專利名稱：一種基于磁性碳納米管的葡萄糖酶電極及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于磁性碳納米管的葡萄糖酶電極及其 制備方法。
技術(shù)背景自從1991年日本Iijima[l]首次報(bào)道碳納米管以來，該材料以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、優(yōu)異的 導(dǎo)電性、較髙的機(jī)械強(qiáng)度、化學(xué)穩(wěn)定性和催化活性等受到國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，在 電源、電磁屏蔽、納米電子器件、超強(qiáng)復(fù)合材料、儲(chǔ)氫材料、催化劑載體等諸多領(lǐng)域獲得 了初步應(yīng)用，引起了國(guó)際上物理、化學(xué)及材料等研究領(lǐng)域的極大興趣。近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì) 碳納米管的研究與開發(fā)異?；钴S，從材料制備、結(jié)構(gòu)表征到物理化學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用的探索不 斷取得重大突破。碳納米管以其獨(dú)特的性質(zhì)在電化學(xué)和生物傳感器方面有良好的應(yīng)用前景，最近研究表 明碳納米管對(duì)一些重要的生物活性物質(zhì)有較強(qiáng)的電化學(xué)催化活性，可顯著提高檢測(cè)靈敏度 并降低檢測(cè)過程中電極表面的污染。將碳納米管固定在電極表面制備葡萄糖酶電極的已有 報(bào)道，現(xiàn)有的碳納米管酶電極的制作方法主要有溶液表面修飾法[2]、石蠟油混合填充法 [3]和電化學(xué)聚合表面修飾法[4]等，溶液表面修飾法是將碳納米管分散在含酶的聚合物溶 液中，滴涂在電極表面，晾干即可；石蠟油混合填充法是將碳納米管、酶和石蠟油混合填 充在電極管中；電化學(xué)聚合表面修飾法是將碳納米管分散在含酶的聚合物的單體溶液中， 經(jīng)電化學(xué)聚合將碳納米管和酶固定在電極表面的聚合物中。由于固定化酶材料為電極本體 或者永久性固定在電極表面，當(dāng)酶失活后，整個(gè)電極就報(bào)廢了，為一次性葡萄糖酶電極。 我們?cè)O(shè)想將磁性顆粒負(fù)載在碳納米管表面，再固定葡萄糖氧化酶，通過磁力將材料通過磁 力附著在電極表面，就可制作可更新的基于碳納米管的葡萄糖酶電極。本發(fā)明采用化學(xué)共沉淀法在碳納米管表面修飾四氧化三鐵和殼聚糖，通過戊二醛固定 葡萄糖氧化酶，制得的固定有葡萄糖氧化酶的碳納米管/四氧化三鐵/殼聚糖納米磁性復(fù)合 材料和制備的新型葡萄糖酶電極均未見文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明提出的葡萄糖傳感器制備工藝簡(jiǎn) 便，材料成本低廉，原料利用率高，在臨床診斷、食品分析、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生命科學(xué)研究等 領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。 參考文獻(xiàn)[1]飯島S.,自然，簡(jiǎn)，第354巻，第56-58頁(Iijima S., Wflh^e 1991， 35《56-58.)。 [2]蔡育晨，李詩詞，陳杰明，朗格繆爾，2005,第21巻，第S.C., Chen J.M., et al, La"gmwir 2005,21， 3653-3658.)。[3〗基于碳納米管修飾電極的微生物傳感器，電化學(xué)通訊，2007，第9巻，第1810-1815 頁(Timur S.， Anik U., Odaci D.， et al.,五/ec rac/ie附.Co/m w".， 2007, 9, 1810—1815.)。[4]基于導(dǎo)電高分子一聚吡咯的電化學(xué)傳感器，電化會(huì)志，2006,第51巻，第6025^6037 頁(Ramanavicius A， Ramanaviciene A, et al.， ￡7e"rac/ >w.勿a, 2006, 5厶6025~6037.)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提出一種用于葡萄糖測(cè)定的可更新式葡萄糖酶電極及其制備方法。 本發(fā)明提出的可更新式葡萄糖酶電極，是一種固定有葡萄糖氧化酶的碳納米管/四氧 化三鐵/殼聚糖納米磁性復(fù)合材料的葡萄糖酶電極。其結(jié)構(gòu)如圖l所示。它由金屬導(dǎo)線l、 電極管2、磁鐵3、基體電極4和固定有葡萄糖氧化酶的納米磁性復(fù)合材料修飾層5構(gòu)成； 金屬導(dǎo)線1在導(dǎo)電管2內(nèi)，并與基體電極4連通，磁鐵3置于電極管2中，磁性碳納米管 復(fù)合材料層5由碳納米管、四氧化三鐵和殼聚糖組成，通過磁鐵3產(chǎn)生的磁力附著在基體 電極4表面。本發(fā)明中，金屬導(dǎo)線l一般采用銅線，電極管2—般采用玻璃管，基體電極4一般采 用導(dǎo)電體，通常可用石墨、環(huán)氧樹脂的復(fù)合材料。本發(fā)明中，磁鐵3可以由若千等直徑的圓柱形顆粒上下排列組成，每個(gè)顆粒的直徑為 1. 5-2. 5咖,略小于電極管2的內(nèi)徑,長(zhǎng)度為2-5mm，如果，材料性能容許長(zhǎng)度可以更大,直至 與電極管2的長(zhǎng)度一致。本發(fā)明還提出了基于磁性碳納米管的可更新式葡萄糖酶電極的制作方法，具體步驟如下將殼聚糖溶解在5-20mg/mL的醋酸溶液中，殼聚糖的濃度為0. 5-2 mg/mL;在此溶液 中加入三價(jià)鐵離子和二價(jià)鐵離子的鹽(如硫酸鐵(ni)銨和硫酸亞鐵(ii)銨)，其中三價(jià) 鐵離子和二價(jià)鐵離子的摩爾比為2:1，三價(jià)鐵離子和二價(jià)鐵離子的總濃度控制在20-100 mmol/L，然后將碳納米管置于該溶液中，超聲分散，得黑色混懸溶液；在該溶液中滴加氨 水，邊加邊機(jī)械攪拌，使最終的pH值為1卜12，然后在40-60 'C水浴中隔水加熱20-40 分鐘，將磁鐵放置在盛有混合溶液的容器底部使碳納米管/四氧化三鐵/殼聚糖納米磁性復(fù) 合材料與水相分離，傾去上清液，用去離子水清洗三次，具體方法為將材料充分混懸在去 離子水中，每次均采用上述磁性分離技術(shù)將復(fù)合材料與水相分離；將所得固體材料，分散 在3-10 mg/mL葡萄糖氧化酶水溶液中10-30分鐘，借助磁鐵移去葡萄糖氧化酶水溶液， 然后將吸附酶的納米磁性復(fù)合材料分散在3-10 mg/mL戊二醛水溶液中，通過戊二醛與葡 萄糖氧化酶和殼聚糖中的伯氨基反應(yīng)將葡萄糖氧化酶固定在碳納米管/四氧化三鐵/殼聚糖 納米磁性復(fù)合材料的表面，所得固定化酶材料經(jīng)磁性分離和水洗后，凍千稱重，使用前分 散在50mM磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4)中于4 'C冰箱中保存?zhèn)?，濃度?0-30 mg/mL。將環(huán)氧樹脂與固化劑按說明書比例(如質(zhì)量比2: l)混合均勻，與石墨粉按質(zhì)量比l: 1混合均勻，填充于內(nèi)徑為1.5-3.0毫米的電極管2中，使填充的石墨與環(huán)氧樹脂混合物 的高度為2-4毫米，通過導(dǎo)管內(nèi)部在混合物中包埋直徑為25-100微米的金屬導(dǎo)線1，金 屬導(dǎo)線1另一端于管外；石墨與環(huán)氧樹脂混合物在24-28"固化10-15小時(shí)以上，表面用金 相砂紙拋光得基體電極4;在電極管內(nèi)放置15-20個(gè)NdFeB圓柱形磁鐵3，即構(gòu)成石墨與 環(huán)氧樹脂磁性基體電極，見圖l。將上述分散有固定有葡萄糖氧化酶的碳納米管/四氧化三鐵/殼聚糖納米磁性復(fù)合材 料的溶液，用移液器取5-20微升該混懸溶液于有機(jī)玻璃板表面，基體電極4頭朝下接觸 含納米磁性復(fù)合材料的液滴5， 30-90秒后，在磁力作用下，液滴中的磁性材料被固定在 電極表面，即得到基于磁性碳納米管的可更新式葡萄糖酶電極成品。碳納米管起到導(dǎo)電和催化劑的作用，同時(shí)提高材料的分散性和比表面積；四氧化三鐵 顆粒使材料具有磁性；殼聚糖提供伯胺基，用于固定葡萄糖氧化酶；葡萄糖氧化酶可以選 擇性的與葡萄糖作用。由于磁性材料通過磁力附著在電極表面，當(dāng)移去電極內(nèi)的磁鐵，電 極表面的磁性固定化酶材料即脫落，為更新新鮮的磁性材料提供便利。本發(fā)明提出的基于 磁性碳納米管的葡萄糖酶電極響應(yīng)速度快，檢測(cè)濃度范圍寬，電極加工簡(jiǎn)便，電極表面的 固定化酶材料制備簡(jiǎn)便，可通過磁力固定在電極表面，當(dāng)酶失活后，可通過更新電極表面 的磁性酶材料使電極再生，大幅降低了電極材料的消耗，節(jié)約了資源，降低了葡萄糖酶電 極法測(cè)定的成本。本發(fā)明制作的基于磁性碳納米管的葡萄糖酶電極在臨床診斷、食品分析、 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生命科學(xué)研究等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。


圖1為基于磁性碳納米管的可更新式葡萄糖酶電極結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為固定有葡萄糖氧化酶的碳納米管/四氧化三鐵/殼聚糖納米磁性復(fù)合材料在磁性 電極表面的固定過程。圖3為本發(fā)明中固定有葡萄糖氧化酶的碳納米管/四氧化三鐵/殼聚糖納米磁性復(fù)合材 料的掃描電子顯微鏡照片(放大20000倍)。圖4為本發(fā)明中固定有葡萄糖氧化酶的碳納米管/四氧化三鐵/殼聚糖納米磁性復(fù)合材 料的透射電子顯微鏡照片。圖5為(a)石墨/環(huán)氧樹脂基體電極和(b)基于磁性碳納米管的可更新式葡萄糖酶 電極在50 mM磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)對(duì)葡萄糖的電流-時(shí)間響應(yīng)曲線。每次加入葡萄 糖的量l mM，檢測(cè)電位-O. 1 V (相對(duì)于飽和甘汞電極)，溶液攪拌速度300 rpm。圖中標(biāo)號(hào)l為金屬導(dǎo)線，2為電極管，3為小磁鐵，4為基體電極，5為納米磁性復(fù)合材料修飾層，6為分散有修飾層材料的磷酸鹽緩沖溶液液滴，7為有機(jī)玻璃板，8為磷酸鹽緩沖溶液液滴。
具體實(shí)施方式
下面通過實(shí)施例和附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明1、基于磁性碳納米管的可更新式葡萄糖酶電極及其制作將0.2克殼聚糖用2克冰醋酸溶解，定容到200毫升，其中殼聚糖濃度為l mg/mL， 醋酸的濃度為1 mg/mL。在此溶液中加入1.7克(4.33 mmol)硫酸亞鐵(II)銨 ((NH4)2Fe(S04).6H20) 和2.51克(8.66 mmol)硫酸鐵(III)銨(NH4Fe(S04)2.12H20)， 于50 'C加熱溶解，然后加入1克多壁碳納米管(深圳納米港有限公司提供)，超聲分散 15分鐘，邊攪拌邊滴加10M氨水10毫升，使溶液最終pH值為11-12，然后該混合溶液 在50 'C水浴中隔水加熱30分鐘，將磁鐵放置在盛有混合溶液容器的底部使碳納米管/四 氧化三鐵/殼聚糖納米磁性復(fù)合材料與水相分離，傾去上清液，用100毫升去離子水清洗 三次。干燥后得碳納米管/四氧化三鐵/殼聚糖納米磁性復(fù)合材料約2.2克。取20毫克該 材料分散在2毫升5 mg/mL葡萄糖氧化酶水溶液，于4 'C冰箱中2小時(shí)后，將材料通過磁 鐵沉積在容器底部，移去葡萄糖氧化酶水溶液，然后將吸附有酶的磁性復(fù)合材料分散在2 毫升5mg/mL戊二醛水溶液中，于4 'C冰箱中反應(yīng)15分鐘，借助戊二醛與葡萄糖氧化酶 和殼聚糖中的伯氨基反應(yīng)將葡萄糖氧化酶通過共價(jià)鍵固定在碳納米管/四氧化三鐵/殼聚糖 三元復(fù)合材料的表面，所得固定化酶材料經(jīng)磁性分離和三次水洗后，干燥稱重，使用前分 散在10毫升50 mM磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)中于4 'C冰箱中保存?zhèn)洌瑵舛葹?0 mg/mL。 圖2為本發(fā)明中固定有葡萄糖氧化酶的碳納米管/四氧化三鐵/殼聚糖納米磁性復(fù)合材料的 掃描電子顯微鏡照片，顯然材料中碳納米管的輪廓依然存在，但表面有粗糙的顆粒物質(zhì)， 為附著在其表面的磁性四氧化三鐵納米顆粒。材料中碳納米管相互交錯(cuò)連接，構(gòu)成具有較 高比表面積的固定有葡萄糖氧化酶的導(dǎo)電體系。圖4為本發(fā)明中固定有葡萄糖氧化酶的碳 納米管/四氧化三鐵/殼聚糖納米磁性復(fù)合材料的透射電子顯微鏡照片，圖中碳納米管表面 有明顯的膜狀物，為固定有葡萄糖氧化酶的殼聚糖修飾層。環(huán)氧樹脂與固化劑按說明書比例(質(zhì)量比2: 1)混合均勻，將石墨粉按質(zhì)量比1: 1 混合均勻，填充于內(nèi)徑為2.2毫米的6厘米長(zhǎng)玻璃管2中，使填充的石墨與環(huán)氧樹脂混合 物的高度為3毫米，通過導(dǎo)管內(nèi)部在混合物中包埋直徑為50微米的15厘米長(zhǎng)銅導(dǎo)線l， 另一端于管外，石墨與環(huán)氧樹脂混合物在25 'C左右固化12小時(shí)，電極表面用金相砂紙拋 光得基體電極5，在電極管內(nèi)放置15個(gè)NdFeB圓柱形小磁鐵3(直徑1.5毫米，長(zhǎng)4毫米)， 即構(gòu)成石墨與環(huán)氧樹脂磁性基體電極，見圖l。萄糖氧化酶的碳納米管/四氧化三鐵/殼聚糖納米磁性復(fù)合材 料的溶液搖勻，用移液器取10微升該混旋溶液于有機(jī)玻璃板表面，石墨與環(huán)氧樹脂磁性 基體電極于水中超聲清洗后，頭朝下接觸含磁性材料5的液滴6， 60秒后，在磁力作用下， 液滴中的磁性材料被固定在電極表面得基于磁性碳納米管的可更新式葡萄糖酶電極成品。圖5為(a)石墨/環(huán)氧樹脂基體電極和(b)基于磁性碳納米管的可更新式葡萄糖酶 電極在50 mM磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)對(duì)葡萄糖的電流-時(shí)間響應(yīng)曲線?？梢娛?環(huán)氧 樹脂基體電極對(duì)葡萄糖沒有電流響應(yīng)，而基于磁性碳納米管的可更新式葡萄糖酶電極對(duì)葡 萄糖有良好的響應(yīng)，響應(yīng)時(shí)間小于3秒，在1-10 mM濃度范圍內(nèi)響應(yīng)電流隨葡萄糖濃度上 升而上升。2、殼聚糖包裹碳納米管/四氧化三鐵復(fù)合材料的制備及其在葡萄糖酶電極制備中的應(yīng)用本發(fā)明中固定有葡萄糖氧化酶的磁性碳納米管復(fù)合材料還可按以下方法制備在200 毫升水溶液中加入1.7克(4.33mmo1)硫酸亞鐵(II)銨((NH4)2Fe(S04).6H20)和2.51克 (8.66 mmol)硫酸鐵(III)銨(NH4Fe(S04)2'12H20)，于50 。C加熱溶解，然后加入1克多 壁碳納米管，超聲分散15分鐘，邊攪拌邊滴加10 M氨水10毫升，使溶液最終pH值為 11-12,然后該混合溶液在50 'C水浴中隔水加熱30分鐘，將磁鐵放置在盛有混合溶液容 器的底部使碳納米管/四氧化三鐵納米磁性復(fù)合材料與水相分離，傾去上清液，用100毫 升去離子水清洗三次，然后樣品分散在200毫升含0. 2克殼聚糖和2克冰醋酸的水溶液中， 邊攪拌邊滴加10M氨水10毫升，使溶液最終pH值為11-12，靜置15分鐘，經(jīng)磁性分離 和水洗后，干燥得殼聚糖包裹碳納米管/四氧化三鐵復(fù)合材料，材料進(jìn)一步固定化葡萄糖 氧化酶和在電極表面的磁性固定均同實(shí)施例1。所得基于磁性碳納米管的新型葡萄糖酶電 極對(duì)葡萄糖的電流響應(yīng)性能與實(shí)施例1相當(dāng)。實(shí)施例1中殼聚糖與四氧化三鐵的生成是在 氨水的作用下一步生成的，步驟簡(jiǎn)單。而在實(shí)施例2中殼聚糖需單獨(dú)沉積，制備工藝上多 了一步。
權(quán)利要求
1、一種基于磁性碳納米管的葡萄糖酶電極，其特征在于由金屬導(dǎo)線(1)、電極管(2)、磁鐵(3)、基體電極(4)和固定有葡萄糖氧化酶的納米磁性復(fù)合材料修飾層(5)構(gòu)成；金屬導(dǎo)線(1)在導(dǎo)電管(2)內(nèi)，并與基體電極(4)連通，磁鐵(3)置于電極管(2)中，磁性碳納米管復(fù)合材料層(5)由碳納米管、四氧化三鐵和殼聚糖組成，通過磁鐵(3)產(chǎn)生的磁力附著在基體電極(4)表面。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于磁性碳納米管的葡萄糖酶電極，其特征在于所述的基 體電極(4)為石墨和環(huán)氧樹脂的復(fù)合材料。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于磁性碳納米管的葡萄糖酶電極，其特征在于所述的磁 鐵(3)由若干等直徑的圓柱形顆粒上下排列組成，每個(gè)顆粒的直徑為1.5-2. 5mm，略小于 電極管(2)的內(nèi)徑，長(zhǎng)度為2-5mm。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于碳納米管的葡萄糖酶電極的制備方法，其特征在于具 體步驟如下將殼聚糖溶解在5-20mg/mL的醋酸溶液中，殼聚糖的濃度為0. 5-2 mg/mL;在此溶液 中加入三價(jià)鐵離子和二價(jià)鐵離子的鹽，其中三價(jià)鐵離子和二價(jià)鐵離子的摩爾比為2:1，三 價(jià)鐵離子和二價(jià)鐵離子的總濃度控制在20-100 mmol/L;然后將碳納米管置于該溶液中， 超聲分散，得黑色混懸溶液；在該溶液中滴加氨水，邊加邊機(jī)械攪拌，使最終的pH值為 11-12;然后在40-60 'C水浴中隔水加熱20-40分鐘，將磁鐵放置在盛有混合溶液的容器 底部使碳納米管/四氧化三鐵/殼聚糖納米磁性復(fù)合材料與水相分離，將所得固體材料分散 在3-10 mg/mL葡萄糖氧化酶水溶液中10-30分鐘，借助磁鐵移去葡萄糖氧化酶水溶液， 然后將吸附酶的納米磁性復(fù)合材料分散在3-10 mg/mL戊二醛水溶液中，通過戊二酲與葡 萄糖氧化酶和殼聚糖中的伯氨基反應(yīng)將葡萄糖氧化酶固定在碳納米管/四氧化三鐵/殼聚糖 納米磁性復(fù)合材料的表面，所得固定化酶材料經(jīng)磁性分離和水洗后，凍干稱重，使用前分 散在50mM磷酸鹽緩沖溶液中于4 'C冰箱中保存?zhèn)?，濃度?0-30 mg/mL;將環(huán)氧樹脂與固化劑按質(zhì)量比2: l混合均勻，與石墨粉按質(zhì)量比l: l混合均勻，填 充于內(nèi)徑為1.5-3.0毫米的電極管(2)中，使填充的石墨與環(huán)氧樹脂混合物的高度為2-4 毫米，通過導(dǎo)管內(nèi)部在混合物中包埋直徑為25-100微米的金屬導(dǎo)線(1)，金屬導(dǎo)線(1) 另一端于管外；石墨與環(huán)氧樹脂混合物在24-28'C固化10-15小時(shí)以上，表面用金相砂紙拋 光得基體電極(4);在電極管內(nèi)放置15-20個(gè)NdFeB圓柱形磁鐵3，即構(gòu)成石墨與環(huán)氧樹 脂磁性基體電極；將上述分散有固定有葡萄糖氧化酶的碳納米管/四氧化三鐵/殼聚糖納米磁性復(fù)合材 料的溶液，用移液器取5-20微升該混懸溶液于有機(jī)玻璃板表面，基體電極(4)頭朝下接 觸含納米磁性復(fù)合材料的液滴(5)， 30-90秒后，在磁力作用下，液滴中的磁性材料被固 定在電極表面，即得到基于磁性碳納米管的可更新式葡萄糖酶電極成品。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于磁性碳納米管的葡萄糖酶電極及其制備方法。本發(fā)明將碳納米管超聲分散在含三價(jià)鐵離子和二價(jià)鐵離子的殼聚糖酸水溶液中，制得由碳納米管、四氧化三鐵和殼聚糖組成的三組分納米磁性復(fù)合材料；將其分散在葡萄糖氧化酶水溶液中，吸附葡萄糖酶，再分散在戊二醛水溶液中，通過伯氨基反應(yīng)交聯(lián)，將葡萄糖氧化酶固定在磁性復(fù)合材料的表面，即得基于磁性碳納米管的可更新式葡萄糖酶電極，本發(fā)明提出的葡萄糖酶電極響應(yīng)速度快，檢測(cè)濃度范圍寬，電極加工簡(jiǎn)便，固定化酶磁性材料制備簡(jiǎn)便，當(dāng)酶失活后，可通過更新電極表面的基于磁性碳納米管的酶材料使電極再生，大幅降低了電極材料的消耗，節(jié)約了資源，降低了酶法測(cè)定的成本。
文檔編號(hào)G01N27/327GK101329296SQ200710172609
公開日2008年12月24日 申請(qǐng)日期2007年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者張魯雁, 剛 陳, 摯 陳 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)