檢測對苯二酚和鄰苯二酚的共固定酶電極制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測對苯二酚和鄰苯二酚的共固定酶電極制備方法及應用，該制備方法是將酪氨酸酶和過氧化物酶固定到氧化石墨烯上得到共固定酶液，然后將共固定酶液和殼聚糖溶液依次滴涂在玻碳電極表面，得到檢測對苯二酚和鄰苯二酚的共固定酶電極，該電極成本低、操作簡便、快速、靈敏、檢測限低、選擇性好，可以用于環(huán)境中微量對苯二酚和鄰苯二酚的檢測。
【專利說明】檢測對苯二酚和鄰苯二酚的共固定酶電極制備方法及應用
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境檢測領域，具體涉及一種檢測對苯二酚和鄰苯二酚的共固定酶電極制備方法及應用。
【背景技術(shù)】
[0002]鄰苯二酌.(Catechol, CC)和對苯二酌.(Hydroquinone, HQ)作為重要的化工原料，被廣泛用于橡膠防老化劑、照相顯影劑和香料、農(nóng)藥、醫(yī)藥、染料等領域，其毒性比普通酚類污染物大，即使在極低的濃度下，HQ和CC對動物、植物和水生環(huán)境也是極其有害的。為了評價由于HQ和CC暴露而對實際人體健康造成的風險，就需要在極低的濃度水平下得到它們在環(huán)境中準確的濃度數(shù)據(jù)。因此，開發(fā)一種簡單而敏感地檢測微量HQ和CC的分析方法就具有重大的意義。
[0003]近年來，不同類型的化學分析方法被應用于HQ和CC的檢測。國內(nèi)外常采用的檢測HQ和CC的方法包括高效液相色譜法，紫外-可見分光光度法，熒光分光光度法，毛細管電泳法等。這些方法盡管準確且具有較低檢測限，但是需要昂貴且復雜的儀器，且不能實現(xiàn)在線和實時監(jiān)控。電化學傳感器因其響應速度快，易于小型化，成本低，省時，高靈敏度，優(yōu)異的選擇性以及在線實時檢測等特點而受到廣泛關(guān)注。
[0004]目前已經(jīng)有一些電化學傳感器用來檢測HQ和CC，如將羧基化的多壁碳納米管修飾到玻碳電極表面，該電極對HQ和CC的檢測限分別為ΙΟμΜ和8μΜ(李明齊，何曉英，蔡鐸昌，碳納米管修飾電極對對苯二酚和鄰苯二酚的電催化研究，分析科學學報，2006.03 (22):299-304);以谷氨酸單體為初始試劑，利用電化學聚合方法制備得到聚谷氨酸修飾電極，該電極對HQ和CC的檢測限和線性范圍分別為ImM和5-100 μ M (王春燕，由天艷，田堅，聚谷氨酸修飾電極同時檢測對苯二酚和鄰苯二酚，分析化學研究報告，2011.04(39):528-533)。這些電極均能檢測HQ和CC，然而它們的檢測限都比較高，無法對環(huán)境中微量的污染物進行靈敏性檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種檢測對苯二酚和鄰苯二酚的共固定酶電極其制備方法及應用，該電極具有成本低、操作簡便、快速、靈敏、檢測限低、選擇性好等優(yōu)點，可以用于環(huán)境中微量對苯二酚和鄰苯二酚的檢測。
[0006]檢測對苯二酚和鄰苯二酚的共固定酶電極制備方法，包括以下步驟:
[0007]步驟I，將氧化石墨烯在濃硫酸和硝酸混合液中攪拌1-2小時，再放入濃鹽酸中超聲1-2小時，過濾并用去離子水清洗，室溫干燥，得羧基化氧化石墨烯；
[0008]氧化石墨烯與混合酸液的重量體積比為5-15mg: 20_60mL，濃硫酸與硝酸體積比為2:1-4:1 ；
[0009]
【權(quán)利要求】
1.檢測對苯二酚和鄰苯二酚的共固定酶電極制備方法，包括以下步驟: 步驟1，將氧化石墨烯在濃硫酸和硝酸的混合酸液中攪拌1-2小時，再放入濃鹽酸中超聲1-2小時，過濾并用去離子水清洗，室溫干燥，得羧基化氧化石墨烯； 氧化石墨烯與混合酸液的重量體積比為5-15 mg:20-60 mL，濃硫酸與硝酸體積比為2:1-4:1 ； 步驟2，將步驟I所得羧基化氧化石墨烯加入氯化亞砜和N，N- 二甲基甲酰胺的混合溶液中，60-80°C水浴攪拌12-48h，過濾，用無水四氫呋喃清洗，室溫下真空干燥，得酰氯化氧化石墨烯； 羧基化氧化石墨烯與混合溶液的重量體積比為5-15 mg:50-150 mL,氯化亞砜和N, N-二甲基甲酰胺的體積比為10:1-30:1 ； 步驟3，將步驟2所得酰氯化氧化石墨烯加入乙二胺中，攪拌12-48h，過濾，室溫下真空干燥，得氨基化氧化石墨烯； 酰氯化氧化石墨烯與乙二胺的重量體積比為5-15 mg:20-60 mL ； 步驟4，將步驟3所得氨基化氧化石墨烯加入pH為6.0-7.0的緩沖溶液中，超聲分散20-40 min，得到質(zhì)量濃度為l_3mg/mL的石墨烯分散液； 步驟5，取100-300 μ L步驟 4所得石墨烯分散液與質(zhì)量分數(shù)為2%-10%的戊二醛反應，超聲20-40 min后在搖床上搖動l_3h，得到溶液體系，備用； 石墨烯分散液與戍二醒的體積比為0.5-1.5:1 ； 步驟6，在步驟5所得溶液體系中加入100-300 μ L酪氨酸酶溶液和過氧化物酶溶液的混合酶液，反應l_3h，得到共固定酶液； 混合酶液中酪氨酸酶溶液與過氧化物酶溶液的體積比為1:1-2:1，酪氨酸酶溶液與過氧化物酶溶液的濃度都是2-10mg/mL，溶劑是pH為6.0-7.0的緩沖溶液； 步驟7，移取步驟6的共固定酶液滴涂于活化處理后的玻碳電極上，滴涂量為5-20 μ L，4°C干燥，再移取質(zhì)量分數(shù)為0.2-1.0%的殼聚糖溶液滴涂于玻碳電極上；干燥后即得檢測對苯二酹和鄰苯二酹的共固定酶電極； 共固定酶液與殼聚糖溶液的體積比為1:1-3:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測對苯二酚和鄰苯二酚的共固定酶電極制備方法，其特征在于:步驟I中氧化石墨烯與混合酸液的重量體積比為10 mg:40 mL，濃硫酸與硝酸體積比為3:1，攪拌時間為1.5小時，在濃鹽酸中超聲的時間為1.5小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測對苯二酚和鄰苯二酚的共固定酶電極制備方法，其特征在于:步驟2中羧基化氧化石墨烯與混合溶液的重量體積比為10 mg: 100 mL，羧基化氧化石墨烯加入混合溶液70°C水浴攪拌24h，氯化亞砜和N，N- 二甲基甲酰胺的體積比為20:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測對苯二酚和鄰苯二酚的共固定酶電極制備方法，其特征在于:步驟3中酰氯化氧化石墨烯與乙二胺重量體積比為10 mg:40 mL，攪拌反應時間為24h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測對苯二酚和鄰苯二酚的共固定酶電極制備方法，其特征在于:步驟4中超聲分散的時間為30min,所得石墨烯分散液的濃度為2mg/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測對苯二酚和鄰苯二酚的共固定酶電極制備方法，其特征在于:步驟5中石墨烯分散液的加入量為200yL，石墨烯分散液與戊二醛體積比為1:1，戊二醛的質(zhì)量分數(shù)為5%，超聲時間為30min，反應時間為2h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測對苯二酚和鄰苯二酚的共固定酶電極制備方法，其特征在于:步驟6中酶混合液的加入量為200 μ L，反應時間為2h，混合酶液中酪氨酸酶溶液與過氧化物酶溶液的體積比為1.5:1，酪氨酸酶溶液與過氧化物酶溶液的濃度都是5mg/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測對苯二酚和鄰苯二酚的共固定酶電極制備方法，其特征在于:步驟7中共固定酶液滴涂量為10 μ L，殼聚糖溶液的質(zhì)量分數(shù)為0.5%，共固定酶液與殼聚糖溶液的體積比為2:1。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測對苯二酚和鄰苯二酚的共固定酶電極制備方法，其特征在于:步驟7所述活化處理的玻碳電極是由如下方法制得:在電化學工作站中，Ag/AgCl作參比電極，鉬電極作對電極，玻碳電極作工作電極，采用循環(huán)伏安法掃描酸溶液，循環(huán)伏安掃描酸液的電位范圍為-1.0-1.0 V，掃描速率為50-150 mV/s,掃描圈數(shù)為10-30圈；所述酸溶液為硫酸、硝酸 或鹽酸，其濃度為0.1-1 M0
【文檔編號】G01N27/327GK104007156SQ201410210210
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月16日
【發(fā)明者】華祖林, 白雪, 王超凡, 黃欣, 秦琴, 張琪, 張曉媛, 馬文強, 顧海鑫, 戴章艷 申請人:河海大學