專利名稱：一種可克隆微藻啟動子的t載體的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微藻基因工程領(lǐng)域，更具體涉及一種微藻啟動子克隆T載體的構(gòu)建方法，同時還涉及一種微藻啟動子克隆T載體的用途，可用于微藻啟動子的直接克隆并在萊茵衣藻中分析該啟動子的功能，該方法可快速克隆微藻啟動子并進行功能分析。
背景技術(shù)：
啟動子是基因調(diào)控中普遍存在的順式作用元件，是RNA聚合酶能夠識別并與之結(jié)合而起始基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，通常位于基因5'端上游。它能決定轉(zhuǎn)錄的方向和效率，以及RNA聚合酶類型，并引導(dǎo)RNA聚合酶與模板的正確結(jié)合。因此，啟動子的功能序列對于基因的表達(dá)調(diào)控機制的研究具有十分重要的意義。研究啟動子功能的手段之一就是通過基因工程手段。它是分子生物實驗的基本技術(shù)之一，即將一段需要克隆的外源DNA片段插入到載體DNA分子中形成重組DNA分子，然后將該重組載體轉(zhuǎn)運到宿主細(xì)胞中，隨著宿主細(xì)胞的繁殖載體進行復(fù)制，在這一系列過程中與載體相連的外源基因片段同時被克隆。傳統(tǒng)的克隆方法是限制性酶切目的片段后再連接到載體的相應(yīng)位點上，該方法存在效率低、 耗時長等缺點。于是研究人員又開發(fā)出了 T載體，它是一種很方便的克隆載體，因其末端帶有突出的T堿基，可直接與Taq酶擴增產(chǎn)物末端突出A堿基配對，大大提高了 PCR產(chǎn)物與載體的連接效率。它是一種方便、高效的克隆載體，進行大量的克隆工作時，現(xiàn)實、簡便的做法是使用商業(yè)化的T載體，常用的T載體包括pMD-18T、pGEM-T和pCF_T等。常見的T載體制備包括首先是通過酶切得到平末端，然后在末端連入T堿基，此方法需要消耗大量的載體和酶，成本高，耗時長。通過分子生物學(xué)操作在載體兩段引入Eamll05I等限制性內(nèi)切酶位點，通過酶切直接獲得T載體，此方法更高效、簡便。藻類是含有光合色素，營自養(yǎng)生活，沒有根莖葉分化的低等孢子植物類群，對藻類基因啟動子的研究是從1990年代初對聚球藻的研究開始的。它的研究相對高等植物落后很多，水稻、煙草和擬南芥等高等植物的啟動子已經(jīng)做了很多的研究，它們已經(jīng)建立了穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，可以購買到各種克隆載體、轉(zhuǎn)化載體、報告蛋白和抗體等，其他高等植物的啟動子也可以在擬南芥、煙草等模式生物中進行功能研究。然而，藻類基因表達(dá)調(diào)控的研究就相對較少，主要集中于藻類光合作用與固氮作用相關(guān)基因的啟動子，真核微藻主要集中在小球藻和萊茵衣藻上。微藻的調(diào)控機制與高等植物差別很大，因此研究人員無法利用煙草、擬南芥等成熟的模式生物對其啟動子功能進行研究。這大大妨礙了微藻的相關(guān)研究， 尤其是某些重要基因的調(diào)控機理研究。其他如雨生紅球藻、硅藻和擬微綠球藻等經(jīng)濟微藻由于研究歷史較短，目前還沒有成熟的載體和表達(dá)系統(tǒng)對其啟動子功能進行研究，因此，微藻啟動子功能研究存在的主要問題有以下幾方面(1)目前還沒有商業(yè)化的微藻克隆載體、表達(dá)載體或報告載體，大大阻礙了研究工作的開展；(2)許多微藻包括雨生紅球藻等還沒能建立遺傳轉(zhuǎn)化體系，不能通過基因工程手段對其功能基因進行研究，也不可能對其啟動子的調(diào)控功能進行研究；
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萊茵衣藻是目前研究最多、技術(shù)最成熟的微藻，它是單細(xì)胞、帶鞭毛的真核生物， 隸屬于綠藻門，團藻目，衣藻屬.衣藻的結(jié)構(gòu)簡單，原生質(zhì)膜緊貼著細(xì)胞壁，頂端長有兩根鞭毛，側(cè)面具有一個眼點，多數(shù)細(xì)胞還有一個或多個液泡，一個占細(xì)胞總體積近40%的大型杯狀葉綠體。衣藻因其培養(yǎng)條件簡單；生長周期短；生長迅速；光合效率高而具有“光合酵母”之稱.其生物學(xué)特性為在短時間內(nèi)獲得大量遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因后代，并進行遺傳學(xué)分析提供了便利條件。它也是少數(shù)三套基因組均能進行遺傳轉(zhuǎn)化的植物之一。長期以來，萊茵衣藻由于其自身的特點，一直被用作遺傳研究的材料。廣泛用于研究鞭毛結(jié)構(gòu)和鞭毛組裝，趨光性和生理節(jié)律，配子發(fā)生和交配和光合作用原理，葉綠體發(fā)育的分子生物學(xué)過程等，這些研究加深了我們對衣藻生理功能和遺傳學(xué)的認(rèn)識。它還有一個很大的優(yōu)勢，它作為微藻的模式生物進行了全基因組測序，這些研究和基因組數(shù)據(jù)使得衣藻的遺傳學(xué)背景很清晰。所以，萊茵衣藻非常適合作為研究微藻的模式生物，包括功基因功能的研究，還可以用于研究微藻啟動子的調(diào)控機理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種微藻啟動子的T載體的制備方法，該方法通過簡單的PCR等分子生物學(xué)操作就可構(gòu)建T載體，對操作人員要求不高，本發(fā)明詳細(xì)提供了各步操作以及引物，技術(shù)成熟可靠，操作人員遵循該法即可得到T載體。可以利用該載體快速克隆微藻啟動子，并在萊茵衣藻中進行啟動子功能的驗證，成為微藻基因工程研究人員的有利工具。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種可檢測微藻啟動子功能的T載體的應(yīng)用。 萊茵衣藻的研究方法和生化背景非常成熟，來源于其他微藻的啟動子可以轉(zhuǎn)化到萊茵衣藻中進行功能驗證，解決目前微藻啟動子功能難研究的困境，通過核酸雜交、PCR、蛋白質(zhì)雜交等常規(guī)實驗方法就可以完成，方便微藻研究人員所應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施啟動子的PCR產(chǎn)物可直接克隆進該載體并導(dǎo)入萊茵衣藻中進行功能分析。根據(jù)不同實驗?zāi)康臉?gòu)建了兩種τ克隆載體--pB-0. 45T載體和pRB-0. 45T載體，確保應(yīng)用者能將微藻啟動子導(dǎo)入萊茵衣藻中表達(dá)篩選基因，并以此作為分析其功能的依據(jù)。該發(fā)明將大大方便研究人員對微藻啟動子進行研究，在微藻基因工程領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。一種可克隆微藻啟動子的T載體的制備方法，其步驟是A、可克隆微藻啟動子的前T載體的構(gòu)建(1)以 pBlel/pBle2(pBlel :5 ‘ -GTAGATATCATGGCCAGGTG-3 ‘ , pBle2 5' -GCGGGTACCTTAATTAAGCTTC-3‘)為引物，通過PCR從質(zhì)粒pSP124(為本實驗室保存， 購自美國藻種庫)中擴增出大小為970bp的ble-3' RBCS2終止子(94°C 3min ；94°C lmin, 58°C lmin，72°C lmin，25 個循環(huán)；72°C 1 Omin)，克隆進pMD 18_T (TaKaRa 公司)載體中，獲得 Τ-ρ 124質(zhì)粒，并經(jīng)測序確認(rèn)。通過EcoR V +Kpn I雙酶切質(zhì)粒Τ-plM獲得ble_3' RBCS2 終止子，將它插入PSPlM載體的EcoR V +Kpn I位點，最后獲得pBIM載體。(2)pB載體的構(gòu)建通過Eamll05 I單酶切pBIM載體，獲得線性載體，再經(jīng) T4DNAPolymerase使載體末端平滑化，突變原有的Eaml 105 I位點。通過T4連接酶連接載體，獲得PB載體。
(3)pRB載體的構(gòu)建通過Eamll05 I單酶切pSPlM載體，獲得線性載體，再經(jīng) T4DNAPolymerase使載體末端平滑化，突變原有的Eaml 105 I位點。通過T4連接酶連接載體，獲得PRB載體。(4)間隔序列的獲得以 pB-bkt9/pB-bktlO (pB_bkt9 :5 ‘ -TTGGATCCGACTTTAC GTCCAGTTCCGTGACATTGA-3 ‘ ， pB-bktlO 5 ‘ -CAAGATATCGACGCTTCGTCTCGTCTAGCTGTGCTAT G-3')為引物，通過PCR從質(zhì)粒091127-a3(為本實驗室保存，由雨生紅球藻基因組文庫篩選得到)中擴增出大小為450bp的產(chǎn)物，獲得引入兩個Eamll05 I位點、EcoR V和BamH I 位點的啟動子，命名為5' bktl-0.45。( pB-0.45T載體的構(gòu)建通過EcoRV+BamH I雙酶切5' bktl-0. 45，將其插入 PB載體的EcoR V +BamH I位點，最后獲得ρΒ_0. 45T載體。(6) pRB-0. 45T 載體的構(gòu)建通過 EcoR V +BamH I 雙酶切 5' bktl-0. 45，將其插入pRB載體的EcoR V +BamH I位點，最后獲得pRB_0. 45T載體。B、啟動子序列的T克隆(I)T載體的制備pB-0. 45T載體和pRB-0. 45T載體經(jīng)Eamll05I雙酶切，37°C 1小時，酶切產(chǎn)物經(jīng)1 % (質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收大片段即為T載體，經(jīng)一般的商業(yè)回收試劑盒(DNA片段純化試劑盒，TaKaRa公司)純化后可直接應(yīng)用于PCR片段(bktl-0. 2啟動子) 的T克隆，。(請見圖6和圖7)(2)啟動子的PCR擴增PCR擴增后能在產(chǎn)物末端加A的PCR酶即可，常見的有Taq DNA擴增酶和長鏈DNA 擴增酶(LA-Taq)，沒有特別的要求。如采用Pfu等高保真酶擴增，則需要在PCR產(chǎn)物上通過 Taq擴增酶加A (腺嘌呤脫氧核苷酸)才能應(yīng)用該T載體。(3) PCR片段的連接、轉(zhuǎn)化連接體系如下
權(quán)利要求
1.一種可克隆微藻啟動子的前T載體的制備方法，其步驟是A、可克隆微藻啟動子的前T載體的構(gòu)建(1)以pB1e1 5 ‘ -GTAGATATCATGGCCAGGTG-3 ‘ , pB1e 2 5 ‘ -GCGGGTACCTTAATTAAGCTTC-3 ‘)為引物，通過PCR從質(zhì)粒pSP 124中擴增出大小為 970bp 的 ble-RBCS2 終止子94°C 3min ；94 °C lmin，58°C lmin，72°C lmin，25 個循環(huán)， 72°C lOmin，克隆進pMD 18-T載體中，獲得T_plM質(zhì)粒，并經(jīng)測序確認(rèn)，通過EcoR V和Kpn I限制性內(nèi)切酶雙酶切質(zhì)粒T-plM獲得ble-3' RBCS2終止子，將它插入pSPlM載體的EcoR V和Kpn I酶識別位點，獲得pBIM載體；(2)pB載體的構(gòu)建通過Eamll05I限制性內(nèi)切酶單酶切pBIM載體，獲得線性載體， 再經(jīng)T4DNA Polymerase使載體末端平滑化，突變原有的Eaml 105 I酶識別位點，通過T4連接酶連接載體，獲得PB載體；(3)pRB載體的構(gòu)建通過Eaml105 I單酶切pSPlM載體(含RBCS2啟動子_ble_RBCS2 終止子)，獲得線性載體，再經(jīng)T4DNA Polymerase使載體末端平滑化，突變原有的 Eaml 105 I酶識別位點，通過T4連接酶連接載體，獲得pRB載體；(4)間隔序列的獲得以pB-bkt9 5 ‘ -TTGGATCCGACTTTACGTCCAGTTCCGTGACATTG A-3 ‘，pB-bktlO 5 ‘ -CAAGATATCGACGCTTCGTCTCGTCTAGCTGTGCTATG-3 ‘為引物，通過 PCR從質(zhì)粒091127-a3中擴增出大小為450bp的產(chǎn)物，獲得引入兩個Eamll05 I酶識別位點、一個EcoR V和BamH I酶識別位點的啟動子，作為前T載體的間隔序列并命名為 5' bktl-0. 45 ；(5)pB-0.45T載體的構(gòu)建通過EcoR V和BamH I限制性內(nèi)切酶雙酶切 5' bktl-0. 45，將其插入pB載體的EcoR V和BamH I酶識別位點，獲得ρΒ_0· 45Τ載體；(6)pRB-0.45T載體的構(gòu)建通過EcoR V和BamH I限制性內(nèi)切酶雙酶切 5' bktl-0. 45，將其插入pRB載體的EcoR V和BamH I酶識別位點，最后獲得pRB_0. 45T 載體；B、啟動子序列的T克隆(1)T載體的制備:pB-0. 45T載體和pRB-0. 45T載體經(jīng)Eamll05I限制性內(nèi)切酶雙酶切，37°C 1小時，酶切產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量體積比瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收大片段即為T載體，經(jīng)一般的商業(yè)回收試劑盒純化后直接應(yīng)用于PCR片段的T克??；(2)啟動子的PCR擴增PCR擴增后能在產(chǎn)物末端加腺嘌呤脫氧核苷酸(A)的PCR酶，常見的有Taq DNA擴增酶和長鏈DNA擴增酶，采用Pfu高保真酶擴增，在PCR產(chǎn)物上通過Taq擴增酶加腺嘌呤脫氧核苷酸才能用T載體；(3)PCR片段的連接、轉(zhuǎn)化T載體和PCR產(chǎn)物按1 1或1 3摩爾比混勻，加入T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌XLl細(xì)胞中，經(jīng)氨芐抗生素篩選獲得克隆了啟動子PCR片段的重組子，經(jīng)T3或T7 引物測序確定插入片段的序列信息。
2.權(quán)利要求1所述的一種可克隆微藻啟動子的T載體在檢測微藻啟動子功能中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可克隆微藻啟動子的T載體的制備方法及應(yīng)用，其步驟是先通過PCR獲得間隔序列，引入限制性內(nèi)切酶識別位點；將該間隔序列連入突變了Eam1105I位點的pSP124載體，分別構(gòu)建前T載體；引入ble基因作為篩選基因；通過酶切，電泳分離，切膠回收獲得T載體，將微藻啟動子片段連入Eam1105I酶切位點；微藻啟動子連入后可得到完整的表達(dá)盒，由啟動子、表達(dá)基因和終止子所組成。一種可克隆微藻啟動子的T載體在檢測微藻啟動子功能中的應(yīng)用，該方法簡單，技術(shù)成熟可靠。利用該載體快速克隆微藻啟動子，并在萊茵衣藻中進行啟動子功能的驗證，成為微藻基因工程研究人員的有利工具。
文檔編號G01N33/53GK102399811SQ201110339260
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月1日
發(fā)明者王潮崗, 胡章立 申請人:深圳大學(xué)