專(zhuān)利名稱(chēng)：一種花生種胚特異性啟動(dòng)子及其克隆和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，特別是植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及了一個(gè)新的花生基因的特異性啟動(dòng)子的克隆。
背景技術(shù)：
種子在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的地位。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，人類(lèi)糧食的80%直接取自植物的種子，稻、麥等種子中富含淀粉，是人類(lèi)賴(lài)以生存的主糧；大豆、花生、油菜、芝麻等種子的含油量高，是食用油的主要來(lái)源。種子中儲(chǔ)存物質(zhì)的多少，直接影響作物的產(chǎn)量。因此，提高糧食作物和油料作物產(chǎn)量的根本在于提高其種子中儲(chǔ)藏物質(zhì)的積累量。盡管常規(guī)育種技術(shù)所培育的優(yōu)良作物品種，為解決世界糧食安全問(wèn)題做出了重大貢獻(xiàn)。然而，近20年來(lái)許多作物產(chǎn)量呈現(xiàn)徘徊局面，新育成品種在產(chǎn)量潛力上沒(méi)有大的突破，常規(guī)育種技術(shù)在繼續(xù)提高作物產(chǎn)量方面的潛力有限。因此，挖掘新的功能基因，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高花生等作物產(chǎn)量及種子的含油量具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。被子植物胚胎發(fā)育主要經(jīng)歷了 3個(gè)相互交錯(cuò)的階段:第一階段為組織分化期，單細(xì)胞的受精卵經(jīng)過(guò)多次分裂，并分化形成胚性組織和器官(即幼胚，從球形胚到心形胚期);第二階段為細(xì)胞伸長(zhǎng)期(胚發(fā)育到魚(yú)雷胚期)，此時(shí)細(xì)胞分裂基本停止，以細(xì)胞膨大伸長(zhǎng)和儲(chǔ)藏物質(zhì)積累為主要特征；第三階段是成熟脫水期，種子開(kāi)始脫水標(biāo)志著胚胎發(fā)育成熟，種子經(jīng)過(guò)脫水后代謝活動(dòng)下降直至靜止。對(duì)擬南芥種子發(fā)育表達(dá)譜研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大約289個(gè)種子特異性表達(dá)基因參與了胚胎發(fā)育，其中發(fā)現(xiàn)48個(gè)在不同發(fā)育階段表達(dá)和定位在種子不同區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)ΨN子發(fā)育和儲(chǔ)藏物質(zhì)積累起重要的調(diào)控作用。對(duì)這些基因進(jìn)行功能解析和表達(dá)調(diào)控研究具有重要意義?；ㄉ鳛橹匾挠土献魑铮粌H在國(guó)內(nèi)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中具有重要地位，而且在世界貿(mào)易中也具有舉足輕重的作用。研究表明，不同植物種子儲(chǔ)藏油脂的含量存在很大差異如主要油料作物油菜為2 8%-48%、大豆15%-22%、花生44%_54%、芝麻45%_57%，并且其主要脂肪酸組成也不同，油菜油中含有大量的芥酸(31-55%)，其他含量較高的不飽和脂肪酸為油酸14-19%、亞油酸12-24%和亞麻酸1-10%;大豆油中含量最高的為亞油酸52-65%和油酸25-36%，并且棕櫚酸(6-8%)、硬脂酸(3-5%)和亞麻酸(2_3%)也占有較大比例；花生種子脂肪酸組成主要是:棕櫚酸，油酸和亞油酸，分別占總脂肪酸含量的10%、36-67%和15-43%，是除橄欖油外單不飽和脂肪酸油酸含量最高的。研究調(diào)控花生種子發(fā)育和儲(chǔ)藏物質(zhì)積累相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)于通過(guò)基因工程改良其他作物具有一定指導(dǎo)意義。目前在植物基因工程研究中，大多采用的是組成型啟動(dòng)子，如CaMV35S啟動(dòng)子、玉米Ubiquitin啟動(dòng)子等，這些啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)外源基因在植物的所有組織和器官中高效表達(dá)，造成能量浪費(fèi)，有些外源基因的表達(dá)還影響了植物的正常發(fā)育。為在確保植物正常生長(zhǎng)的情況下，對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行轉(zhuǎn)基因遺傳改良，調(diào)控基因在一定發(fā)育時(shí)期和特定組織中表達(dá)非常重要。因此，尋找時(shí)空特異性表達(dá)啟動(dòng)子十分重要，也具有重要應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述的原因，本發(fā)明克隆獲得了一個(gè)新的花生LECl基因的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子于種子特定發(fā)育階段驅(qū)動(dòng)基因在種胚或胚乳中特異表達(dá)。本發(fā)明構(gòu)建了該啟動(dòng)子及6個(gè)其5'端系列缺失的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥。實(shí)驗(yàn)表明，包括5'端非翻譯區(qū)和其上游2228bp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因特異地在發(fā)育早期的種胚中表達(dá)；而缺失5'端975bp-2009bp的1254bp、935bp、721bp、617bp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的⑶S基因在根、莖、葉、花和發(fā)育早期的種子中均有表達(dá)，表明_2228bp至-1255bp區(qū)段不僅含有種子特異性表達(dá)的正調(diào)控元件，還包括抑制在其他組織中表達(dá)的負(fù)調(diào)控元件。缺失5,端1875bp的354bp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的⑶S基因在葉和發(fā)育早期的種胚中表達(dá)，在根中有少量表達(dá)，而在莖和花中沒(méi)有表達(dá)。進(jìn)一步缺失5'端2124bp的105bp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因僅在葉緣處表達(dá)，其余組織和器官都未檢測(cè)到表達(dá)。因此，這一啟動(dòng)子的克隆和缺失分析對(duì)于研究植物種子發(fā)育和儲(chǔ)藏物質(zhì)積累，提高種子中儲(chǔ)藏物質(zhì)如淀粉、脂肪及蛋白的含量具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。該啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)GUS基因在種子發(fā)育早期的種胚中特異表達(dá)。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的根、莖、葉中和進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期的花中不表達(dá)。其基因序列如Seq ID No:4所示。該啟動(dòng)子是在已得到的花生AhLEClA基因的基因組序列(該基因其序列為:如SeqID No:2所示)的基礎(chǔ)上，通過(guò)染色體步移技術(shù)得到的2739bp AhLEClA基因5'端上游序列，如Seq ID No:1所示。經(jīng)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，AhLEClA基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于翻譯起始密碼ATG上游-82nt處，故2739bp5 '端上游序列中包含該基因2625bp的啟動(dòng)子區(qū)，該區(qū)域的序列如Seq ID No: 3所示。通過(guò)PlanCARE和PLACE軟件對(duì)該啟動(dòng)子進(jìn)行順式調(diào)控元件分析，有2個(gè)胚乳特異性調(diào)控元件SKn-1 motif (GTCAT),分別處于-83 _87bp和-479 -483bp處；在-448 _454bp和-1603 _1609bp處分別有一個(gè)胚或胚乳特異性作用元件 CANBANAPA(CNAACAC);在-1244 -1253bp、_2078 一2087bp 和-2271 _2280bp處分別有一個(gè)種子特異性表 達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因AGL15結(jié)合位點(diǎn)CARGCW8GAT (CffffffffffffffffG);此夕卜，還有四個(gè)胚特異性的ABA作用相關(guān)的DPBFC0RED⑶C3元件(ACACNNG)分布在-116 -12Obp,-450 -456bp、-1326 _1332bp 和-1329 _1335bp 處。獲得的 2625bp 啟動(dòng)子序列中還包括大量在葉肉細(xì)胞、根和花中特異表達(dá)的元件CACTFTPPCA1 (YACT)、R00TM0TIFTAP0X1(ATATT)和P0LLEN1LELAT52 (AGAAA),同時(shí)包含13個(gè)轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控元件WB0XATNPR1(TTGA0.WRKY710S (TGAC)。這些負(fù)調(diào)控元件中5個(gè)位于啟動(dòng)子-1255 -2228bp區(qū)段(分別位于-1613 -1616bp、-1649 _1652bp、_1953 _1956bp、_2144 _2147bp、_2156 -2159bp)，-2228 -2625bp還集中分布了 4個(gè)WRKY710S元件(-2275 _2278bp、_2281 -2284bp、-2445 -2448bp、-2472 _2475bp )，-1 -1254bp 區(qū)段僅含有 4 個(gè) WRKY7IOS 元件(位于-82 -85bp、-97 -1OObp、-478 -48Ibp和-870 _873bp)。因此，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的⑶S基因在種胚中特異表達(dá)受種子特異性表達(dá)調(diào)控元件和抑制在其他組織中表達(dá)的負(fù)調(diào)控元件的共同調(diào)控。存在的種子特異性表達(dá)調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控元件的位置如說(shuō)明書(shū)附圖2所
/Jn o為了完成該啟動(dòng)子的初步功能分析，本發(fā)明以PCAMBIA3301為出發(fā)載體構(gòu)建了含有AhLEClA基因不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子片段的GUS基因植物表達(dá)載體，即用AhLEClA基因不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子片段取代PCAMBIA3301中驅(qū)動(dòng)⑶S基因表達(dá)的35S啟動(dòng)子，獲得的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，用花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，即待擬南芥繁殖開(kāi)花時(shí)，配制浸染液，用農(nóng)桿菌浸染將要開(kāi)放的花序。本發(fā)明分別取營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的根、莖和葉以及繁殖期的轉(zhuǎn)基因擬南芥的花、授粉后10天和20天的種子，通過(guò)現(xiàn)有的方法檢測(cè)GUS基因的表達(dá)情況。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子區(qū)域中，2228bp的啟動(dòng)子，其基因其序列如Seq ID No:4所示，即可驅(qū)動(dòng)的⑶S基因僅在授粉后10天的種胚中表達(dá)，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的根、莖、葉和生殖期的花中均不表達(dá)，在授粉20天的種子中也沒(méi)檢測(cè)到GUS基因的表達(dá)。由此可見(jiàn)，本發(fā)明克隆的花生AhLEClA基因的啟動(dòng)子具有早期發(fā)育種胚表達(dá)特異性，即表達(dá)的時(shí)空特異性。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，發(fā)明人證實(shí)了，在本發(fā)明提供的2625bp的啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)缺失了 5'端396bp片段的2228bp具有早期發(fā)育種胚表達(dá)特異性，通過(guò)克隆出的2228bp特異性啟動(dòng)子，其基因其序列如Seq ID No:4所示，即可在早期發(fā)育的胚中特異表達(dá)，同時(shí)利用這種特異性表達(dá)在早期發(fā)育胚中特異表達(dá)，可以應(yīng)用在提高種子儲(chǔ)藏物質(zhì)含量中；構(gòu)建該啟動(dòng)子和相關(guān)基因的表達(dá)載 體，調(diào)控淀粉、油脂或蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)，可能會(huì)影響花生及其它作物的產(chǎn)量；該啟動(dòng)子是一個(gè)時(shí)空特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，因此，該啟動(dòng)子的克隆對(duì)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域啟動(dòng)子的研究也具有重要意義。


圖1:擴(kuò)增的花生AhLEClA基因2739bp5,端上游序列擴(kuò)增的電泳圖，圖中M為T(mén)rans5K DNA Marker, LD、LE、LP和LS為不同基因組文庫(kù)擴(kuò)增結(jié)果，LP泳道箭頭所指為擴(kuò)增的目的啟動(dòng)子片段；由圖中結(jié)合實(shí)施例可知，擴(kuò)增得到的序列為2739bp，包括2625bp的啟動(dòng)子序列、82bp 非編碼區(qū)序列和32bp包括擴(kuò)增引物序列在內(nèi)的ORF區(qū)序列；圖2:花生AhLEClA基因啟動(dòng)子區(qū)域可能的順式作用元件；圖3:花生AhLEClA基因啟動(dòng)子序列與⑶S基因的融合表達(dá)載體的構(gòu)建流程圖；圖4:PCR檢測(cè)具不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)結(jié)構(gòu)部分轉(zhuǎn)基因擬南芥；圖中編號(hào)36為啟動(dòng)子大小105bp，37為354bp，38為617bp，39為721bp，40為935bp，41為1254bp，42為2228bp ;M均為DL2000DNA Marker，其條帶分子量大小自上而下分別為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp ；圖5:本發(fā)明所提供的2228bp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)基因擬南芥種子⑶S活性組織化學(xué)檢測(cè)圖；由圖可見(jiàn)授粉后10天的種子(上面8個(gè))在胚胎發(fā)育的位置染為藍(lán)色(箭頭所示)，而授粉后20天的種子(下面8個(gè))在任何部位均未檢測(cè)到GUS染色； 圖6為圖5的彩色示意圖；圖7:本發(fā)明所提供的2228bp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)基因擬南芥根、莖、葉和花⑶S活性組織化學(xué)檢測(cè)圖；圖中42-9為轉(zhuǎn)入2228bp啟動(dòng)子的基因株系號(hào)，CK-P為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性對(duì)照，CK-N為未轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照；由圖可見(jiàn)，無(wú)論根、莖、葉還是花僅有CK-P檢測(cè)到⑶S染色，42-9株系和CK-N不同材料的所有樣品均未檢測(cè)到藍(lán)色染色信號(hào)；
圖8為圖7的彩色示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施步驟是根據(jù)花生AhLEClA基因的基因組DNA序列用染色體步移的方法克隆得到該基因的啟動(dòng)子序列一啟動(dòng)子順式作用元件分析及功能預(yù)測(cè)一涉及帶有酶切位點(diǎn)Hind III和Nco I的引物從啟動(dòng)子DNA上擴(kuò)增得到不同長(zhǎng)度的目的啟動(dòng)子序列一用同樣的酶Hind III和Nco I酶切載體pCAMBIA3301 —目的片段連接到酶切的pCAMBIA3301載體上一含植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥一轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定和篩選純合體轉(zhuǎn)基因株系一GUS組織化學(xué)染色檢測(cè)GUS表達(dá)部位及強(qiáng)度，分析啟動(dòng)子功能。本實(shí)施例中的其他技術(shù)均采用已有技術(shù)。實(shí)施例1花生AhLEClA基因啟動(dòng)子的克隆1.1花生基因組DNA的提取用植物DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品)提供的方法提取花生幼葉的DNA，溶解于適量TE (pH8.0)緩沖液中。1.2花生AhLEClA基因啟動(dòng)子的克隆分別取2.g花生基因組DNA經(jīng)Dral、EcoRV、PvuI1、StuI內(nèi)切酶酶切、苯酚抽提純化后，溶解于20iU TE(pH7.5)緩沖液中。分別取4 ill酶切完全的DNA，按照BDGenome Walker Universal Kit 的要求連接上 Adaptor (序列:5' GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT 3'，如 Seq ID No: 5 所示)，構(gòu)建 4 個(gè)花生基因組 DNA 文庫(kù)(LD、LE、LP、LS)。根據(jù)已獲得的花生AhLEClA基因的基因組序列，設(shè)計(jì)該基因的2個(gè)嵌套的 3'端特異性引物 LEC1AGSP1-3 (5' `TGGGGATGGATAGAGAAACCAACGAGA 3'，如 Seq IDNo:6 所示)和 LEC1AGSP2-2 (5' TGATAACCGTGAAAGCCTCCTCCAGT 3'，如 Seq ID No:7 所示)。以 APl (5'端接頭引物:5' GTAATACGACTCACTATAGGGC3 '，如 Seq ID No:8 所示)和LEC1AGSP1-3為引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25iU，模板量為1^1，擴(kuò)增條件為:940C 25sec，72°C 3min，7 個(gè)循環(huán)；94°C 25sec，67°C 3min，32 個(gè)循環(huán)；最后 67°C繼續(xù)延伸7min。第二輪巢式PCR模板為I ill第一輪PCR產(chǎn)物10倍稀釋液，引物為5'端巢式接頭引物 AP2 (5' ACTATAGGGCACGCGTGGT 3'如 Seq ID No:9 所示)和 LEC1AGSP2-2，擴(kuò)增體系與第一輪 PCR 相同，擴(kuò)增條件 94°C 25sec，72°C 3min，5 個(gè)循環(huán)；94°C 25sec，67°C 3min，20 個(gè)循環(huán)；最后67 °C繼續(xù)延伸7min。1%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。挖取并回收第二輪PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，克隆到PEASY-T3載體中，白色重組克隆經(jīng)EcoRI酶切檢測(cè)，片段大小符合要求的克隆用ABI3730測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序。1.3RNA提取和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)確定用CTAB法提取不同發(fā)育時(shí)期種子的總RNA，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量和分光光度計(jì)定量后，等量混合儲(chǔ)存于_80°C冰箱備用。為防止RNA酶污染，研缽、研錘、藥匙均以180°C烘烤6h，所用塑料制品用0.1%的DEPC水浸泡，于室溫下過(guò)夜后，高溫滅菌處理。用Invitrogen公司GeneRacer Kit提供的方法和試劑，取5 ii g混合好的LH14種子總RNA，按照說(shuō)明書(shū)要求用堿性磷酸酶(CIP)將截?cái)嗟膍RNA或其他非mRNA5'端去磷酸化，然后將抽提純化并沉淀的全長(zhǎng)mRNA脫去帽子結(jié)構(gòu)，并連接上RNA接頭(GeneRacerRNA Oligo:5, CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA 3,，如 Seq ID No:10所示)；以此RNA為模板，用試劑盒提供的隨機(jī)引物和SurperScript III RT酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;最終將合成的cDNA克隆至載體pCR4_T0P0中，獲得LH14不同發(fā)育時(shí)期種子全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，用于隨后轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)擴(kuò)增。根據(jù)已獲得的花生AhLEClA基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)2個(gè)該基因的3'端特異性引物，引物序列為:TSS GSP1-15' TCTTTTGCGTCGTCGGAGATTTTAGC3'，如Seq ID No: 11所示，TSS GSP2與LEC1AGSP2-2相同。以構(gòu)建的cDNA文庫(kù)為模板，分別以 TSS GSPl-1 引物與 GeneRacer 5' Primer (5' CGACTGGAGCACGAGGACACTGA 3'，如Seq ID No: 12所示)進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，PCR體系參照BD Advantage 〗PCR Kit要求，擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性 2min ;94°C 30 sec, 72°C 30sec，5 個(gè)循環(huán)；94°C 30 sec, 70°C 30sec,5個(gè)循環(huán)；94°C 30 sec, 63°C 30sec,68°C 30sec，20-25個(gè)循環(huán)；最后 68°C繼續(xù)延伸 lOmin。第一輪PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，用緩沖液稀釋50倍，用于第二輪巢式PCR。取I Ul第一輪PCR產(chǎn)物，以 TSS GSP2 和 GeneRacerisV Nested PrimerC 5' GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA3'，如Seq ID No: 13所示)進(jìn)行第二輪PCR，擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性2min ;94°C 30 sec,65°C 30 sec, 68°C 10 sec，35個(gè)循環(huán)；最后68°C繼續(xù)延伸lOmin。1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。挖取并回收第二輪PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，克隆到PEASY-T3載體中，白色重組克隆經(jīng)EcoRI酶切檢測(cè)，片段大小符合要求的克隆用ABI3730測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序。1.4啟動(dòng)子序列分析應(yīng)用在線植物轉(zhuǎn)錄元件分析工具PLACEChttp: //www.dna.affrc.g0.1o/PLACE/)、PlantCARE (http://bioinformatics, psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)花生AhLEClB啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析。1.5不同長(zhǎng)度花生AhLEClA基因啟動(dòng)子片段的擴(kuò)增設(shè)計(jì)克隆不同長(zhǎng)度AhLEClA基因啟動(dòng)子所需的引物，引物Pl為3'端下游引物位于5' UTR區(qū)，序列如Seq ID No: 14所示；引物P2-P8為Y端上游引物，序列如Seq IDNo: 15-21所示。引物Pl中下劃線部分CCATGG為Nco I酶切位點(diǎn)，其余部分為5' UTR序列；引物P2-P8中下劃線部分AAGCTT為Hind III酶切位點(diǎn)，其余部分為啟動(dòng)子序列。利用引物Pl分別和P2-P8，以已克隆的含有AhLEClA基因2265bp啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為2228bp、1254bp、935bp、721bp、617bp、354bp和 105bp。PCR 擴(kuò)增體系為 20 ii 1:包括 10XPCR buffer 2u l，dNTP mixure(各 2.5mM)l y 1，上、下游引物各Iu 1，模板DNAliil，Taq酶0.25iU，加ddH20補(bǔ)足20iU。反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性 94°C 2min;變性 94°C 30 sec，退火 55°C 30 sec，延伸 72°C 30 sec_2min (根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度調(diào)整)，30個(gè)循環(huán)；最后72°C繼續(xù)延伸lOmin。擴(kuò)增結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的片段大小正確，回收目的片段，并測(cè)序驗(yàn)證序列正確。表1.AhLEClA基因啟動(dòng)子缺失分析引物
權(quán)利要求
1.一種花生LECl基因特異性啟動(dòng)子，其特征在于:其基因序列如Seq ID No:4所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性啟動(dòng)子，其特征在于:該啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)GUS基因在植物發(fā)育早期的種胚中特異表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性啟動(dòng)子，其特征在于:該啟動(dòng)子還包括含有如SeqIDNo:4所不基因序列的其他序列。
4.如權(quán)利要求所述花生LECl基因特異性啟動(dòng)子，在研究植物種子發(fā)育和儲(chǔ)藏物質(zhì)積累上的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求所述花生LECl基因特異性啟動(dòng)子，在提高種子中儲(chǔ)藏物質(zhì)和作物產(chǎn)量上的應(yīng) 用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，克隆獲得了一個(gè)新的花生LEC1基因的啟動(dòng)子，其基因序列如SeqIDNo:4所示，該啟動(dòng)子于種子特定發(fā)育階段驅(qū)動(dòng)基因在種胚或胚乳中特異表達(dá)。本發(fā)明構(gòu)建了該啟動(dòng)子及6個(gè)其5′端系列缺失的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥。最終證實(shí)包括5′端非翻譯區(qū)和其上游啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因特異地在發(fā)育早期的種胚中表達(dá)，這一啟動(dòng)子的克隆和缺失分析對(duì)于研究植物種子發(fā)育和儲(chǔ)藏物質(zhì)積累，提高種子中儲(chǔ)藏物質(zhì)如淀粉、脂肪及蛋白的含量具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/82GK103205427SQ20131008808
公開(kāi)日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月19日
發(fā)明者單雷, 唐桂英, 徐平麗, 柳展基, 陳營(yíng) 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心, 單雷