本發(fā)明涉及一種抗重金屬鉻的藻株及其篩選方法。

背景技術(shù)：

微藻是一類廣泛分布于陸地、海洋當(dāng)中，能夠光合產(chǎn)能并且高度自氧的微生物。微藻與其他生物相比其種類繁多，到21世紀(jì)初已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的藻類約有三萬(wàn)余種，其中微小藻類占據(jù)70%。藻類的細(xì)胞壁及其功能團(tuán)使得藻類對(duì)重金屬吸附和富集能力較強(qiáng)，適合處理高、低濃度金屬離子的水體。隨著現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)的加劇，人類向環(huán)境排放的重金屬的量日益增多，嚴(yán)重污染了土壤和水體環(huán)境，使得人類將環(huán)境中的重金屬通過(guò)食物鏈而積累，從而對(duì)人體健康造成極大的危害。如何去除工業(yè)廢水中的重金屬是一個(gè)關(guān)系到人類健康和生態(tài)環(huán)境的重要課題，而微藻正是具備了解決這些問(wèn)題的開(kāi)發(fā)屬性。

但是由于不同藻類對(duì)生活環(huán)境要求不同，目前僅有藍(lán)藻門、綠藻門、金藻門、紅藻門這4個(gè)藻門用于人工培養(yǎng)或生產(chǎn)(張永亮,2009,鈾礦冶)。衣藻是綠藻門衣藻科真核單細(xì)胞微藻，細(xì)胞橢球形，其吸附重金屬表面比非常大。相關(guān)的研究已經(jīng)證明了衣藻在重金屬?gòu)U水中處理能夠起到非常明顯的作用，在微藻富集重金屬的研究中，衣藻因其獨(dú)特的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能特性逐漸成為研究熱點(diǎn)(caixh,1995,molecularbiologyandbiotechnology)。

而本發(fā)明中使用的萊茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)因其具有基因組簡(jiǎn)單且已被注釋，生長(zhǎng)快易培養(yǎng)，研究技術(shù)手段相對(duì)成熟等特點(diǎn)，而把其列為科學(xué)研究的模式生物之一。目前對(duì)于衣藻吸附的研究多數(shù)是構(gòu)建衣藻對(duì)重金屬的等溫吸附模型，langmuir和freundlich等溫吸附方程是描述藻類對(duì)重金屬的吸附行為的兩個(gè)著名的模型。二級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)模型也能很好地解釋萊茵衣藻對(duì)汞、鎘、鉛等金屬離子的吸附(ritchieag,1997,journalofthechemicalsociety,faradaytransactions)。此外對(duì)衣藻吸附重金屬研究較多的還有關(guān)于吸附重金屬影響因素的研究。隨著萊茵衣藻基因組學(xué)研究的進(jìn)展，轉(zhuǎn)基因突變體藻株越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。胡章立等通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)mt-like基因衣藻和其野生品系的比較分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因藻株對(duì)重金屬鎘和銅的結(jié)合能力及抗性均有大幅度提高(胡章立,2002,湖泊科學(xué))。已有研究證明，在萊茵衣藻細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)外援金屬硫蛋白顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因衣藻重金屬的結(jié)合特性(huacx,1999,internationaljournalofphytoremediationgene)。所以建立一種可以從衣藻突變體文庫(kù)中大量模式化的篩選出具有高重金屬抗性藻株的方法是迫切的，從而可以進(jìn)一步研究影響衣藻重金屬吸附的相關(guān)基因以及可進(jìn)行基因工程改良的重金屬吸附藻株的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是建立一種從衣藻突變體文庫(kù)中篩選抗重金屬鉻藻株的方法。通過(guò)利用萊茵衣藻方波電擊所構(gòu)建的突變體文庫(kù)，進(jìn)而從中篩選具有金屬鉻抗性的突變體衣藻。為下一步研究衣藻重金屬吸附的相關(guān)基因和進(jìn)行基因工程改良的重金屬吸附藻株的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種抗重金屬鉻的藻株，分類命名為，萊茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii),保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)，保藏號(hào)為cgmccno.13872；保藏日期：2017-06-07,保藏地點(diǎn)：北京市路朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。

其篩選方法為：從突變體文庫(kù)tap平板上挑取每個(gè)突變體單克隆到畫(huà)有方格的金屬鉻篩選tap平板上，該篩選平板上的方格數(shù)要保持在每板約30個(gè)左右并做好數(shù)字編號(hào)標(biāo)記，每個(gè)方格內(nèi)轉(zhuǎn)接一個(gè)突變體藻株，在23±0.5°c，8000lx光強(qiáng)下連續(xù)光照培養(yǎng)7天左右，篩選存活狀態(tài)旺盛的藻株。再次驗(yàn)證階段，在突變體文庫(kù)中找到與金屬篩選板子上存活狀態(tài)旺盛所對(duì)應(yīng)的突變體藻株，再次將該藻株和野生型21gr藻株分別挑到同一塊金屬鉻篩選平板上進(jìn)行驗(yàn)證，約7天后野生型21gr死亡而突變體藻株存活正常，則確定該藻株為抗金屬鉻突變體藻株。

所述的萊茵衣藻即實(shí)驗(yàn)藻種：21gr(cc1690)，屬于萊茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)的一個(gè)品系，可直接從衣藻實(shí)驗(yàn)室或者美國(guó)衣藻種質(zhì)資源庫(kù)獲得。

所述tap固體培養(yǎng)基為：tap鹽溶液25ml/l，磷酸鹽溶液0.375ml/l，hutner微量元素1ml/l，乙酸1ml/l，tris2.42g/l，瓊脂粉15g/l，121°c高壓蒸汽滅菌20min，倒平板備用；所述的tap鹽溶液為：nh4cl15g/l,mgso4?7h2o4g/l，cacl2?2h2o2g/l；所述的磷酸鹽溶液為：k2hpo4288g/l，kh2po4144g/l；hutner微量元素為：edta二鈉鹽50g/l，znso4?7h2o22g/l，h3bo311.4g/l，mncl2?4h2o5.06g/l，cocl?6h2o1.61g/l，cuso4?5h2o1.57g/l，(nh4)6mo7o24?4h2o1.1g/l，feso4?7h2o4.99g/l，用koh或者h(yuǎn)cl調(diào)節(jié)ph至7.0。

所述含有金屬鉻篩選tap平板為：金屬鹽k2cr2o7，在上述tap固體培養(yǎng)基配制滅菌前添加，使得終濃度為100um。

所述篩選培養(yǎng)條件為：在光照培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度參數(shù)23±0.5°c，光強(qiáng)參數(shù)8000lx連續(xù)光照培養(yǎng)7天左右，最終挑選在篩選平板上生長(zhǎng)的突變體藻株。

所述驗(yàn)證培養(yǎng)條件為：在光照培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度參數(shù)23±0.5°c，光強(qiáng)參數(shù)8000lx連續(xù)光照培養(yǎng)7天左右，最終應(yīng)為野生型死亡，突變體藻株存活狀態(tài)良好。

有益效果，由于采用了上述方案，從衣藻突變體文庫(kù)中大規(guī)模篩選抗重金屬鉻藻株。本方法具有篩選的廣泛性，可以大量篩選具有金屬鉻抗性的突變體，而且后期還可以達(dá)到一次構(gòu)建突變體文庫(kù)，篩選其他多種金屬抗性突變體藻株的便捷效果，應(yīng)用價(jià)值極高。此外還可以通過(guò)尋找aphviii片段插入位點(diǎn)而鑒定出與金屬抗性有關(guān)的基因，為日后進(jìn)一步對(duì)衣藻吸附重金屬鉻的細(xì)胞分子生物學(xué)機(jī)制研究打下基礎(chǔ)，具有很高的研究?jī)r(jià)值，達(dá)到了本發(fā)明的目的。

優(yōu)點(diǎn)：從方波電擊轉(zhuǎn)化的衣藻突變體文庫(kù)中篩選具有金屬鉻抗性的突變體藻株，具有良好的應(yīng)用前景。

1、從衣藻突變體文庫(kù)進(jìn)行篩選比自然突變篩選，目的性強(qiáng)，便于確定性狀與基因的聯(lián)系，清楚鉻抗性或者吸附性的根本原因。

2、本發(fā)明甚至可為雙重金屬抗性或多重金屬抗性突變株的篩選方案提供相應(yīng)的參考，具有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。

3、利用本發(fā)明獲得的突變體藻株，可以對(duì)其突變位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，鑒定出與抗金屬鉻相關(guān)的基因，為后續(xù)的機(jī)理研究或者基因工程藻的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖中，1、野生型21gr；2、74號(hào)突變體；3、105號(hào)突變體；4、36號(hào)突變體，對(duì)照野生型21gr在金屬鉻篩選平板上死亡；74號(hào)和105號(hào)突變體在金屬鉻二次驗(yàn)證篩選中死亡，是假陽(yáng)性藻株；36號(hào)突變體在金屬鉻篩選平板上則存活狀態(tài)良好，可用于后續(xù)研究與應(yīng)用。

具體實(shí)施方式

1、準(zhǔn)備重金屬鉻篩選平板和衣藻突變體文庫(kù)：配制含有金屬鉻篩選tap平板，金屬鹽k2cr2o7的終濃度為100um，在tap固體培養(yǎng)基配制滅菌前添加。所述tap固體培養(yǎng)基為：tap鹽溶液25ml/l，磷酸鹽溶液0.375ml/l，hutner微量元素1ml/l，乙酸1ml/l，tris2.42g/l，瓊脂粉15g/l，121°c高壓蒸汽滅菌20min，倒平板備用；所述的tap鹽溶液為：nh4cl15g/l,mgso4?7h2o4g/l，cacl2?2h2o2g/l；所述的磷酸鹽溶液為：k2hpo4288g/l，kh2po4144g/l；hutner微量元素為：edta二鈉鹽50g/l，znso4?7h2o22g/l，h3bo311.4g/l，mncl2?4h2o5.06g/l，cocl?6h2o1.61g/l，cuso4?5h2o1.57g/l，(nh4)6mo7o24?4h2o1.1g/l，feso4?7h2o4.99g/l，用koh或者h(yuǎn)cl調(diào)節(jié)ph至7.0。

在滅菌結(jié)束降溫階段，提前將超凈工作臺(tái)紫外滅菌15min，在超凈臺(tái)進(jìn)行平板的配制，過(guò)夜晾干，放至4°c冰箱備用。

衣藻突變體文庫(kù)單克隆提前轉(zhuǎn)接至tap平板上，在23±0.5°c，8000lx光強(qiáng)下連續(xù)光照培養(yǎng)3-4天，保證實(shí)驗(yàn)所用的單克隆狀態(tài)良好。

2、轉(zhuǎn)接單克隆衣藻至重金屬鉻篩選平板：提前將超凈工作臺(tái)紫外滅菌15min，在超凈工作臺(tái)使用滅菌牙簽將每個(gè)突變體單克隆挑到畫(huà)有方格的金屬鉻篩選平板上，金屬鉻篩選平板上的方格數(shù)要保持在每板約30個(gè)左右并做好數(shù)字編號(hào)標(biāo)記，每個(gè)方格內(nèi)轉(zhuǎn)接一個(gè)突變體藻株，在23±0.5°c，8000lx光強(qiáng)下連續(xù)光照培養(yǎng)7天左右，篩選存活狀態(tài)旺盛的突變體藻株。

3、驗(yàn)證初次篩選的突變體藻株：再次驗(yàn)證階段，在突變體文庫(kù)中找到與金屬篩選板子上存活狀態(tài)旺盛所對(duì)應(yīng)的突變體藻株，提前將超凈工作臺(tái)紫外滅菌15min，在超凈工作臺(tái)使用滅菌牙簽將該藻株和野生型21gr藻株分別挑到同一塊金屬鉻篩選平板上進(jìn)行驗(yàn)證，在23±0.5°c，8000lx光強(qiáng)下連續(xù)光照培養(yǎng)7天左右，野生型21gr死亡而突變體藻株存活正常，則確定該藻株為抗金屬鉻突變體藻株。如圖，編號(hào)4中的36號(hào)突變體藻株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為cgmccno.13872。

4、抗金屬鉻突變體藻株保存：可將該突變體藻株劃線至tap平板上，在23±0.5°c，8000lx光強(qiáng)下連續(xù)光照培養(yǎng)3-4天，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

經(jīng)過(guò)上述實(shí)驗(yàn)步驟，可以獲得目標(biāo)的抗金屬鉻突變體藻株，該方法是一種有目的的大規(guī)模衣藻突變體文庫(kù)的篩選方法。上述實(shí)施方案中需要注意的問(wèn)題是：金屬鉻篩選平板上的方格數(shù)要保持在每板約30個(gè)左右，轉(zhuǎn)接過(guò)多的藻會(huì)造成藻的假陽(yáng)性；衣藻突變體文庫(kù)單克隆是狀態(tài)良好的，以免造成轉(zhuǎn)接后的大量死亡；轉(zhuǎn)接單克隆至方格內(nèi)時(shí)，所涂的藻盡量少且勻，以免產(chǎn)生假陽(yáng)性；所有與細(xì)胞接觸的實(shí)驗(yàn)用具，實(shí)驗(yàn)試劑必須是無(wú)菌的。