專利名稱：可定向克隆啟動子并研究其活性的t載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中一種載體構(gòu)建的方法，特別是一種高通量可直接定向克隆啟 動子并研究啟動子功能的T載體構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
T載體是用于直接克隆PCR產(chǎn)物的線性載體，A-T克隆技術(shù)被證明對PCR產(chǎn)物的克隆極 具價值。此方法的原理是利用7b《DNA聚合酶可向擴(kuò)增產(chǎn)物的3'端多加一個非模板依賴的 dA堿基，此dA剛與線性T載體3'突出端的dT配對，直接進(jìn)行高效率的連接，而無需限制 性內(nèi)切酶酶切的過程。
在啟動子研究領(lǐng)域中，啟動子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物往往需要克隆到帶有報道基因如增強(qiáng)型綠 色熒光蛋白(EGFP)、熒光素酶(luciferase)或分泌型堿性磷酸酶(SEAP)的載體中，常規(guī) 的方法是通過亞克隆完成，即首先將PCR產(chǎn)物克隆至傳統(tǒng)克隆型T載體，之后采用限制性內(nèi) 切酶切割下目的基因片段，再將其亞克隆至無啟動子的報告基因載體。然而這種方法有兩個 缺點(diǎn) 一是亞克隆的效率受到酶切效果、目的基因回收質(zhì)量、得率和連接效率等諸多因素的 制約；二是在啟動子的研究過程中，通常片段愈長，其含有的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)就愈多，在 克隆過程中必然會受到酶切位點(diǎn)選擇的限制問題。這種矛盾在進(jìn)行高通量篩選啟動子時顯得 尤其突出。它可以通過制備直接用于啟動子克隆和功能分析的T載體而得到解決。目前尚無 商品化的啟動子分析性T載體。
pEGFP-l是用于研究啟動子活性的載體，其中報告基因綠色熒光蛋白(EGFP)由于熒光 性質(zhì)穩(wěn)定，熒光強(qiáng)度高，對細(xì)胞無毒性，檢測方便，廣泛用于啟動子的研究中。該載體具有 原核和真核的復(fù)制起始點(diǎn)如pUC、 fl和SV40的復(fù)制起始點(diǎn)，同時具有卡那霉素(Kana)抗 性基因和新霉素(Neo)抗性基因作為篩選標(biāo)記，EGFP基因序列位于其多克隆位點(diǎn)的下游。 pGL3-basic和pSEAP2-basic是另2種常用的啟動子分析載體，分別以luciferase和SEAP作為 報告基因，都具有氨芐青霉素Ump)抗性基因作為篩選標(biāo)記。
目前，經(jīng)典的T載體的構(gòu)建方法有2種。第一種方法是先將質(zhì)粒通過SwaI或五coRV等 產(chǎn)生平端切點(diǎn)的內(nèi)切酶線性化，然后利用末端轉(zhuǎn)移酶或具有末端轉(zhuǎn)移酶活性的T叫酶在dTTP 或ddTTP環(huán)境中實(shí)現(xiàn)T的添加(Papp T， Kirchner S， Diener U， Jafari, M， Golka A， Schiffinann D， 1995. Cloning of PCR fragments with a modified M13mpl8 T-vector. Trends Genet. 11， 169)。 第二種方法是限制性內(nèi)切酶酶切的方法，首先制備前T載體，即在出發(fā)載體中引入2個串聯(lián) 的能產(chǎn)生3'突出單堿基末端的限制性內(nèi)切酶如ZcwI、 XMI (或它們的同裂酶)等的識別位點(diǎn)， 稱為義c/nl盒、J/w/I盒，這些酶切割特異性序列后產(chǎn)生的末端為3'突出單堿基N(任意堿基)， 如果將該堿基設(shè)計(jì)為T,則可以通過酶切前T載體使其產(chǎn)生2個3'突出T堿基而成為T載體 (Vries E.， 1998. .A vector for direct cloning of PCR products in a double Xcm I restriction site offering compatible single 3' overhanging T residues. Mol Biotechnol. 10, 273 )。
目前就T載體的制備方法來講，存在著不足之處，主要表現(xiàn)在以下兩個方面 一、非重組背景較高，克隆效率低下。
末端轉(zhuǎn)移酶或化《酶制備T載體有時由于酶加T的效率低下，有些載體分子末端根本沒 被修飾從而導(dǎo)致兩端均未加T的平端線性質(zhì)粒的存在，在連接過程中難以避免載體自身環(huán) 化，有時也存在線性質(zhì)粒在加T尾過程中其兩端的序列被部分刪除的問題。
釆用Xc/wI、 ^4Ad等限制性內(nèi)切酶制備T載體的方法也會因?yàn)槊盖行氏鄬^低，經(jīng)常 產(chǎn)生酶切不完全的現(xiàn)象，出現(xiàn)克隆過程中非重組背景過高的問題。目前解決這一問題最有效 的方法是在前T載體的兩個J&附I或兩個^^1酶切位點(diǎn)之間引入足夠長的間隔DNA，經(jīng)瓊脂 糖電泳后將完全酶切的質(zhì)粒和部分酶切的質(zhì)粒分開。然而，引入間隔DNA帶來的一個新問 題是由于環(huán)型超螺旋質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳中比分子量相當(dāng)?shù)木€性質(zhì)粒涌動快，因此完全 未被酶切的環(huán)型超螺旋前T載體往往與分子量小于它的T載體(完全切開)混雜，因此造成 非重組轉(zhuǎn)化子的本底較高，如果前T載體缺乏區(qū)別于T載體的篩選標(biāo)記，就要面臨較繁瑣的 篩選工作。
二、無法實(shí)現(xiàn)定向克隆，篩選工作量大。
在使用商品化的傳統(tǒng)T載體進(jìn)行目的基因的克隆時，目的基因會以不確定的方向插入載 體，兩個方向插入的機(jī)率相同。如果此T載體僅僅用來進(jìn)行目的基因的克隆、擴(kuò)增和保存， 并無妨礙；但如果是用于基因的表達(dá)或啟動子分析等，則需要進(jìn)行較繁瑣的篩選工作篩選出 方向正確的克隆，耗時耗力，尤其不適合高通量篩選啟動子的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效率可定向克隆啟動子擴(kuò)增產(chǎn)物的T載體制備方法，真正做 到高通量、直接、定向的克隆表達(dá)，此方法同樣適用于普通克隆型T載體和表達(dá)型T載體的 制備，將在基因工程領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。
本發(fā)明所提供的制備T載體的方法，包括以下步驟-
1) 制備含有Zc附I盒(或爿MI盒)的前T載體pEGFP-UC， pGL3-UC和pSEAP2-UC。 所述iTcmI盒包括間隔DNA序列，緊密連接于所述間隔DNA序列兩側(cè)的各一個XcmI酶切位 點(diǎn)序列；
其中前T載體pEGFP-UC間隔序列為質(zhì)粒pUC18基因全序列，所述J&ml盒還包括連接 于所述各一個Xcm I酶切位點(diǎn)序列的酶切位點(diǎn)5g/H和^TwI，上游引物的識別位點(diǎn)中尚 有稀有限制酶位點(diǎn)i^d位點(diǎn)的前半部分即"GTTT"，最后一個T將構(gòu)成酶切割得到的3' 突出T。 Pmd位點(diǎn)的特征是①不存在于出發(fā)載體pEGFP-l序列中；②識別序列中除兩端 以外的堿基中含有T，由它構(gòu)成3'突出T。其它符合該2個條件的位點(diǎn)如i^d、 Sg/I、 EcoRV 等的位點(diǎn)亦可引入至盒中。
前T載體pGL3-UC和pSEAP2-UC間隔序列為質(zhì)粒pUC-K基因全序列，pUC-K為發(fā)明 人自行構(gòu)建的質(zhì)粒，其特征為以卡那霉素抗性基因取代pUC18中的氨芐青霉素抗性基因，其 余序列與pUC18相同。所述XcmI盒還包括連接于所述各一個義cwl位點(diǎn)的Mwl和屈ol酶切 位點(diǎn)，上游引物的XowI切割位點(diǎn)前(包括潛在的3，突出T)尚有稀有限制酶位點(diǎn)Pwd位點(diǎn) 的前半部分即"GTTT"。
2) 用Zc/nl或Xcml同裂酶酶切步驟l)中的前T載體，得到T載體；
本發(fā)明具體實(shí)現(xiàn)過程如下
1. Xcwl盒的制備
根據(jù)質(zhì)粒pUC18和pUC-K的序列，設(shè)計(jì)引物序列為 pUC誦F: 5，-CGAA^ECICC4GGniC4GrrGGAGACCAAGTTTACTCA-3，； pUC-R: 5，-CAACTCGAGCC^4CCGrGC4GrGGGACAGTTACCAATGCT隱3，: pUC國KF: 5，-CGAAQQ￡fiICC4GGIIIC4G7TGGAGACCAAGTTTACTCA-3，。
三條引物的5'端分別引入限制性內(nèi)切酶i5gni、 J^ol和M"I識別位點(diǎn)，用單線標(biāo)示；Xc/nl 酶識別位點(diǎn)用斜體標(biāo)示；在pUC-F和pUC-KF引物的Ami識別位點(diǎn)中尚包含稀有限制酶位 點(diǎn)i^d位點(diǎn)的前半部分即GTTT，最后一個T將構(gòu)成7cml酶切割得到的3'突出T，用波線 標(biāo)示，用于啟動子PCR產(chǎn)物的定向克隆分析。
pUC-F和pUC-R用于擴(kuò)增pUC18; pUC-KF和pUC-R用于擴(kuò)增pUC-K。將所得PCR產(chǎn) 物自身環(huán)化，涂布于帶有相應(yīng)抗生素的平板并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，確定其抗生素抗性和 篩選標(biāo)記完整，同時酶切鑒定篩選盒正確引入的陽性克隆，分別命名為pUC-X和 pUC-KX。用J5g/H、 Wol雙酶切pUC-X，用Mwl和Wol雙酶切pUC-KX，制成Xcwl盒。
2. 在載體pEGFP-l、 pGL3-basic和pSEAP2-basic的多克隆位點(diǎn)中引入JfcmI盒構(gòu)建前T
載體
pEGFP-1載體用Bg/II和酶切，由于內(nèi)切酶JO/oI和Sa/I是同尾酶，所以pUC-X和 pEGFP-l在酶切回收后可以直接進(jìn)行連接反應(yīng)。pGL3-basic和pSEAP2-basic用Mwl和Wol 雙酶切，酶切產(chǎn)物與Mwl和^oI雙酶切的pUC-KX進(jìn)行連接。義cwl盒的引入使三種重組子 均帶有^附p和雙抗性和丄acy篩選標(biāo)記，因此將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂布于具有^ ; 和 雙抗生素的平板，大大減少非重組背景，提高克隆效率。經(jīng)ArmHI酶切進(jìn)一步鑒定，構(gòu)建的 載體分別命名為pEGFP-UC、 pGL3-UC和pSEAP2-UC，即為前T載體(圖l， 2， 3)。
3. T載體的制備
用Xcml酶切前T載體pEGFP-UC、 pGL3-UC和pSEAP2-UC，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后 回收大片段。切膠回收的大片段即是T載體pEGFP-T、 pGL3-T和pSEAP2-T，可以用于PCR 產(chǎn)物的定向克隆。此時，該載體產(chǎn)生的粘性末端為
5，一 CCAGGTTT CGGTTGG-— 3'
3，一 GGTCAAA TGCCAACC— 5，
4. 啟動子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體的連接及定向克隆
啟動子擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)必須遵循的原則是將稀有酶PweI (或引入的其它酶位點(diǎn))識別 位點(diǎn)的后半部分"AAAC"作為下游引物5'端起始堿基，而上游引物5'端不能^"AAAC"起始。 PCR產(chǎn)物采用T叫DNA擴(kuò)增酶擴(kuò)增，或者采用P/w、 iV/me^ar等高保真酶擴(kuò)增后再通過Tfl《 擴(kuò)增酶加A尾，得到的粘性末端為
5, NNN-------------NGTTTA3,
3,ANNN-------------NCAAA 5'
這樣當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與上述T載體反向連接時，由下游引物提供的5'端"AAAC"與T
載體義cwl盒提供的"GTTT"融合而形成完整的尸/wd位點(diǎn)(GTTTAAAC)，且pEGFP-T、pGL3-T 和pSEAP2-T載體本身并沒有此識別位點(diǎn)，因此可以通過尸md酶切連接產(chǎn)物而去除反向連接 克隆。酶切過程于轉(zhuǎn)化前完成，大大提高篩選得到PCR產(chǎn)物正向插入的陽性克隆的機(jī) 率。流程如圖4所示。
5.通過藍(lán)白斑篩選標(biāo)記篩選陽性克隆。
考慮到T載體中可能混雜的未被義cml酶切的或僅在其單一位點(diǎn)酶切后自身環(huán)化的質(zhì)粒， 它們帶有完整的丄flcZ'讀碼框，其轉(zhuǎn)化子在含有IPTG和X-Gal的固體培養(yǎng)基上生長為藍(lán)色菌 落，而T載體克隆產(chǎn)物呈白色菌落，因而可以通過藍(lán)白斑篩選的方法排除這些非重組轉(zhuǎn)化子， 挑取白色菌落進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步提高陽性克隆效率。
本發(fā)明中構(gòu)建T載體的方法具有如下優(yōu)勢
1. 盒中的長間隔序列選用質(zhì)粒pUC18或pUC-K基因的全序列或其它符合條件(帶 有與出發(fā)載體不同的篩選標(biāo)記)的序列，以質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增效率高。
2. Zcml盒中的質(zhì)粒pUC18或pUC-K基因全序列為前T載體增加了篩選標(biāo)記，使前T 載體可以具備卡那霉素和氨芐青霉素雙重抗性，同時又具有藍(lán)白斑篩選標(biāo)記，可以簡便、高 效地篩選帶有間隔基因序列的前T載體。
3. 在采用XcmI切割前T載體而制備T載體的過程中，長間隔序列有助于將ZonI完全 酶切產(chǎn)生的T載體和部分酶切的質(zhì)粒分離開。但在酶活性較低的情況下，存在較多的完全未 被酶切的環(huán)型超螺旋前T載體，它們往往與分子量小于它的T載體(完全切開者)混雜，因 此造成非重組轉(zhuǎn)化子的本底較高，也影響了T載體的得率。解決此問題的備擇方案是再選 用位于長間隔序列中間的一個常用內(nèi)切酶如五coRI進(jìn)行酶切，將未被XctmI酶切的環(huán)型質(zhì)粒 線性化，從而使其易于與T載體進(jìn)行分離，選擇這個酶的原則是在T載體的序列中不應(yīng)出現(xiàn) 該酶的識別位點(diǎn)。
4. 實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物定向克隆于T載體。
Xcml盒設(shè)計(jì)精密，前一個XcwI切割位點(diǎn)前(包括潛在的3'突出T)尚有稀有限制酶位 點(diǎn)尸wd位點(diǎn)的前半部分即"GTTT"。為實(shí)現(xiàn)目的基因的定向克隆，擴(kuò)增啟動子的引物也需要 特殊設(shè)計(jì)，必須遵循的原則是將尸md位點(diǎn)的后半部分即"AAAC"作為下游引物5'端起始堿 基，而上游引物5'端不能以"AAAC"起始。PCR產(chǎn)物采用Ta《DNA擴(kuò)增酶擴(kuò)增，或者采用 iyM、/V/me^ar等高保真酶擴(kuò)增后再通過r叫擴(kuò)增酶加A尾。這樣當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與上述T載 體皮向連接時，由下游引物提供的5'端"AAAC"與T載體IcmI盒提供的"GTTT"融合而形成 完整的尸md位點(diǎn)(GTTTAAAC)，因此可以通過尸附d酶切連接產(chǎn)物而去除反向連接克隆， 大大提高篩選到正向克隆的機(jī)率。
5. 藍(lán)白斑篩選進(jìn)一步排除T載體中可能混雜的未被酶切的或單酶切后自身環(huán)化的非重 組轉(zhuǎn)化子，大大提高陽性克隆效率。
6. 本方法同樣適用于普通克隆型T載體和表達(dá)型T載體的制備。


圖1為前T載體pEGFP-UC的結(jié)構(gòu)示意圖
圖2為前T載體pGL3-UC的結(jié)構(gòu)示意圖 圖3為前T載體pSEAP2-UC的結(jié)構(gòu)示意圖 圖4為利用T載體定向克隆啟動子PCR產(chǎn)物的流程圖
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一T載體pEGFP-T、 pGL3-T和pSEAP2-T的制備
1. Xcwl盒的制備
根據(jù)質(zhì)粒pUC 18和pUC-K的序列，設(shè)計(jì)引物序列為 pUC-F: 5，-CGAAGATCTCC4GG7TrC4G7TGGAGACCAAGTTTACTCA-3，: pUC-R: 5，-CAACTCGAGCC^4CCGrGC4GrGGGACAGTTACCAATGCT-3，: pUC隱KF: 5,-CGAACGCGTCC4GGnTC4G7TGGAGACCAAGTTTACTCA-3'。 三條引物的5'端分別插入的限制性內(nèi)切酶Sg/H、 Wol和Mwl識別位點(diǎn)，用單線標(biāo)示；義c7nl 酶識別位點(diǎn)用斜體標(biāo)示；在pUC-F和pUC-KF引物的Xcwl識別位點(diǎn)中尚包含稀有限制酶位 點(diǎn)尸/nel位點(diǎn)的前半部分即GTTT，最后一個T將構(gòu)成Jfc附I酶切割得到的3'突出T，用波線 標(biāo)示，用于啟動子PCR產(chǎn)物的定向克隆分析。
以質(zhì)粒pUC18為模板，pUC-F和pUC-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以質(zhì)粒pUC-K為模板， pUC-KF和pUC-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 擴(kuò)增體系中含2 U iV/weWw DNA聚合酶， 0.2 mmol/L dNTP， lx/v細(xì)ewar buffer,引物各0.4 pmol/L，模板5ng左右；PCR擴(kuò)增的循環(huán)程 序?yàn)?4°C預(yù)變性5min， (94 。C 30 s; 59 °C 30s; 72 。C 2 min) x25, 72 。C最后延伸10分 鐘。經(jīng)P/。瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后T4DNA激酶37'C作用60min， 70。C10min將該酶滅活。之后，建立如下自環(huán)化連接反應(yīng)10 ^L，連接體系中含1U連接酶 (MBI)， lx連接Buffer,約100ngPCR產(chǎn)物。4'C連接16小時。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 (JM109)后，經(jīng)藍(lán)白斑及抗生素抗性篩選后得到陽性克隆，限制性內(nèi)切酶酶切進(jìn)一步鑒定 Zcml盒是否正確引入，將構(gòu)建的兩載體分別命名為pUC-X和pUC-KX。
2. 在pEGFP-l、 pGL3-basic和pSEAP2-basic的多克隆位點(diǎn)中引入義cml盒構(gòu)建前T載體 已構(gòu)建的載體pUC-X用5gm、 J^oI酶切，37 。C作用2小時，50 pL酶切體系為5嗎
pUC-X， 5g/II、 iT oI內(nèi)切酶各20 U， 10 mM Tris-HCl (pH 8.5)， 10 mM MgCl2， 100 mM KCl， 0.1 mg/ml BSA。同時，pEGFP-l載體用Bg/II和Sa/I酶切，50酶切體系如下5pEGFP-l ，
和Sa/I內(nèi)切酶各20 U， 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2， 100 mM NaCl， 0.1 mM BSA。由于內(nèi)切酶J^oI和Sa/I是同尾酶，所以pUC-X和pEGFP-l在酶切回收后可以直接進(jìn) 行連接反應(yīng)。10 nL連接體系為1 U連接酶(MBI)， lx連接Buffer,約50 ng酶切后純化 的pUC-X， 50 ng酶切后純化的pEGFP-l 。連接產(chǎn)物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化JM109菌株，經(jīng)(50 mg/ml)和《a"fl (25 mg/ml)雙抗性篩選得到陽性菌落，經(jīng)S"mHI酶切進(jìn)一步鑒定，構(gòu)建的 載體命名為pEGFP-UC，即為前pEGFP-l的T載體。
將載體pUC-KX用MmI和屈ol雙酶切，反應(yīng)buffer和條件與pUC-X相同，回收大片段 質(zhì)粒；同時，pGL3-basic和pSEAP2-basic也分別采用相同的限制酶處理，回收大片段質(zhì)粒后 分別與相同酶切處理的pUC-KX建立連接反應(yīng)，反應(yīng)體系、條件及陽性克隆篩選條件均與上
段敘述相同。構(gòu)建的載體分別命名為pGL3-UC和pSEAP2-UC。 3. T載體的制備
用Xc附I分別酶切前T載體pEGFP-UC、 pGL3陽UC和pSEAP2-UC， 50 pL酶切反應(yīng)體系 如下20 UXcwI內(nèi)切酶，10 mMTris-Cl (pH 7.9), 10 mM MgCl2, 50 mMNaCl， 1 mM DTT， 5 ng質(zhì)粒。37。C酶切3小時后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后分別回收大片段。切膠回收的大片 段即是T載體pEGFP-T、 pGL3-T和pSEAP2-T，可以用于PCR產(chǎn)物的定向克隆。
實(shí)施例二 T載體pEGFP-T的正向克隆的篩選及效率檢測
用7i^DNA聚合酶擴(kuò)增趨化因子受體CXCR4最小啟動子，引物設(shè)計(jì)遵循以下原則即 在下游引物的5'端以"ACCC"為起始堿基，而上游引物不以"ACCC"起始。這樣僅當(dāng)PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物與上述T載體反向連接時，完整的內(nèi)切酶i^d的識別位點(diǎn)形成(GTTTAAAC)，而 且pEGFP-T、 pGL3-T和pSEAP2-T載體本身并沒有此識別位點(diǎn)。因此可以通過戶附d酶切來 去除反向連接克隆。具體步驟如下
CXCR4啟動子引物設(shè)計(jì)如下
CXCR4-F: 5 ， - TACCGACCACCCGCAAACAG -3 ，
CXCR4-R: 5 ，-ACCCTAACCGCTGGTTCTCCAGA-3 ，
CXCR4 PCR產(chǎn)物分別與pEGFP-T、 pGL3-T和pSEAP2-T載體進(jìn)行連接反應(yīng)，10nL連 接體系如下25ngPCR產(chǎn)物，50ngT載體，3UT4DNA連接酶，16。C連接16小時。這個 反應(yīng)Buffer不僅適用于T4 DNA連接酶，同時適用于Pmd酶和堿性磷酸酶(CIAP)。反應(yīng) Buffer的組成為10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 0.1 mg/ml BSA和0.5 mM ATP。連 接產(chǎn)物經(jīng)70 °C lOmin滅活T4 DNA連接酶后，加入10 U Pmel酶和1 U堿性磷酸酶。堿性磯 酸酶的作用是去除酶切產(chǎn)物的5，磷酸以防止自身環(huán)化。再經(jīng)85 。C滅活15min，將經(jīng)過以上處 理的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109菌株，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。提取質(zhì)粒后建立酶切反應(yīng)鑒定插入片段 存在與否，PCR反應(yīng)鑒定克隆方向(兩條引物分別位于載體和插入片段上)。結(jié)果表明，3種 T載體轉(zhuǎn)化效率均不低于5 x 105 cfii/mg， 90%以上菌落為白色，且正向插入者均為卯％以上。 重組載體分別命名為pEGFP-T/CXCR4、 pGL3/CXCR4和pSEAP2/CXCR4。
實(shí)施例三重組T載體的功能檢測
乳腺癌細(xì)胞MCF-7分別用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液于37 °C 、 5% C02條件下培 養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1天，取生長良好的細(xì)胞，胰酶消化計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)至2x1051111，在24孔培 養(yǎng)板中加入上述細(xì)胞的RPMI1640培養(yǎng)液，使每孔細(xì)胞數(shù)為lx105。在Lipofectamine 2000的 介導(dǎo)下分別轉(zhuǎn)染前述3種克隆有CXCR4啟動子的重組T載體，以pEGFP -1 、 pGL3-basic和 pSEAP2-basic質(zhì)粒作為陰性對照。每種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染量為lpg/孔，脂質(zhì)體用量為每孔2pl。培 養(yǎng)5小時后更換新鮮培養(yǎng)液，在37'C、 5% C02條件下繼續(xù)培養(yǎng)，24h后于倒置熒光顯微鏡 觀察重組pEGFP-T/CXCR4轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，可見大部分MCF-7細(xì)胞呈現(xiàn)很強(qiáng)的綠色熒光(圖5)。 采用luciferase和SEAP檢測試劑盒分別測定pGL3/CXCR4和pSEAP2/CXCR4轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中 各自酶活性(化學(xué)發(fā)光檢測)，較陰性對照者分別提高50倍以上，證明我們構(gòu)建的T載體是
有功能的，可以用于啟動子的克隆和功能研究。
權(quán)利要求
1、一種用于克隆啟動子的T載體pEGFP-T、pGL3-T和pSEAP2-T的制備方法，包括以下步驟1)制備含有XcmI盒(或AhdI盒)的前T載體pEGFP-UC、pGL3-UC和pSEAP2-UC，所述XcmI盒包括間隔DNA序列，緊密連接于所述間隔DNA序列兩側(cè)的各一個XcmI酶切位點(diǎn)序列；2)用XcmI酶或XcmI酶的同裂酶酶切步驟1)中的前T載體，得到T載體；其特征在于所述步驟1)中的間隔DNA序列為帶有與出發(fā)載體具有不同抗性基因或其它選擇標(biāo)記的序列，如構(gòu)建前T載體pEGFP-UC時所采用的質(zhì)粒pUC18全序列和構(gòu)建前T載體pGL3-UC與pSEAP2-UC時所采用的pUC-K序列，pUC-K為發(fā)明人自行構(gòu)建的質(zhì)粒，其特征為以卡那霉素抗性基因取代pUC18中的氨芐青霉素抗性基因，其余序列與pUC18相同。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述Xcml盒還包括連接于所述各一個J^附I位 點(diǎn)的酶切位點(diǎn)序列，即用于前T載體pEGFP-UC制備的Bg/II和Wol識別位點(diǎn)或用于前T載 體pGL3-UC與pSEAP2-UC制備的Mwl和Ji7wl位點(diǎn)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述構(gòu)建前T載體的Xc/nl盒由PCR擴(kuò)增 得到，根據(jù)pUC18和pUC-K的序列設(shè)計(jì)的PCR引物，序列如下pUC-F: 5，-CGAAGATCTCC4GGnTC4GTrGGAGACCAAGTTTACTCA-3，;pUC國R: 5，陽CAACTCGAGCC^4CCGrGC4GrGGGACAGTTACCAATGCT-3':pUC-KF: 5，-CGAACGCGTCC4GG7TrC4G7TGGAGACCAAGTTTACTCA-3,。pUC-F和pUC-R用于擴(kuò)增pUC18; pUC-KF和pUC-R用于擴(kuò)增pUC-K。三條引物的5'端分別引入限制性內(nèi)切酶5gm、 J^oI和MwI的識別位點(diǎn)，用單線標(biāo)示；Xcwl酶識別位點(diǎn)用斜體標(biāo)示；在pUC-F和pUC-KF引物的義cwl識別位點(diǎn)中尚包含稀有限制酶位點(diǎn)位點(diǎn)的前半部分即GTTT，最后一個T將構(gòu)成XcmI酶切割得到的3'突出T，用波線標(biāo)示，用于啟動子PCR產(chǎn)物的定向克隆分析。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，啟動子擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)必須遵循如下原則將 稀有酶Pmel識別位點(diǎn)的后半部分"AAAC"作為下游引物5'端起始堿基，而上游引物5'端不 能以"AAAC"起始。PCR產(chǎn)物采用r叫DNA擴(kuò)增酶擴(kuò)增，或者采用戶/w、 /V7'WMtor等高保 真酶擴(kuò)增后再通過化《擴(kuò)增酶加A尾。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在所述出發(fā)載體為pEGFP-l的多克隆位點(diǎn)的 5g/n位點(diǎn)和5WI位點(diǎn)引入所述的Xcwl盒！或在所述出發(fā)載體pGL3-basic和pSEAP2-basic 的多克隆位點(diǎn)的MM位點(diǎn)和^TwI位點(diǎn)引入所述的Zcwl盒。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于用XcwI酶或XcmI酶的同裂酶酶切步驟l 中的前T載體，得到T載體，啟動子PCR產(chǎn)物與T載體的連接物可在轉(zhuǎn)化之前用尸wd酶切 來減少反向連接克隆，提高PCR產(chǎn)物正向克隆效率。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于XcwI盒中作為間隔DNA序列的質(zhì)粒pUC18 或pUC-K全基因序列，具有完整的Z"cZ'讀碼框架，通過藍(lán)白斑篩選進(jìn)一步排除T載體中可 能混雜的未被酶切的或單酶切后自身環(huán)化的非重組轉(zhuǎn)化子，提高陽性克隆效率。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可直接定向克隆啟動子并研究啟動子活性的T載體及其構(gòu)建方法，包括以下步驟1)制備含有XcmI盒(或AhdI盒)的前T載體，包括間隔DNA序列即帶有與出發(fā)載體具有不同抗性基因或其它選擇標(biāo)記的序列，緊密連接于此間隔DNA序列兩側(cè)的各一個XcmI酶切位點(diǎn)序列；2)用XcmI酶或XcmI酶同裂酶酶切步驟1)中的前T載體，得到T載體；其中所述步驟1)中的XcmI盒通過PCR擴(kuò)增得到，在上游引物XcmI酶識別位點(diǎn)中尚包含稀有限制酶PmeI識別位點(diǎn)的前半部分，用于啟動子PCR產(chǎn)物的定向克隆分析。本發(fā)明中的方法同樣適用于普通克隆型T載體和表達(dá)型T載體的制備，將在基因工程領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/66GK101177690SQ20061012930
公開日2008年5月14日 申請日期2006年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月9日
發(fā)明者蓓 孫, 左愛軍, 瑞 張, 張鏡宇, 李曉霞, 梁東春, 王寶利, 剛 郭 申請人:天津醫(yī)科大學(xué)