專利名稱：通過同時測量至少兩種不同分子標記物來提高檢測腫瘤及其前體階段時的臨床特異性的方法
通過同時測量至少兩種不同分子標記物來提高檢測腫瘤 及其前體階段時的臨床特異性的方法
本申請是申請?zhí)枮?1143708.1、申請日為2001年12月18曰《 發(fā)明專利申請的分案申請.
背景技術：
癌性疾病仍然是全球最常見的致死原因之一.臨床上存在對癌癥 和癌前期的早期識別和特定檢測方法的需求.此外，腫瘤的更詳盡的 特征描述至關重要，以便得出有關治療和預后的推論.這是有效的， 因為不同的癌癥亞型對所施用的治療措施產(chǎn)生相異的反應.因此，譬 如，當被懷疑為乳腺癌時，會更加頻繁地求助于對分子標記物的免疫 組織化學染色，例如細胞角蛋白、雌激素受體、her2/neu、 K167或 p53(例如Leek等，1994, Br. J. Cancer, 69, 135-139; Mokbel 等，1999， Am. L Surgery, 178, 69-72; Reiner等，1990, Cancer, Res. ， 50, 7057-7061).而這些染色常常通過乳腺活組織檢查進行， 通過針穿刺(FNA-細針吸活檢)進行染色也日益增多.分子標記物也 用于有關判定腫瘤是否是原發(fā)性腫瘤或轉移中.例如，對原發(fā)性感染 器官特異性的標記物的表達可以有助于這種筌定.
近年來，業(yè)已養(yǎng)定了大量的基罔，作為突變的結果，它們以變化
了的方式表達其蛋白，罔而在癌的發(fā)生中起了作用.作為診斷標記
物，可以在血清和細胞水平檢測到相應的蛋白質.這些蛋白質參與細
胞中多樣性的生理調節(jié)過程，例如生長調控(增殖基因，例如Ki67和
mcm-5:致癌基因和腫瘤抑制基因，例如p16、 EGF受體、her2/neu
和mdm-2)、細胞消亡(自然細胞死亡，例如p53和bcl-2)、 DNA修復
(msh-l)和細胞粘著(E-鈣粘著蛋白、p-連環(huán)蛋白和APC).譬如，試
驗對抗上述蛋白質的特異性抗體的免疫組織化學和免疫細胞化學檢
測方法適合這樣的檢測(van Noorden, 1986, Immunocytochemistry,
Modern Methods and Applications, 2nd edition, Wright, Bristol, 26-53).
已經(jīng)多次證實單一標記物不足以獲得有關識別病變細胞的特異 性，因為它存在于一些健康細胞中.這所基于的事實是，這些標記物 可以是參與健康細胞中的生理調節(jié)過程且只被過分高度表達的蛋白 質，所述的過分髙度表達是病變細胞的一個指征.Williams等(1998,
PNAS, 95, H932-H937〉描述了 DNA復制標記物nc旭-5，其檢測出子 宮頸涂片的28種試驗損傷/腫瘤(n-58),但在這28種正常涂片中也 提供2種錯誤的陽性染色.Sano等(Pathology Intl. ， 1998, 48, 580-585)報導了標記物pl6在15種正常宮頸活組織中的3種非特異 染色.雖然事實上可以在子宮勁的100%的全部損傷和腫瘤中檢測到 HPV,但也可以在許多正常子宮頸上皮中檢測到HPV;即，雖然檢測 HPV的試驗高度敏感，但它只具有低的特異性(例如Cuzick, 2000, JAMA. 283, 108-109).
在病理學中，人們對檢測生物樣本中多種標記物日益感興趣.一 方面，這能夠獲得更多有關檢測和定性病變細胞或組織區(qū)域的可利用 信息；另一方面，可以識別出各個標記物的非特異染色是什么并且由 此避免不正確結論.傳統(tǒng)上，出于這種肖的制備了可利用活組織的連 續(xù)切片或機體樣本的多種標本(例如宮頸涂片在罔定劑中)，隨后其分 別用特定標記物染色.這種方法存在若干缺點患者樣本材料的高度
耗費，而樣本材料通常是有限的；染色試劑的高度消耗；需要大量的 時間且成本較高；而且也不可能在細胞或組織樣本的特定區(qū)域中同時 清晰地探測出兩種或多種標記物.雖然文獻中業(yè)已報導了在生物樣本
中兩種或多種不同生物標記物的同時檢測(DAKO,免疫蘇雙染色法實 踐指南；Gomez等，Eur J. Histochem., 1997. 41, 255-259),但 該途徑至今無法應用到常規(guī)診斷中，罔為這些方案在任何程度上都無 法標準化，Terhavauta等人(Cytopathology, 1994, 5， 282-293) 采用p53和Ki67在取自子官頸損傷的活組織中的雙重染色，并且在 一個細胞的某些情況中可以由HPV陽性和HPV陰性損傷衍生的基細胞 和副基細胞中檢測到這兩種標記物.然而，同時，作者沒有利用由上 述雙重染色所獲得的信息，通過合并所得的結果，來描繪出有關這個 樣本中腫瘤細胞存在的可靠結論.完全沒有任何從自動檢測腫瘤區(qū)域 的立場出發(fā)利用染色信息的嘗試.而且，除了這種聯(lián)合之外，沒有提 及任何其它可能有利于腫瘤區(qū)域的筌定和定性的標記物聯(lián)合物.
其它在肺的腫瘤活組織上進行的雙重染色在Kraeft等(Clin Cancer Res. 2000, 6, 434-442〉和Oshika等(Mod Pathol, 1998, 11, 1059-1063)中提及.這些參考文獻中提及的抗體聯(lián)合物完全不同于本 發(fā)明所基于的聯(lián)合物.而且，上述兩篇公開物另外要求評估活組織染
色的病理學家作出診斷.這種途徑在概念上與方法的自動化毫不相 容，由此迄今無法加以考慮.
Rao 等 (1998, Cancer Epidemiology, Biomarkers and Evolution. 7, 1027-1033)描述了多種腫瘤相關性標記物(DNA含 量、G-肌動蛋白和p53)在取自乳腺組織的針穿刺材料(FNA,細針吸活 檢)中的多重染色.他們解釋了其結果與使用多種標記物獲得比由單 獨標記物的觀察更加高的臨床特異性的影響，并此在乳腺癌的早期識 別中發(fā)揮重要作用，作者所指出的多重染色僅限于由乳腺組織獲得的 針穿刺材料，因為材料的不同特性，無法應用于其它生物材料(即活 組織和子宮頸涂片).而且，所述的標記物聯(lián)合物不同于本發(fā)明所提 及的聯(lián)合物.他們不曾嘗試從腫瘤區(qū)域的檢測自動化的立場上利用這 些染色信息.
現(xiàn)有臨床腫瘤診斷的進一步改進在于兩個方面， 一方面是樣本制
備和染色的自動化，另一方面是自動困像分析，自動困像分析中包括 診斷的確立.除了節(jié)省時間且需要較少的人力以外，這條途徑也可以 更加客觀，并由此使診斷更加統(tǒng)一.用熒光或用顯色染料對腫瘤細胞 或其前體中的生物標記物的染色能夠做到使信號定量并由此以自動 方式讀取它們.能夠以自動方式實現(xiàn)染色方案的體系業(yè)已存在.然 而，困象分析沒有被用于獲得自動化診斷(LeNeel等，Clin Chim Acta, 1998, 278, 185-192).最先進的體系包括利用形態(tài)學困象信息自動 化檢測子宮頸涂片中的腫瘤細胞及其前體(Sawaya等，Clinical Obstetrics and Gynecology, 1999, 42， 922-938:Stoler, 2000, Mod. Pathol, 13, 275-284).
除了利用PAPNET體系自動化形態(tài)檢測子宮頸涂片中的異常細胞 以外，Boon等(1995, Diagn. Cytopathol, 13, 423-428)也使用Ki67 抗體對增殖細胞的免疫組織化學染色.然而，這種單一分子標記物的 使用無法進行任何明確地區(qū)分良性增殖細胞和致癌細胞.但是，這些
作者不曽采用至少兩種分子標記物的同時檢測來鑒定異常細胞.
作者為Boon等的專利(US- 5544650〉描述了采用免疫化學標記 物的染色如何有利子樣本中增殖(致癌性和非致癌性〉鈿胞的自動化 檢測，并且如何在半自動過程中，監(jiān)控病理學家/細胞學家進而可以 判斷被染色細胞是否真的為致癌細胞.然而，其中沒有提及任何能夠
以自動化方式檢測異?；蚍瘟黾毎奶禺愋钥贵w的聯(lián)合物.
專利US - 6005M6(其作者為McGlynn和Akkapeddi)提供了同時 檢測機體樣本中多種熒光標記的標記物的裝罝和方法的詳細描述，包 括出于鑒定癌細胞的目的裝置和方法，但并沒有涉及到癌癥診斷的具 體應用中或提及適當?shù)臉擞浳锫?lián)合物可以產(chǎn)生較高的特異性.
已知Ampersand Medical Systems Group (www, ampersandmedical. com) 正在開發(fā)一種新的用于宮頸涂片的篩選系統(tǒng)(InPath〉，除了公司內部 所擁有的樣品標本以外，還包括使用熒光進行非特異生物標記物的檢 測.
發(fā)明內容
發(fā)明目的
本發(fā)明描述了一種通過使用規(guī)定的標記物聯(lián)合物可以用于測定 病變細胞、優(yōu)選癌細胞及其前體的自動化方法.
根據(jù)本發(fā)明，這可以通過本專利權利要求書中所詳述的主題來獲得.
概述/目的實現(xiàn)
本發(fā)明基于申請人的發(fā)現(xiàn)是通過細胞或組織樣本中至少兩種特 異性分子標記物(也就是基罔表達中與疾病有關的變化〉的同時檢測 可以提高對病變細胞、優(yōu)選癌及其前體的檢測的特異性；和一種更加 特異的檢測方法；和一種此后可以自動化的方法；該方法是在檢測多 種標記物并合并和確認信號的基礎上得到的. 發(fā)明詳迷
本發(fā)明涉及分子標記物，其在單獨檢測時無法獲得有關識別病變 細胞或組織的足夠特異性，因為它們也以相似或相異的量存在于某些 未病變的生物材料中.這是基于這些標記物可以是參與健康細胞中生 理調節(jié)過程的蛋白質的事實.此外，由于抗體以非特異方式的交叉反 應，分子標記物的檢測可能不清晰，這表現(xiàn)在未含有分子標記物的生 物材料的顆粒被染色.本發(fā)明人已經(jīng)觀察到，通過同時檢測細胞中或 生物材料的組成區(qū)域內(例如組織切片的狹窄規(guī)定的區(qū)域內〉至少兩 種標記物，可以彌補羊一標記物栓測的特異牲缺陷，從而在栓測異常 細胞或組織節(jié)片時確保較高水平的特異性.所以，當診斷生物樣本時 通過聯(lián)合多種標記物可以獲得比使用單一標記物更高的信息價值.
標記物聯(lián)合物包含屬于至少一種下列類型的基罔的改變表達的
顯色致癌基因、腫瘤抑制基因、細胞凋亡基因、增殖基因、修復基 罔和病毒基因；例如，通過分子標記物her2/neu、 p16、 p53、 Ki67、 MN、 mdB-2、 bcl-2和EGF受體的聯(lián)合物所示.特別優(yōu)逸下列聯(lián)合物 her2/neu和Ki67、 her2/neu和p53、 he:r2/neu和bcl-2、 her2/neu 和pl6、 bcl-2和Ki67、 bcl-2和p53、 bcl-2和p16、 p16和p53、 p16和Ki67.
根據(jù)本發(fā)明，申請人的發(fā)現(xiàn)可以應用在疾病相關性細胞或組織節(jié) 片的早期診斷的方法中，所迷的方法包含以檢測癌及其前體為目標檢 測上述分子標記物的聯(lián)合物，而且另外如果必要以自動方式檢測轉移 的起源.通過下面的方法可以達到腫瘤細胞的自動化和特異性檢測 首先，細胞或機體樣本的限定區(qū)域內必須存在這兩種信號，其次，兩 種標記物所產(chǎn)生信號必須在各種情況中高于或低于各自的規(guī)定強度 或閾值.當采用這兩種標準時，可以排除健康細胞，例如那些表達一 種標記物高于設定閾的健康細胞，或表現(xiàn)兩種標記物在各種情況中低 于所規(guī)定的信號強度的健康細胞.
術語"分子標記物"包括細胞中的分子變化，特別是基因表達的變 化，已經(jīng)觀察到其與改變了的或病理性的細胞構造有關.檢測分子標 記物的方法包含任何可以測定標記物的數(shù)量或質量的方法，優(yōu)選在蛋 白質水平上測定的方法，
利用抗體或其他特異性結合的蛋白質(例如抗cullins〉適合在蛋 白質水平進行檢測，其允許包括顯色和/或熒光檢測的后續(xù)細胞化學 或組織化學檢測.
短語"至少兩種特異性分子標記物的同時檢測"包括使機體樣本 中至少兩種基因表達顯色的方法，特別是機體樣本的單一標本中，由 此可以觀察到彼此有關的基因表達.就此，不僅至少兩種信號的存 在，而且一種或多種附加信號的存在或不存在，其都是可能組合的信 息值.除了腫瘤特異性以外，這種進一步的信息可以包含有關轉移的 起源的結論.因此，以相對空間鄰近檢測被測的標記物非常重要，特 別是在一種細胞中或在樣本的狹窄規(guī)定區(qū)城內，如組織切片的區(qū)城 內.
短語"合并和確認信號"包括將至少兩項的信息連接，所述的信
息是在檢測機體樣本中的至少兩種標記物的基礎上獲得.此外，通過 規(guī)定標記物強度的閾值可以特異性地將健康細胞與患病細胞區(qū)分 開.
短語"細胞或組織樣本"包括由機體樣本分離的細胞，例如涂片、 唾液、器官穿剌液、活組織、分泌物、腦脊號液、膽汁、血液、淋巴
液、尿和糞便；或從器官取得的組織，例如乳腺、肺、腸、皮膚、子 宮頸、前列腺和胃.因此，組織樣本包含機能相關細胞或相鄰細胞的 區(qū)域.
短語"病變細胞"包括癌及其前體，優(yōu)選呼吸、生殖和胃碭道的 癌；和皮膚、乳腺和血管系統(tǒng)的腫瘤，而且特別是乳腺癌和子宮頸癌 及其前體，例如子宮頭上皮內瘤形成(CIN I-III)和原發(fā)癌.
術語"自動化檢測，，包括其中全部或只在組成步驟中代替人工的 手工操作的方法，并且特別是用于檢測過程的步槺中或相關后繼文件 或信息的處理中.這包括樣本制備、樣本染色、樣本讀取和信息處理 的步驤.因此，通過吸收測量、反射測量或熒光測量的方式可以實現(xiàn) 檢測，熒光測量方法包括所有方法如熒光顯徵鏡或FACS(流通式血細 胞計數(shù)器)分析.
術語"診斷專家系統(tǒng)，，包括將困象信息轉化為建議性診斷的計算 機軟件.基于軟件中存在的參數(shù)，或基于軟件可以存取的外部信息， 這種專家系統(tǒng)能夠將全部或部分的可利用信息歸納為建議性診斷.如 果需要其它參數(shù)來確立建議性診斷，軟件可以提出收集這些參數(shù)，或 通過鏈接到適當分析設備上、利用反射性算法自動地訪問這個系統(tǒng).
術語"擴增系統(tǒng)"包括生物化學方法，其能夠增強信號強度從而產(chǎn) 生更優(yōu)越的適合特異性檢測分子標記物的信號/噪音比.這通常是利 用附加抗體和/或醃檢測反應來獲得.
可以利用本發(fā)明特異性地檢測病變細胞，例如癌及其前體，并且 用于測定轉移的起源.本發(fā)明還涉及實施本發(fā)明方法的試劑盒，這種 試劑盒含有下列組成
(a) 檢測至少兩種分子標記物的試劑，也就是標記和/或未標記的 抗her2/neu, p16、 pS3、 Ki67、 MN、 mda-2、 bcl-2和EGF受體的抗 體.
(b) 常規(guī)輔劑，例如緩沖刑、栽體、信號擴增物質、染色劑等. (C)制備和染色樣本以及檢測信號的自動化方法. (d)作為對照反應的細胞系的染色方案和試劑.
上述評價適于所述試劑盒的各個組分.所述試劑盒的單一組分或 多種組分還可以以改變了的形式使用，
本發(fā)明可以手動或以部分或全部自動化的方法來檢測病變細 胞，例如癌及其前體.由于按照本發(fā)明并由同時檢測至少兩種分子標 記物獲得的結果未經(jīng)過任何主觀評估，而且相反地，卻有利于生物材 料中病理性變化的客觀的、自動化檢測，所以形態(tài)學的發(fā)現(xiàn)可以用客 觀參數(shù)補充，也可以以"反射性試驗"的形式.由于所述的方法可以 快速且以自動化方式操作，所以其適合大規(guī)模的篩選方法，其在成本 和人力上均很經(jīng)濟.除此以外，兩種以上標記物的組合染色使診斷不 同的病理性變化并測定轉移的起源成為可能.
罔此，本發(fā)明給疾病的現(xiàn)代診斷帶來了重大貢獻.具體實施方式
實施例
下文將通過舉例的方式提供實施上述發(fā)明的方案.這些實施例具
體化了精確條件，其在目前的情況中預先調整為使用Ventana自動染 色儀NEXES的結果.但這不以任何方式改變不同參數(shù)可以改變的事 實，也就是可以與其它設備相匹配的事實，所述的參數(shù)例如是培養(yǎng)和 洗滌溫度、培養(yǎng)和洗滌時間以及抗體和其它試劑的濃度.此處所述的 擴增系統(tǒng)同樣可以被忽略，或者可以增加新的，這取決于各自的抗體 或DNA探針.
使用特異性抗體并采用Ventana提供的Nexes自動免疫染色儀同時檢 測活組織中兩種分子標記物的試驗的描述
首先從活組織制備4 - 5jiin厚的石蠟切片(Leica提供的RM2155 切片機〉，將其罔定并包埋在石蠟中，切片在37X:下干燥過夜.為了 避免切片在有關后續(xù)染色中漂浮，使用用硅坑涂層的顯微鏡栽玻片. 為了染色，將石蠟切片在二甲笨中脫蠟2 x 15分鐘并且隨后穿過一 組濃度降低的醇(100%， 90%, 70%,各種情況中2 x 5分鐘〉，以 便再次洗滌除去二甲笨.
用福爾馬林固定導致搭交聯(lián)鍵的形成，其掩蔽了抗原并由此使它 們無法被抗體利用.所以，需要進一步預處理.抗原在lOmM檸檬酸
緩沖液，pH 6中在600W徵波中解蔽30分鐘.
經(jīng)微波預處理之后，在Nexes(Ventana Medical Systems)自動 免疫染色儀中進行免疫組織化學染色.由Ventana Medical Systems 分別或以試劑盒的形式得到出初級抗體和血清之外的所有試劑.培養(yǎng) 全部是在37C下進行.該自動染色儀在每次培養(yǎng)之后用下迷試劑自動
洗條《
首先，內源性過氣化物踩用試刑盒中所含的"抑制劑"滅活4分 鐘.任何可能的非特有結合位點隨后用1.596山羊血清(得自Vector) 封阻10分鐘.此后將切片用笫一單克隆抗體(her2/neu(克隆3B5〉， 得自Oncogene Scinece/BAYER, 2. 5ng/ml，存在于Ventana抗體稀 釋緩沖液中)培養(yǎng)30分鐘.
此后使用一種增強試劑盒來獲得更加強化的染色結果.這種試劑 盒由兔抗小鼠免疫球蛋白和小鼠抗兔免疫球蛋白組成，其中的兔抗小 鼠免疫球蛋白先與結合的初級抗體反應，而且所迷的小鼠抗兔免疫球 蛋白依次與先前的兔抗小鼠免疫球蛋白結合.培養(yǎng)時間在各種情況中 為8分鐘.使用的下一步試劑是"多聯(lián)(MultiLink〉"抗體，其同樣 培養(yǎng)8分鐘，所述的"多聯(lián)"抗體能夠對抗小鼠和兔并且與生物素偶 聯(lián).這種抗體現(xiàn)在將結合全部三種先前培養(yǎng)的抗體并且大大提高了生 物素在初級抗體的反應位點處的量.下一步采用的試劑是抗生蛋白鏈 菌素-HRP(辣根過氧化物酶)，其在8分鐘內加入并且與生物素結合. DAB(二氨基聯(lián)苯胺)和作為該過氣化物酶底物的H202的加入進行檢 測，同時這種底物被轉化為褐色沉淀.
與上迷方法準確對應的第二種標記物的檢測是從用1.5%山羊血 清封阻開始并且將第二種特異性初級抗體(p53，克隆DOl，得自 Oncogene Science/BAYER, 30叫/鵬1,存在于Ventana抗體稀幹緩沖 液中)培養(yǎng)30分鐘，結束時，用抗生蛋白鏈菌素-ALP(威性磷酸蘇) 偶聯(lián)物代替抗生蛋白鏈菌素-冊P偶聯(lián)物.培養(yǎng)后，內源性威性磷酸 酶用左旋咪唑+ MgClz封阻.同時還加入ALP底物(堅牢紅和萘酚〉. 此后，核用蘇木精對比染色2分鐘，進而切片在"藍色試劑"中染色 2分鐘.果后，顯徵鏡我玻片用MoviolTM(Hoechest〉夜j1. 自動檢測組織樣本中異常細胞的試驗的描述，所述的細胞已通過同時 檢測兩種分子標記物染色
其中至少兩種分子標記物已經(jīng)按照上迷方法用抗體檢測的活組 織用一個熒光顯徵鏡分析，所述的熒光顯徵鏡帶有一 +可驅動的交叉
栽物臺，栽物臺至多可栽8個顯微鏡栽玻片(Olympus AX70,帶有 肌lticontrol box 2000-3和"Modul Stage，，aimlySIS驅動軟件)， 和Soft Imaging Systems GmbH(SIS)提供的analySIS3. 0軟件的升 級版，其作為"Grabbit Dual Pro"SIS軟件包包含附加模塊，特別是 FFT(-"快速付里葉變換")模塊、和MIA(-"多重困象校準(Multiple Image Alignment)")模塊和C模塊.用高分辦黑白(MV2 Slo霄Scan Camera, 12位，得自SIS)和彩色(DXC- 950P 3CCD芯片，得自Sony) 照相機記錄田象.聯(lián)用后，這些系統(tǒng)適于16位Grauton困象分析并 且適于RGB中彩色困象分析和HSI彩色空間，最離可達24位困象深 度.
校準可驅動交叉栽物臺(analySIS Module Stage〉后，通過規(guī)定 "自動"菜單(analysis模塊粒)中8個連續(xù)栽物臺路徑(stage path) 可以相對于"邏輯零點"記錄最多8個顯徵鏡栽玻片的全部位置.生物 樣本的總區(qū)域以綜合方式分解為獨立區(qū)域，所述的獨立區(qū)城大小為 158,7pm x 119.6pm,其對應于用顯徵鏡部件放大的放大率為40倍 的相片的困象扇形區(qū).各生物樣本通過一個栽物臺路徑分析.各個栽 物臺路徑在水平方向上以曲折方式描繪出一系列的栽物臺路徑位 置，由此各個顯徵鏡玻片位置上的生物樣本的各個區(qū)城是以鄰接方式 而不是重疊方式、通過一個栽物臺珞徑位罝進行記錄.規(guī)定相應的行 數(shù)和列數(shù).在"自動"菜單中輸入8個栽物臺路徑，使其能夠以自動化 方式分析位于工作臺上的所有標本，
各個栽物臺珞徑位置上的標本染色在透射光中成象，并且困像信 息在"操作"菜單中"色彩匹配"下"與PGB比較" 這確保了后繼 的"測量"可以在"自動"菜單中進行.為了測量，通過"設定色彩 岡值"的方式規(guī)定"田像"茱單中最多8個不同混合色的閾值并用"象 素值/新"測定象素值.利用"測量"菜單中的"相分析"方式，借 助于色彩閾值測出各個栽物臺路徑位置的獨立相片，所迷的色彩閾值 業(yè)已被定義，而且特定混合色的區(qū)城作為面積定童顯示在Excel數(shù)振 文件中，當同時檢測兩個標記物時，檢測反應的顏色，即"褐色"(DAB) 和"紅色"(堅牢紅)，以及其在樣本區(qū)域中的混合("紅-褐")特別令
人感興趣.因此，對于各個獨立栽物臺路徑(-樣本)可以得到一個
Excel表，而且各列表示特定混合色的面積.Excel表的行相應于單 一樣本區(qū)域的獨立相片(-栽物臺路徑位置).
利用宏，將行(-栽物臺路徑位置〉中的各個值(-混合色的測量 面積)在各種情況中與規(guī)定的閾值對比，所迷的各列或混合色的閾值 已經(jīng)預先測定.隨后宏對獨立值進行確認，如果行中的一個以上的獨 立值大于各列中規(guī)定的混合色閾值，則該樣本被定性為患病.
可以保存相應的困像位置，使它們能夠為后續(xù)的視覺評估所利 用."自動"茱單中的"協(xié)議列表實用程序"記錄卡可以用于自動保 存田像和各栽物臺路徑位置的其它數(shù)據(jù).
盡管這些步碟可以手動進行，但它們也可以以自動化方式、通過
"附加"菜單中"記錄宏"下創(chuàng)建的宏來進行，并且隨后在"自動"菜 單中檢索它們.最后，特定混合色的定量評估以面積值的形式(-生 物樣本的面積，其作為用分子標記物染色的結果精確表現(xiàn)出規(guī)定的二
級色彩)獲得.以這種方式，通過定量分析確認的混合色可以獲得生 物樣本的診斷性結論.
權利要求
1.用于鑒定癌細胞及其前體的自動化體外方法的用途，其特征在于同時檢測細胞或組織樣本中至少兩種標記物，并且合并和匯總信號強度，并且至少一個分子標記物選自her2/neu、p16、p53、Ki67、MN、mdm-2、bc1-2和EGF受體。
2. 按照權利要求1的用途，其特征在于標記物的聯(lián)合物是 her2/neu和Ki67、 her2/neu和p53、 her2/neu和bcl-2、 her2/neu 和MN、 her2/neu和mdm-2、 her2/neu和EGF受體、bc卜2和Ki67、 bcl-2和MN、 bcl-2和njdm-2、 bcl-2和EGF受體、her2/neu和bcl-2、 p53和bcl-2、 p53和MN、 p53和mdm-2、 p53和EGF受體、p16和p53、 p16和MN、 p16和邁dm-2、 p16和EGF受體、p16和Ki67、 p16和 her2/neu、 p16和bcl-2、 MN和mdm-2、 MN和EGF受體、mdm-2和EGF 受體.
3. 按照權利要求l的用途，其特征在于所述的自動化信息處理與 一個診斷專家系統(tǒng)連接，該系統(tǒng)將困像信息歸納為建議性診斷.
4. 按照權利要求1至3中任何一項的用途，其特征在于通過分析 組織樣本的組成區(qū)域內的顯色反應或熒光信號定量檢測出所述的分子 標記物，其中將二級色彩或各個色彩的空間接近在使用至少兩種標記 物提供附加信息時與單一染色比較.
5. 按照權利要求l-4中任何一項的用途，其特征在于檢測乳腺、肺、子宮頸、結煬、皮膚和前列腺的腫瘤.
6. 按照權利要求1-5中任何一項的用途，其特征在于它包括反 射性試驗.
7. 用于鑒定癌細胞及其前體的自動化體外方法，其特征在于同時 檢測細胞或組織樣本中至少兩種標記物，并且合并和匯總信號強度， 并且至少一個分子標記物選自her2/neu、 p16、 p53、 Ki67、 MN、 mdm-2、 bcl-2和EGF受體.
8. 按照權利要求7的自動化體外方法，其特征在于標記物的聯(lián)合 物是her2/neu和Ki67、 her2/neu和p53、 her2/neu和bcl-2、 her2/neu和MN、 her2/neu和mdm-2、 her2/neu和EGF受體、bcl-2 和Ki67、 bc卜2和MN、 bc卜2和mdm-2、 bc卜2和EGF受體、her2/neu 和bcl-2、 p53和bcl-2、 p53和MN、 p53和mdm-2、 p53和EGF受體、pl6和p53、 pl6和MN、 pl6和md邁-2、 p16和EGF受體、pl6和U67、 p16和her2/neu、 p16和bc卜2、 MN和mdm-2、 MN和EGF受體、幽-2 和EGF受體.
9. 按照權利要求7的方法，其特征在于所述的自動化信息處理與一個診斷專家系統(tǒng)連接，該系統(tǒng)將困像信息歸納為建議性診斷.
10. 按照權利要求7至9中任何一項的方法，其特征在于通過分 析組織樣本的組成區(qū)域內的顯色反應或熒光信號定量檢測出所述的分 子標記物，其中將二級色彩或各個色彩的空間接近在使用至少兩種標 記物提供附加信息時與單一染色比較.
11. 按照權利要求7-10中任何一項的方法，其特征在于檢測乳 腺、肺、子宮頭、結腸、皮趺和前列腺的腫瘤.
12. 按照權利要求7-11中任何一項的方法，其特征在于它包括 反射性試驗，
13. 用于實施權利要求7-12中任何一項的方法的試驗試刑盒， 其中含有所有必要的試劑.
全文摘要
本發(fā)明涉及一種改進病變細胞的診斷的自動化方法，所述的標記物在與疾病相關的基因表達中顯示出變化，該方法通過應用抗體和確認信號強度的聯(lián)合同時使細胞或組織樣本的組成區(qū)域中的至少兩種不同分子標記物染色。
文檔編號G01N21/64GK101105496SQ20071014265
公開日2008年1月16日 申請日期2001年12月18日 優(yōu)先權日2000年12月18日
發(fā)明者B·舍珀, G·亨尼格, K·波曼, R·維爾茨 申請人:拜爾公司