一種液相色譜-酶電極聯(lián)用裝置及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種液相色譜-酶電極聯(lián)用裝置，該裝置包括色譜分離單元、檢測器、有機(jī)溶劑去除單元、活性評價單元和計(jì)算機(jī)，色譜分離單元包括依次通過管路相互連接的流動相儲罐、色譜泵、進(jìn)樣閥和液相色譜柱，液相色譜柱通過管路連接所述的檢測器；有機(jī)溶劑去除單元用于去除樣品中的有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑去除單元的前端連接檢測器；活性評價單元包括混合器、緩沖液儲罐和酶電極，混合器與有機(jī)溶劑去除單元的后端相連接，緩沖液儲罐連接至混合器，混合器連接至酶電極；計(jì)算機(jī)分別電連接所述的檢測器與酶電極。本發(fā)明能夠在線、實(shí)時提供分析樣品中各成分的生物活性，實(shí)現(xiàn)分析待測樣品中的成分組成并在線評價各組分對應(yīng)的生物活性。
【專利說明】—種液相色譜-酶電極聯(lián)用裝置及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種屬于藥物領(lǐng)域，尤其涉及一種液相色譜-酶電極聯(lián)用裝置及中藥成分-活性在線分析應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著中藥產(chǎn)業(yè)規(guī)模的擴(kuò)大及中藥研究成果的發(fā)展，中藥分析技術(shù)取得了極大進(jìn)展，中藥分析的對象更集中于針對中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究中的關(guān)鍵科學(xué)問題；同時中藥分析需要將各種新方法、新技術(shù)整合使之成為解決關(guān)鍵科學(xué)問題的新體系，而不再局限于分析中藥的物質(zhì)組成，更注重解決的是物質(zhì)的組成及其功能的相關(guān)性。整體系統(tǒng)生物學(xué)(GlobalSystems Biology)的發(fā)展,系統(tǒng)揭示化學(xué)物質(zhì)組的變化與生物系統(tǒng)應(yīng)答的時空響應(yīng)的相關(guān)性；以及基于代謝組學(xué)的方藥指紋-藥代標(biāo)示物-藥效靶標(biāo)三維模式的中藥復(fù)方代謝的研究設(shè)想，均體現(xiàn)了改進(jìn)現(xiàn)有中藥分析新技術(shù)，整合分析方法應(yīng)用的發(fā)展趨勢。
[0003]中藥成分分析技術(shù)在以往的液相色譜、氣相色譜、薄層色譜的基礎(chǔ)上，發(fā)展了氣相-質(zhì)譜聯(lián)用、液相-質(zhì)譜聯(lián)用乃至色譜-核磁聯(lián)用等技術(shù)，在對中藥復(fù)雜成分進(jìn)行分離分析的同時提供了豐富的結(jié)構(gòu)信息，實(shí)現(xiàn)了中藥中已知或未知成分的定性定量分析，極大地推進(jìn)了中藥成分化學(xué)研究，但是現(xiàn)有的分析技術(shù)均以化學(xué)成分研究為目的，無法在線反應(yīng)或評價成分的生物活性。因此，選擇與中藥功效相關(guān)的酶蛋白分子，通過物理化學(xué)交聯(lián)作用固定化做成固定化酶膜，然后與電化學(xué)傳感器結(jié)合構(gòu)成酶電極(enzyme electrode),利用酶反應(yīng)的專一性、穩(wěn)定性以及電化學(xué)分析的快速、靈敏，在線、實(shí)時提供分析樣品中各成分的生物活性。酶電極聯(lián)合液相分析，能夠突破現(xiàn)有分析技術(shù)中成分活性信息的缺失，為建立新的中藥質(zhì)量評價模式提供思路和技術(shù)方案。
[0004]電極分析法(包括酶電極)作為一種電化學(xué)檢測手段，已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)與離子色譜的在線聯(lián)用。但由于液相色譜流動相中有機(jī)溶劑的存在，限制了酶電極與液相色譜的聯(lián)用。若將有機(jī)溶劑去除裝置連接于液相色譜和酶電極之間，將流動相中有機(jī)溶劑去除，則可實(shí)現(xiàn)液相色譜與酶電極的聯(lián)用。
[0005]在色譜分析中，濃縮富集是樣品的常規(guī)前處理手段，即在樣品進(jìn)色譜柱分離之前進(jìn)行濃縮富集。也有柱后濃縮富集的，比如液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)及液相色譜-蒸發(fā)光散射法(LC-ELSD)，但它們都是質(zhì)量型檢測器而非濃度型檢測器。若在常規(guī)濃度型檢測器之后連接一個溶劑去除裝置，采用具有多孔性和疏水性的多孔聚四氟乙烯膜及中空纖維膜作為滲透膜，允許有機(jī)溶劑滲透，能夠?qū)崿F(xiàn)溶劑去除，并達(dá)到樣品組分的濃縮目的，為進(jìn)一步的活性評價提供基礎(chǔ)。有機(jī)溶劑去除裝置設(shè)計(jì):流動相通過多孔滲透膜管時，在管壁外圍流過已加熱的干燥氣體(比如空氣或氮?dú)?，有機(jī)溶劑受熱揮發(fā)為氣態(tài)，透過滲透膜去除。
[0006]中藥成分組成復(fù)雜，常規(guī)的分析技術(shù)在中藥的定性、定量分析中發(fā)揮了中藥作用，但目前尚未見能夠同時提供中藥成分組成與組分一一對應(yīng)的活性信息的分析方法。本發(fā)明專利以小型化固定化酶電極為活性評價靶標(biāo)，通過色譜分離-檢測器-在線溶劑去除-酶電極檢測各部件的整合，形成中藥在線成分-活性評價實(shí)驗(yàn)裝置，并利用該裝置，開展白術(shù)的中藥成分-活性在線評價應(yīng)用。分析結(jié)果將同時提供中藥成分組成信息以及與酶電極作用的活性信息，該在線分析結(jié)果，結(jié)合化學(xué)成分鑒定結(jié)果，將全面提供白術(shù)成分-活性信息，能夠?yàn)殛U述白術(shù)藥效作用機(jī)制提供新的技術(shù)方法。同時該技術(shù)能夠推廣應(yīng)用至其他中藥，能夠進(jìn)一步加強(qiáng)與中醫(yī)理論相結(jié)合的有效成分研究，最終建立一種新的以成分、活性為綜合指標(biāo)的中藥質(zhì)量評價體系，通過加強(qiáng)質(zhì)控，提高中藥材質(zhì)量，促進(jìn)中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的一個目的是提供一種液相色譜-酶電極聯(lián)用裝置，通過該裝置可以得到待測樣品中的成分組成信息，并進(jìn)一步明確各組分對應(yīng)的酶結(jié)合活性，得到成分-活性在線評價結(jié)果。本發(fā)明的另外一個目的是提供采用上述的裝置進(jìn)行中藥成分-活性在線分析的方法。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
一種液相色譜-酶電極聯(lián)用裝置，該裝置包括色譜分離單元、檢測器、有機(jī)溶劑去除單元、活性評價單元和計(jì)算機(jī)，所述的色譜分離單元包括依次通過管路相互連接的流動相儲罐、色譜泵、進(jìn)樣閥和液相色譜柱，液相色譜柱通過管路連接所述的檢測器；所述的有機(jī)溶劑去除單元用于去除樣品中的有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑去除單元的前端連接檢測器；所述的活性評價單元包括混合器、緩沖液儲罐和酶電極，混合器與有機(jī)溶劑去除單元的后端相連接，緩沖液儲罐連接至混合器，混合器連接至酶電極；所述的計(jì)算機(jī)分別電連接所述的檢測器與酶電極。
[0009]作為優(yōu)選，所述的色譜分離單元采用高效液相色譜分離系統(tǒng)或超高壓液相色譜分尚系統(tǒng)。
[0010]作為優(yōu)選，所述的檢測器選用單波長紫外檢測器、二極管整列檢測器或熒光檢測器。
[0011]作為優(yōu)選，所述的有機(jī)溶劑去除單元包括氮?dú)怃撈?、氮?dú)獗谩⒓訜峁芎驼舭l(fā)管，氮?dú)怃撈客ㄟ^氮?dú)獗眠B接加熱管，所述的蒸發(fā)管包括上隔層和下隔層，下隔層為流動相管路，流動相管路的前端與檢測器相連接，上層為加熱氮?dú)夤苈?，加熱氮?dú)夤苈放c加熱管相連接，上隔層和下隔層之間為微孔滲透膜，流動相管路后端與混合器相連接。
[0012]作為再優(yōu)選，所述的微孔滲透膜由多孔聚四氟乙烯膜及中空纖維膜構(gòu)成。
[0013]作為再優(yōu)選，所述的氮?dú)怃撈坎捎贸Ｒ?guī)的氮?dú)怃撈?，氮?dú)獗昧髁靠刂品秶?0.1-2L/h，壓力:5-50 PSI，加熱管溫度控制范圍:50-100 °C。
[0014]為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
一種液相色譜-酶電極聯(lián)用中藥成分活性在線分析方法，該方法采用上述的液相色譜-酶電極聯(lián)用裝置進(jìn)行包括以下步驟的操作:
1)流動相的配制
采用有機(jī)溶劑為有機(jī)相，以水或緩沖溶液為水相，經(jīng)微孔濾膜濾過后，備用；
2)待測樣品的預(yù)處理
取待測樣品，經(jīng)提取、溶劑萃取、濃縮、定容、微孔濾膜濾過等操作過程，制備成供試品溶液，備用；
3)活性評價單元緩沖液的配制 根據(jù)需要，選擇適宜的緩沖液體系，配制緩沖溶液，備用；
4)色譜分離條件設(shè)置
在已連接完整的液相色譜-酶電極聯(lián)用裝置上，開啟計(jì)算機(jī)，設(shè)置流動相流速，選擇梯度洗脫需要設(shè)置梯度洗脫程序；取步驟I)的流動相，開啟色譜泵驅(qū)動流動相，進(jìn)入分離程序；
5)進(jìn)樣
取步驟2)的供試品溶液，經(jīng)進(jìn)樣閥注入色譜分離系統(tǒng)；在步驟4)的分離條件進(jìn)行成分分離；同時開啟檢測器電源，設(shè)置檢測器檢測參數(shù)；供試品溶液通過色譜分離柱，復(fù)雜成分實(shí)現(xiàn)柱分離；分離后的成分由檢測得到色譜信號，并流出檢測器成為分離成分溶液；
6)有機(jī)溶劑去除
色譜分離單元開啟的同時開啟有機(jī)溶劑去除單元，將步驟5)的純化成分溶液中的有機(jī)溶劑去除，純化成分保留在水相中成為純化成分水溶液；
7)酶電極安裝
購買市售小型酶電極，或選擇適宜的酶，自行制備固定化酶電極，安裝于活性評價單元，備用；
8)活性評價
步驟6)的純化水溶液流入混合器，同時取步驟2)的緩沖液，注入混合器中混合，混合流經(jīng)步驟7)的酶電極，成分與酶結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生電流或電位等信號改變，計(jì)算機(jī)檢測信號得到電化學(xué)信號；
9)數(shù)據(jù)分析
根據(jù)步驟5)得到的色譜信號，以及步驟8)得到的電化學(xué)信號，通過數(shù)據(jù)分析，得到待測樣品中的成分組成信息，并進(jìn)一步明確各組分對應(yīng)的酶結(jié)合活性，得到成分-活性在線評價結(jié)果。
[0015]作為優(yōu)選，所述的步驟I)有機(jī)溶劑選用甲醇或乙腈。
[0016]本發(fā)明由于采用了上述的實(shí)驗(yàn)裝置及應(yīng)用步驟，具有以下的特點(diǎn):
1、設(shè)計(jì)創(chuàng)新性
現(xiàn)有的分析技術(shù)均以化學(xué)成分研究為目的，無法提供即時的生物活性信息。本發(fā)明專利選擇與中藥功效相關(guān)的酶蛋白分子，制備酶電極，作為活性評價的靶標(biāo)，能夠在線、實(shí)時提供分析樣品中各成分的生物活性，實(shí)現(xiàn)分析待測樣品中的成分組成并在線評價各組分對應(yīng)的生物活性。酶電極聯(lián)合液相分析，能夠突破現(xiàn)有分析技術(shù)中成分活性信息的缺失，為建立新的中藥質(zhì)量評價模式提供思路和技術(shù)方案。
[0017]2、應(yīng)用前景及作用良好
該技術(shù)能夠推廣應(yīng)用至其他中藥，能夠進(jìn)一步加強(qiáng)與中醫(yī)理論相結(jié)合的有效成分研究，最終建立一種新的以成分、活性為綜合指標(biāo)的中藥質(zhì)量評價體系，通過加強(qiáng)質(zhì)控，提高中藥材質(zhì)量，促進(jìn)中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1本發(fā)明的裝置示意圖。
[0019]圖2成分-活性在線評價模式示意圖。[0020]圖3白術(shù)醇提物HPLC圖。
[0021]圖4白術(shù)成分酶電極檢測信號圖，a, b, C，d依次為白術(shù)內(nèi)酯I1、111、I和蒼術(shù)酮。
【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施例1
如圖1所示的一種液相色譜-酶電極聯(lián)用裝置，該裝置包括色譜分離單元、檢測器、有機(jī)溶劑去除單元、活性評價單元和計(jì)算機(jī)12，色譜分離單元采用高效液相色譜分離系統(tǒng)或超高壓液相色譜分離系統(tǒng)，檢測器選用單波長紫外檢測器、二極管整列檢測器或熒光檢測器。所述的色譜分離單元包括依次通過管路相互連接的流動相儲罐1、色譜泵2、進(jìn)樣閥3和液相色譜柱4，液相色譜柱4通過管路連接所述的檢測器5。所述的有機(jī)溶劑去除單元包括氮?dú)怃撈俊⒌獨(dú)獗?、加熱管8和蒸發(fā)管6，氮?dú)怃撈坎捎贸Ｒ?guī)的氮?dú)怃撈?，氮?dú)獗?流量控制范圍:0.1-2 L/h，壓力:5-50 PSI，加熱管8溫度控制范圍:50-100 °C。氮?dú)怃撈客ㄟ^氮?dú)獗?連接加熱管8，所述的蒸發(fā)管6包括上隔層和下隔層，下隔層為流動相管路，流動相管路的前端與檢測器5相連接，上層為加熱氮?dú)夤苈?，加熱氮?dú)夤苈放c加熱管8相連接，上隔層和下隔層之間為微孔滲透膜，微孔滲透膜由多孔聚四氟乙烯膜及中空纖維膜構(gòu)成。所述的活性評價單元包括混合器9、緩沖液儲罐10和酶電極11，混合器9連接流動相管路的后端相連接，緩沖液儲罐10連接至混合器9，混合器9連接至酶電極11 ;所述的計(jì)算機(jī)12分別電連接所述的檢測器5與酶電極11。
[0023]實(shí)施例2
一種液相色譜-酶電極聯(lián)用中藥成分活性在線分析方法，該方法采用實(shí)施例1的液相色譜-酶電極聯(lián)用裝置進(jìn)行包括以下步驟的操作:
I)流動相的配制
以水為水相，甲醇為有機(jī)相。取去離子純水和色譜甲醇，分別過0.45μ孔徑的微孔濾膜，濾液分別置于水相及有機(jī)相溶劑瓶中，備用。
[0024]2)待測樣品的預(yù)處理
取干燥白術(shù)藥材，粉碎，稱取0.6 g，置于25 mL容量瓶中，加20 mL甲醇，超聲提取20min，取出，放至室溫，加色譜甲醇至刻度，搖勻，提取液經(jīng)0.22 μ微孔濾膜濾過，續(xù)濾液置于進(jìn)樣瓶中，制備成供試品溶液，備用。
[0025]3)活性評價單元緩沖液的配制
選擇PH與人工腸液接近的緩沖液，稱取磷酸二氫鉀6.8 g，置于1000 mL容量瓶中，力口水500 mL使溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至6.8，加水至刻度，搖勻，即得緩沖液，備用。
[0026]4)色譜分離條件設(shè)置
液相色譜系統(tǒng)選用LC-20A-VP液相色譜儀(日本島津)，CAPCELL PAK C18分析色譜柱(250 mmX4.6 mm,5 μ m)，連接實(shí)驗(yàn)裝置各部件；開啟計(jì)算機(jī)電源，設(shè)置流動相流速為1.0mL/min，梯度洗脫程序見表；取步驟I)的流動相，將色譜泵水相及有機(jī)相泵頭置于各自的溶劑瓶中，開啟色譜泵電源，以梯度洗脫程序起始比例驅(qū)動流動相，系統(tǒng)平衡20 min后運(yùn)行梯度洗脫程序。
[0027]梯度洗脫程序
【權(quán)利要求】
1.一種液相色譜-酶電極聯(lián)用裝置，該裝置包括色譜分離單元、檢測器、有機(jī)溶劑去除單元、活性評價單元和計(jì)算機(jī)(12)，其特征在于:色譜分離單元包括依次通過管路相互連接的流動相儲罐(I)、色譜泵(2)、進(jìn)樣閥(3)和液相色譜柱(4)，液相色譜柱(4)通過管路連接所述的檢測器(5);所述的有機(jī)溶劑去除單元用于去除樣品中的有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑去除單元的前端連接檢測器(5);所述的活性評價單元包括混合器(9)、緩沖液儲罐(10)和酶電極(11)，混合器(9)連接與有機(jī)溶劑去除單元的后端相連接，緩沖液儲罐(10)連接至混合器(9)，混合器(9)連接至酶電極(11);所述的計(jì)算機(jī)(12)分別電連接所述的檢測器(5)與酶電極(11)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液相色譜-酶電極聯(lián)用裝置，其特征在于:所述的色譜分離單元采用高效液相色譜分離系統(tǒng)或超高壓液相色譜分離系統(tǒng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液相色譜-酶電極聯(lián)用裝置，其特征在于:檢測器(5)選用單波長紫外檢測器(5 )、二極管整列檢測器(5 )或熒光檢測器(5 )。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種液相色譜-酶電極聯(lián)用裝置，其特征在于:所述的有機(jī)溶劑去除單元包括氮?dú)怃撈?、氮?dú)獗?7)、加熱管(8)和蒸發(fā)管(6)，氮?dú)怃撈客ㄟ^氮?dú)獗眠B接加熱管(8)，所述的蒸發(fā)管(6)包括上隔層和下隔層，下隔層為流動相管路，流動相管路的前端與檢測器(5)相連接，上層為加熱氮?dú)夤苈?，加熱氮?dú)夤苈放c加熱管(8)相連接，上隔層和下隔層之間為微孔滲透膜，流動相管路后端與混合器(9)相連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種液相色譜-酶電極聯(lián)用裝置，其特征在于:微孔滲透膜由多孔聚四氟乙烯膜及中空纖維膜構(gòu)成。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種液相色譜-酶電極聯(lián)用裝置，其特征在于:氮?dú)怃撈坎捎贸Ｒ?guī)的氮?dú)怃撈?，氮?dú)獗昧髁靠刂品秶?0.l_2L/h，壓力:5-50PSI，加熱管(8)溫度控制范圍:50-100°Co
7.一種液相色譜-酶電極聯(lián)用中藥成分活性在線分析方法，其特征在于:該方法采用權(quán)利要求廣6任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的液相色譜-酶電極聯(lián)用裝置進(jìn)行包括以下步驟的操作: 1)流動相的配制 采用有機(jī)溶劑為有機(jī)相，以水或緩沖溶液為水相，經(jīng)微孔濾膜濾過后，備用； 2)待測樣品的預(yù)處理 取待測樣品，經(jīng)提取、溶劑萃取、濃縮、定容、微孔濾膜濾過等操作過程，制備成供試品溶液，備用； 3)活性評價單元緩沖液的配制 根據(jù)需要，選擇適宜的緩沖液體系，配制緩沖溶液，備用； 4)色譜分離條件設(shè)置 在已連接完整的液相色譜-酶電極聯(lián)用裝置上，開啟計(jì)算機(jī)，設(shè)置流動相流速，選擇梯度洗脫需要設(shè)置梯度洗脫程序；取步驟I)的流動相，開啟色譜泵驅(qū)動流動相，進(jìn)入分離程序； 5)進(jìn)樣 取步驟2)的供試品溶液，經(jīng)進(jìn)樣閥注入色譜分離系統(tǒng)；在步驟4)的分離條件進(jìn)行成分分離；同時開啟檢測器(5)電源，設(shè)置檢測器(5)檢測參數(shù)；供試品溶液通過色譜分離柱，復(fù)雜成分實(shí)現(xiàn)柱分離；分離后的成分由檢測得到色譜信號，并流出檢測器(5)成為分離成分溶液； 6)有機(jī)溶劑去除 色譜分離單元開啟的同時開啟有機(jī)溶劑去除單元，將步驟5)的純化成分溶液中的有機(jī)溶劑去除，純化成分保留在水相中成為純化成分水溶液； 7)酶電極(11)安裝 購買市售小型酶電極(11)，或選擇適宜的酶，自行制備固定化酶電極(11)，安裝于活性評價單元，備用； 8)活性評價 步驟6)的純化水溶液流入混合器(9)，同時取步驟2)的緩沖液，注入混合器(9)中混合，混合流經(jīng)步驟7)的酶電極(11 )，成分與酶結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生電流或電位等信號改變，計(jì)算機(jī)檢測信號得到電化學(xué)信號； 9)數(shù)據(jù)分析 根據(jù)步驟5)得到的色譜信號，以及步驟8)得到的電化學(xué)信號，通過數(shù)據(jù)分析，得到待測樣品中的成分組成信息，并進(jìn)一步明確各組分對應(yīng)的酶結(jié)合活性，得到成分-活性在線評價結(jié)果。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種液相色譜-酶電極聯(lián)用中藥成分活性在線分析方法，其特征在于:步驟I)有機(jī)溶劑選用甲醇或乙腈。
【文檔編號】G01N30/88GK104007219SQ201410248217
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】壽旦, 王娜妮, 張揚(yáng), 董宇 申請人:浙江省中醫(yī)藥研究院