陷型節(jié)桿菌在發(fā) 酵產(chǎn)cAMP中的應(yīng)用。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] 一種肌苷酸脫氫酶基因缺陷型的節(jié)桿菌的構(gòu)建方法，該方法包括如下步驟：
[0010] (1)大片段獲取：提取節(jié)桿菌基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶Hindlll酶切該基因組 DNA，回收酶切得到的DNA片段；
[0011] ⑵同源線性化載體擴(kuò)增：以PARK質(zhì)粒為模板，SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示 的序列為引物，擴(kuò)增得到線性化載體；
[0012] (3)利用Rec-ET系統(tǒng)連接線性化載體與大片段：制備大腸桿菌Gbdir感受態(tài)，將 步驟（1)得到的DNA片段和步驟（2)得到的線性化載體同時轉(zhuǎn)化大腸桿菌Gbdir感受態(tài)細(xì) 胞，涂布卡那霉素抗性平板，得到的陽性克隆中含有pUK-gMP重組質(zhì)粒；
[0013] (4)PCR-targeting替換目的基因：將pUK-gMP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BW25113/ PIJ790感受態(tài)細(xì)胞，再將含有pUK-gMP重組質(zhì)粒的大腸桿菌BW25113/pIJ790進(jìn)一步制備 成感受態(tài)；
[0014] 以口11773質(zhì)粒為模板，5￡〇10勵.3和5￡〇10勵.4所示的序列為引物，擴(kuò)增 安普霉素抗性基因，并回收PCR得到的片段，將該安普抗性基因片段電轉(zhuǎn)化含有pUK-gMP 重組質(zhì)粒的大腸桿菌BW25113/pIJ790感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有卡那霉素和安普霉素雙重 抗性的平板，得到的陽性克隆中含有impdh基因部分被安普抗性霉素抗性基因替換的 pUK-gMP-AP質(zhì)粒；
[0015] (5)刪除插入片段：用Spel酶切pUK-gMP-AP質(zhì)粒，去除安普抗性基因，回收大片 段后，自連環(huán)化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，得到的陽性克隆中含有pUK-dMP質(zhì)粒；
[0016](6)雙交換重組子篩選：將pUK-dMP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化節(jié)桿菌，涂布含有卡那霉素抗性 的平板，對得到的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行松弛實驗，直到篩選得到發(fā)生雙交換的重組子，該發(fā)生雙 交換的重組子即肌苷酸脫氫酶基因缺陷型節(jié)桿菌。
[0017] 步驟（6)中，所述的節(jié)桿菌的保藏號為CGMCC NO. 3584。
[0018] 步驟（6)中，所述的松弛實驗按照如下方法進(jìn)行：
[0019] 將步驟（6)所述的陽性轉(zhuǎn)化子，挑至不含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌 液渾濁，劃線至不含卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基，分出單菌落，雙挑至含有卡那霉素抗性平 板和不含卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基，觀察轉(zhuǎn)化子生長情況；
[0020] 若抗性平板上生長的菌體，應(yīng)當(dāng)是發(fā)生單交換的轉(zhuǎn)化子，保留了載體上的卡那抗 性基因，若發(fā)生雙交換，則載體上的卡那抗性基因會丟失，因此只能在無抗性平板上生長；
[0021] 如沒有符合要求的轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)，則重新將不含卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn) 化子，挑至不含抗性的LB液體培養(yǎng)基，進(jìn)行第二輪松弛，直至篩選到在卡那霉素抗性平板 上不長，在無抗性平板上生長的節(jié)桿菌轉(zhuǎn)化子。
[0022] 上述肌苷酸脫氫酶基因缺陷型的節(jié)桿菌的構(gòu)建方法得到的肌苷酸脫氫酶基因缺 陷型節(jié)桿菌在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0023] 上述肌苷酸脫氫酶基因缺陷型節(jié)桿菌在制備cAMP中的應(yīng)用，包括如下步驟：
[0024] (la)將肌苷酸脫氫酶基因缺陷型節(jié)桿菌先在節(jié)桿菌培養(yǎng)基上劃線活化，再挑單菌 落于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)19~24h;
[0025] (2a)將液體培養(yǎng)基中的肌苷酸脫氫酶基因缺陷型節(jié)桿菌轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在 發(fā)酵罐中，發(fā)酵產(chǎn)cAMP。
[0026] 其中，步驟（la)所述的節(jié)桿菌培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖1~15g/L，蛋白胨1~ 20g/L，酵母膏5~20g/L，牛肉膏10g/L，pH7. 2,溶劑為水；
[0027] 其中，步驟（2a)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖30~60g/L，K2HP04 15~ 25g/L，KH2P04 1 ~10g/L，MgS04 ? 7H20 0? 1 ~0? 5g/L，尿素 10 ~15g/L，CoCl2 0? 01 ~ 0? 02g/L，NaFO. 1 ~lg/L，生物素 0? 01 ~0? 05g/L，次黃嘌呤 5 ~10g/L，黃嘌呤 0? 1 ~0? 2g/ L，pH7.0,溶劑為水。
[0028] 步驟（2a)中，發(fā)酵過程中，發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速250~400rpm，優(yōu)選350rpm。
[0029] 步驟（2a)中，發(fā)酵過程中，發(fā)酵罐的通氣量為5~15L/min，優(yōu)選8L/min。
[0030] 制備大腸桿菌Gbdir感受態(tài)：37°C平板活化；挑單菌落至5mLLB培養(yǎng)基，37°C過 夜（〇D6QQ約為3-4);轉(zhuǎn)接40yL至1. 4mLLB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)2h左右，至OD6QQ約為0?4 ; 加入阿拉伯糖至終濃度為2. 5mg/mL，37°C誘導(dǎo)45min;4°C，9500Xg離心30s，收集菌體；棄 上清，加入lmL冰冷的無菌水，洗絳菌體；重復(fù)一次；用30yL冰冷的無菌水重懸菌體，作為 電轉(zhuǎn)感受態(tài)。
[0031] 向Gbdir電轉(zhuǎn)感受態(tài)中加入0. 5yg線性化載體和約5yg基因組酶切回收片段， 1350V(lmm)，電擊；立即加入lmLLB，37°C復(fù)蘇70min;離心，涂50yg/mL卡那平板；菌落 PCR，檢驗是否含有目的基因，陽性克隆命名為pUK-gMP。
[0032] 大腸桿菌Gbdir在阿拉伯糖的誘導(dǎo)下，能夠表達(dá)來自Rac菌體的RecE、RecT重 組酶和來自A噬菌體的Red丫重組酶，可以使兩個具有50bp同源臂的線性化片段發(fā)生同 源重組，稱為LLHR(Linear_LinearHomologousRecombination)。將基因組DNA酶切回收 片段與線性化載體混合，電轉(zhuǎn)Gbdir感受態(tài)，根據(jù)線性化載體上的卡那霉素抗性基因篩選 發(fā)生重組的轉(zhuǎn)化子。
[0033] 含有pUK-gMP重組質(zhì)粒的大腸桿菌BW25113/pIJ790感受態(tài)制備：30°C平板活化； 挑單菌落至5mLLB培養(yǎng)基（含氯霉素25yg/mL、卡那霉素50yg/mL)，30°C過夜（0D_約為 3-4);轉(zhuǎn)接100yL至10mLLB培養(yǎng)基（含1