與芝麻黑色種皮基因緊密連鎖的ssr分子標記及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了與芝麻黑色種皮基因緊密連鎖的SSR分子標記及應(yīng)用。一個與芝麻黑色種皮基因SiPPO緊密連鎖的SSR分子標記，命名為ZMM4056，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。SSR分子標記ZMM4056引物，引物序列為：ZMM4056F：5’?GCAGAAGGGTCAATATCGGA?3’ZMM4056R：5’?ATCCAAACCCCAGAAAATCC?3’。另一個芝麻黑色種皮基因SiPPO緊密連鎖的SSR分子標記，命名為ZMM4067，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。SSR分子標記ZMM4067引物，引物序列為：ZMM4067F：5’?GCTTAAACTTGGTTGTCGGG?3’ZMM4067R：5’?AAACCCTATCATTTCTTTGCCA?3’自然群體驗證表明這兩個分子標記ZZM4056和ZZM6067可以有效篩選出黑芝麻和白芝麻，應(yīng)用于黑芝麻分子標記輔助選擇育種。
【專利說明】
與芝麻黑色種皮基因緊密連鎖的SSR分子標記及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子標記領(lǐng)域，具體涉及與芝麻黑色種皮基因緊密連鎖的SSR分子標 記及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 芝麻（Sesamum indicum L.)隸屬于胡麻科胡麻屬，是一種古老的油料作物，栽培 歷史在5000年以上。目前，廣泛分布在南煒40度至北煒45度之間，集中于亞洲和非洲的熱 帶、亞熱帶地區(qū)。它作為一種營養(yǎng)豐富、功能性強、保健效果好的貴重油料深受人們喜愛。芝 麻油不飽和脂肪酸含量高達85%，富含抗氧化、抗癌、降血脂的芝麻素，被譽為"油料皇后"。
[0003] 芝麻種皮顏色主要是白色和黑色，白芝麻含油量高適合油用，黑芝麻含油量稍低， 適合食用。黑芝麻除了含有大量的脂肪外，還含有大量有益于人體健康的黑色素、蛋白質(zhì)、 氨基酸、維生素、微量元素和芝麻酚等，具有較高的營養(yǎng)保健功效和藥用價值。因此，闡述芝 麻種皮顏色的遺傳基礎(chǔ)和分子機理有利于黑芝麻品種的選育。
[0004] 連鎖分析主要是基于基因數(shù)據(jù)、表型數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計學(xué)的方法去判斷感興趣的基因 位點與已知的標記位點間的相對位置，重組率是連鎖分析的重要參數(shù)。常規(guī)連鎖分析群體 是運用有限親本的人工控制授粉群體，因此其經(jīng)過有限次數(shù)的重組，通?；谟邢抻H本，其 等位基因的個數(shù)也有限。關(guān)聯(lián)分析是基于自然變異群體，利用連鎖不平衡規(guī)律來研究遺傳 變異與目標性狀相關(guān)的研究方法，與傳統(tǒng)QTL定位相比，關(guān)聯(lián)分析不需要構(gòu)建作圖群體、廣 度大、精度高、能檢測到同一位點多個等位基因。但由于群體背景復(fù)雜，存在亞群結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致 易產(chǎn)生假陽性，而且自然群體的連鎖衰減較快，因此在群體里想找到足夠的變異，需要高密 度的分子標記。關(guān)聯(lián)分析結(jié)合連鎖分析，可以發(fā)揮兩者的優(yōu)勢，提高定位中的陽性率及精 度，提高復(fù)雜數(shù)量性狀的挖掘效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的在于提供與芝麻黑色種皮基因 SiPPO緊密連鎖的SSR分子標記。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的在于提供與芝麻黑色種皮基因 SiPPO緊密連鎖的SSR分子標 記的引物。
[0007] 本發(fā)明的再一個發(fā)明目的在于提供與芝麻黑色種皮基因 SiPPO緊密連鎖的SSR分 子標記的引物的應(yīng)用。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0009] 一個與芝麻黑色種皮基因 SiPPO緊密連鎖的SSR分子標記，命名為ZMM4056,其核苷 酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0010] 芝麻黑色種皮基因 SiPPO緊密連鎖的SSR分子標記ZMM4056引物，引物序列為：
[0011] ZMM4056F:5 '-GCAGAAGGGTCAATATCGGA-3，
[0012] ZMM4056R:5 '-ATCCAAACCCCAGAAAATCC-3 '
[0013] 一個與芝麻黑色種皮基因 SiPPO緊密連鎖的SSR分子標記，命名為ZMM4067,其核苷 酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0014] 芝麻黑色種皮基因 SiPPO緊密連鎖的SSR分子標記ZMM4067引物，引物序列為：
[0015] ZMM4067F:5 '-GCTTAAACTTGGTTGTCGGG-3 '
[0016] ZMM4067R:5 '-AAACCCTATCATTTCTTTGCCA-3 '
[0017]與芝麻黑色種皮基因 SiPPO緊密連鎖的SSR分子標記鑒定方法，其特征在于：用 ZMM4056擴增芝麻葉片總DNA，其中黑色種皮芝麻品種DNA的擴增片段大小為266bp，白色種 皮芝麻品種DNA擴增片段大小為258bp。
[0018] 與芝麻黑色種皮基因 SiPPO緊密連鎖的SSR分子標記鑒定方法，其特征在于：用 ZMM4067擴增芝麻葉片總DNA，其中黑色種皮芝麻品種DNA的擴增片段大小為144bp，白色種 皮芝麻品種DNA擴增片段大小為136bp。
[0019] 一種與芝麻黑色種皮基因 SiPPO緊密連鎖的SSR分子標記的篩選獲得方法，包括如 下步驟：
[0020] (1)從國家芝麻中期庫保存的7910份國內(nèi)外資源中根據(jù)產(chǎn)量相關(guān)性狀的表型、地 理來源和遺傳多樣性檢測結(jié)果，采取逐級取樣策略，選取了705份芝麻材料進行重測序分 析；
[0021] (2)利用Illumina Hiseq2500測序平臺，用2X76雙末端測序法對705份芝麻材料 進行低覆蓋度的全基因組重測序，獲得了 2.6倍覆蓋的基因組序列；
[0022] (3)結(jié)合種質(zhì)資源群體中的種皮顏色數(shù)據(jù)、基因型數(shù)據(jù)和群體結(jié)構(gòu)，采用EMMAX軟 件包和Peal程序?qū)χヂ橄嚓P(guān)性狀進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在Ρ=10-129水平檢測到1個位于4 號連鎖群上11607514的位置與芝麻種皮顏色顯著關(guān)聯(lián)的標記位點，解釋67%的表型變異； [0023] (4)利用芝麻黑色種皮品種614為父本，芝麻白色種皮品種610為母本進行雜交，自 交數(shù)代后獲得F6代分離群體，即重組自交系(RIL)群體；
[0024] (5)根據(jù)芝麻(http: //ocri-genomics · org/Sinbase/index · html)基因組序列在 該SNP位點附近開發(fā)80對SSR引物，在步驟(4)構(gòu)建的重組自交系(RIL)群體中進行基因型分 析；
[0025] (6)采用CTAB法提取步驟(4)構(gòu)建的芝麻RIL群體的葉片總DNA;
[0026] (7)利用(4)中的80個SSR標記引物對步驟(4)的RIL群體進行PCR擴增，產(chǎn)物在變性 聚丙烯酰胺凝膠中電泳，染色及帶型統(tǒng)計，篩選親本間有多態(tài)性的引物；
[0027] (8)將篩選得到的多態(tài)性引物對重組自交系(RIL)群體進行基因型分析，獲得兩個 與芝麻黑色種皮基因顯著關(guān)聯(lián)的標記位點ZMM4056和ZMM4067，將芝麻黑種皮基因定位在第 4條連鎖群上37kb的范圍內(nèi)。
[0028] 利用上述技術(shù)措施，
【申請人】最終獲得了與芝麻黑色種皮基因關(guān)聯(lián)的SSR標記 ZMM4056和ZMM4067。其中，ZMM4056引物序列為：
[0029] ZMM4056F: 5 ' -GCAGAAGGGTCAATATCGGA-3 '，如SEQ · ID · N0 · 5所示。
[0030] ZMM4056R: 5 ' -ATCCAAACCCCAGAAAATCC-3 '，如SEQ· ID · NO · 6所示。
[0031] ZMM4067引物序列為：
[0032] ZMM4067F:5'-GCTTAAACTTGGTTGTCGGG-3'JnSEQ.ID.N0.7K*。
[0033] ZMM4067R:5'-AAACCCTATCATTTCTTTGCCA-3'JnSEQ.ID.N0.8K*。
[0034] 上述SSR分子標記ZMM4056在芝麻育種中的應(yīng)用，具體應(yīng)用方法為：用所述SSR分子 標記ZMM4056擴增芝麻種質(zhì)資源葉片總DNA，擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，如果獲得 266bp的擴增片段，則表明該芝麻品種種皮顏色為黑色，如果獲得258bp的擴增片段，則表明 該芝麻品種種皮顏色為白色。
[0035] 上述SSR分子標記ZMM4067在芝麻育種中的應(yīng)用，具體應(yīng)用方法為：用所述SSR分子 標記ZMM4067擴增芝麻種質(zhì)資源葉片總DNA，擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，如果獲得 144bp的擴增片段，則表明該芝麻品種種皮顏色為黑色，如果獲得136bp的擴增片段，則表明 該芝麻品種種皮顏色為白色。
[0036]本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0037]隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展，利用生物信息學(xué)的方法大規(guī)模挖掘基因組特異分子 標記已成為可能。本發(fā)明基于全基因組測序，對芝麻的群體結(jié)構(gòu)進行分析，利用全基因組關(guān) 聯(lián)分析(GWAS)的方法，結(jié)合連鎖分析，最終獲得了與芝麻黑色種皮基因緊密連鎖的SSR分子 標記，并利用關(guān)聯(lián)分析結(jié)合連鎖分析對芝麻種皮顏色基因進行定位，將芝麻黑種皮基因定 位在第4條連鎖群上ZZM4056和ZZM6067標記間大約37kb的范圍內(nèi)。自然群體驗證表明這兩 個分子標記ZZM4056和ZZM6067可以有效篩選出黑芝麻和白芝麻，可以應(yīng)用于黑芝麻分子標 記輔助選擇育種。
【附圖說明】
[0038]圖1為利用SSR分子標記ZMM4056的引物在芝麻種質(zhì)資源中的基因組DNA中的擴增 結(jié)果。
[0039]圖2為利用SSR分子標記ZMM4067的引物在芝麻種質(zhì)資源中的基因組DNA中的擴增 結(jié)果。
【具體實施方式】
[0040] 下述實施例中按照《分子克隆實驗指南》（第三版）（黃培堂等譯，北京：科學(xué)出版 社，2002)所述的條件進行DNA提取、PCR及聚丙烯酰胺凝膠電泳等。實驗過程中涉及的所有 試劑成分均可從商業(yè)途徑獲得，并按照實驗手冊中的條件或所用試劑制造廠商所建議的條 件使用。
[0041] -種與芝麻黑色種皮基因 SiPPO緊密連鎖的SSR分子標記的獲得方法，包括如下步 驟：
[0042 ] (1)從國家芝麻中期庫保存的7910份國內(nèi)外資源中根據(jù)產(chǎn)量相關(guān)性狀的表型、地 理來源和遺傳多樣性檢測結(jié)果，采取逐級取樣策略，選取了705份芝麻材料進行重測序分 析；
[0043] (2)利用Illumina Hiseq2500測序平臺，用2X76雙末端測序法對705份芝麻材料 進行低覆蓋度的全基因組重測序，獲得了 2.6倍覆蓋的基因組序列；
[0044] (3)結(jié)合種質(zhì)資源群體中的種皮顏色數(shù)據(jù)、基因型數(shù)據(jù)和群體結(jié)構(gòu)，采用EMMAX軟 件包和Peal程序?qū)χヂ橄嚓P(guān)性狀進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在ρ = 10-129水平檢測到1個位于4 號連鎖群上11607514的位置與芝麻種皮顏色顯著關(guān)聯(lián)的標記位點，解釋67%的表型變異；
[0045] (4)根據(jù)芝麻(http: //ocri-genomics · org/Sinbase/index · html)基因組序列在 該SNP位點附近開發(fā)80對SSR引物，在一個重組自交系(RIL)群體中進行基因型分析；
[0046] (5)利用芝麻黑色種皮品種614為父本，芝麻白色種皮品種610為母本進行雜交，自 交數(shù)代后獲得F6代分離群體，即重組自交系(RIL)群體；
[0047] (6)采用CTAB法提取芝麻RIL群體的葉片總DNA;
[0048] (7)利用(4)中的80個SSR標記引物對該RIL群體進行PCR擴增，產(chǎn)物在變性聚丙烯 酰胺凝膠中電泳，染色及帶型統(tǒng)計，篩選親本間有多態(tài)性的引物；
[0049] (8)將篩選得到的多態(tài)性引物對重組自交系(RIL)群體進行基因型分析，獲得兩個 與芝麻黑色種皮基因顯著關(guān)聯(lián)的標記位點ZMM4056和ZMM4067，將芝麻黑種皮基因定位在第 4條連鎖群上37kb的范圍內(nèi)。
[0050] 實施例1:與芝麻種皮顏色基因緊密連鎖標記的獲得與鑒定
[0051] 一、芝麻種皮顏色的全基因組關(guān)聯(lián)分析
[0052] 1、從國家芝麻中期庫保存的7910份國內(nèi)外資源中，根據(jù)產(chǎn)量相關(guān)性狀的表型、地 理來源和遺傳多樣性檢測結(jié)果，采用分組、聚類分析、逐級取樣和分子標記輔助等一套方 法，綜合考慮了我國七大生態(tài)區(qū)和國外五大洲的來源和分布、種質(zhì)類型、形態(tài)和生物學(xué)特 性，優(yōu)先錄選高抗逆、高抗病和高品質(zhì)等育種目標突出的優(yōu)異種質(zhì)，選取了 705份芝麻核心 種質(zhì)進行全基因組重測序。
[0053] 2、2015年1月將全部材料種植在海南三亞，于芝麻初花期(播種后45天)選擇健康 單株取第三對和第四對真葉，迅速用液氮冷凍后轉(zhuǎn)移至干冰中保存。將嫩葉帶回實驗室后 用DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)試劑盒提取其余300份材料的總DNA，然后用超聲處理 將基因組DNA打碎，用T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Klenow DNA聚合酶修復(fù)末端后，再 用K1 enow Fragment(3 ' -5 ' exo_)在3 '末端接上A堿基，將不同的材料分別與不同類型的3 堿基接頭進行連接。多個樣品混合后用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，回收300-400bp的片段， PCR擴增9個循環(huán)。利用11 lumina Hiseq2500測序平臺，用2 X 76雙末端測序法對300份芝麻 材料進行低覆蓋度的全基因組重測序。705份材料的全基因組重測序共計產(chǎn)生原始測序數(shù) 據(jù)264Gb，平均測序深度為芝麻基因組大小的2.6倍。
[0054] 3、用SMALT軟件將雙末端測序得到的短序列與已完成的芝麻基因組序列進行比 對，選取一致性較高且不重復(fù)的序列。利用Ssaha Pileup包從一致性序列讀取單倍體序列， 去除雜合位點。對705份芝麻的單倍型序列進行比對，提取SNP，結(jié)合物理譜圖和連鎖圖譜， 標記它們在基因組中的位置，記錄變異在芝麻群體中發(fā)生的頻率。
[0055] 4、采用EIGENS0FT和PHYLIP分別進行主成分分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，探索對世界芝 麻資源的群體結(jié)構(gòu)。用Haploview軟件分析芝麻基因組的連鎖不平衡水平，確定該群體的LD 衰減水平。結(jié)合種質(zhì)資源群體中的種皮顏色數(shù)據(jù)、基因型數(shù)據(jù)和群體結(jié)構(gòu)，采用EMMAX軟件 包和Peal程序?qū)χヂ榉N皮顏色性狀進行全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)。檢測到一個與芝麻種皮 顏色緊密連鎖的SNP位點，該位點位于4號連鎖群上，位置在11607514(Ρ = 10-129)。
[0056] 二、芝麻種皮顏色關(guān)聯(lián)分子標記附近SSR標記的開發(fā)
[0057] 1、構(gòu)建黑色種皮/白色種皮芝麻重組自交系(RIL)群體
[0058] 利用芝麻黑色種皮品種614和白色種皮品種610進行雜交，獲得F1種子，F(xiàn)1植株自 交產(chǎn)生F2代種子，F(xiàn)2植株自交產(chǎn)生F3代種子，F(xiàn)3代開始按株行種植并自交產(chǎn)生種子，每個株 行只收獲1個單株的種子，種植成為下一代的1個株行，以此類推，最終獲得F6代分離群體， 即重組自交系(RIL)群體。
[0059] 利用CTAB法提取葉片基因組總DNA，具體步驟如下：
[0060] A.將各親本及RIL分離群體葉片適量放入超低溫冰箱-70°C存放，備用。使用時，自 超低溫冰箱(-70Γ)取適量葉片樣品，立即放入冰凍處理的研缽中，加入液氮研磨成粉狀； 快速裝入50m 1離心管中，加入在65 °C的水浴鍋中預(yù)熱過的CTAB提取液（2 % CTAB，0.1Μ Tris-C1，1.4M NaCl，20mM EDTA，pH 7.5)，混合均勻，放入65°(：的水浴鍋中水浴4〇11^11;
[0061] B.取出離心管，加入等體積的氯仿和異戊醇按體積比為24:1混合的混合液，緩慢 上下顛倒離心管30-50次，使充分混勾，13000g離心10min;
[0062] C.取離心后的上清于另一離心管中，重復(fù)B步驟一次。然后再取上清加入0.6倍體 積冰冷異戊醇中，緩慢顛倒離心管，直至有絮狀沉淀集結(jié)為止。然后置于_20°C靜置30min， 挑出沉淀，用75 % (體積比)酒精漂洗2-3次，干燥后加無菌水溶解；
[0063] D.再次重復(fù)B步驟一次，取上清，向其中加入0.1倍體積的NaAc(3mol/L，PH5.2)，混 勻后緩慢加入2倍體積的冰冷無水乙醇，靜止5min后緩慢轉(zhuǎn)動離心管直至絮狀沉淀出現(xiàn)，挑 出沉淀轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，75 % (體積比）酒精漂洗2-3次，干燥后加無菌水溶解，于-20°C 冰箱中保存?zhèn)溆茫吹酶饔H本及RIL分離群體葉片基因組總DNA。
[0064] 2、SSR引物的開發(fā)及多態(tài)性的篩選
[0065]根據(jù)芝麻(http: //ocri-genomics · org/Sinbase/index .html)基因組序列在 4號 連鎖群附近開發(fā)SSR引物。SSR引物具體的開發(fā)方法是先利用SSRHunter軟件在每個 scaf f iold搜索SSR，然后用Pr imer5.0軟件設(shè)計SSR引物。共設(shè)計了 80對SSR引物。
[0066] A.自父母本中各隨機選擇5株的DNA等量混合，總濃度調(diào)整至20ng/ul，用作篩選引 物的DNA模板。
[0067] B.PCR擴增反應(yīng)。具體反應(yīng)體系及擴增程序如下：
[0068] PCR反應(yīng)體系： 10xbliΠor ( MgC!.： free) I .〇〇ul dNTPs mixturct 1 OmM) 0.25ul Lefl primer (2.5uM) 1,60ul Right primcr(2.5uM) 1,60ul
[0069] 1 V Taq po!ymcrasc(5U/ul) 0.16ul MgCM25niM) 0.8ui DNA 2.5ul ddH：0 3.69ul
[0070] Total 10u!
[0071] PCR擴增程序：
[0072
[0073] 3、PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳測試獲得多態(tài)性篩選結(jié)果
[0074] 將以上獲得的PCR擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，以獲得雙親多態(tài)性篩選結(jié) 果，具體步驟如下：
[0075] 膠板制備：
[0076] 玻璃板用10% (質(zhì)量比)NaOH溶液浸泡24小時，洗凈，晾干。短膠板用餐巾紙均勻涂 抹硅烷化劑(AMMRESC0)，長膠板涂抹lml反硅烷化劑，放置5min后，將玻璃裝好，并以邊條隔 開，四周用制膠夾夾緊。準備就緒后用注射器將6% (質(zhì)量比）聚丙烯酰胺膠液60ml緩慢注入 玻璃間的縫隙中，直至灌滿到玻璃板模具的頂部，注意避免產(chǎn)生氣泡。小心插入梳子不帶齒 的一邊，并用夾子夾牢，聚合2小時以上。
[0077] 反硅烷化劑：500ml稀釋液(95 %無水乙醇，0.5 %冰醋酸，4.5 % ddH20)中加1 -2ml 親和硅烷；
[0078] 6% (質(zhì)量比）聚丙烯酰胺膠液:5.7% (質(zhì)量比）丙烯酰胺，0.3% (質(zhì)量比）N，N'_甲 叉二丙烯酰胺，42% (質(zhì)量比）尿素，1XTBE緩沖液。灌膠前每60ml膠液加入10% (質(zhì)量比）過 硫酸銨390ul和TEMED 39ul;
[0079] 電泳：
[0080] 去掉制膠夾，取出膠板，小心的取出梳子，沖洗并擦凈玻璃外側(cè)，固定于電泳槽上， 上下槽各加 500ml 1XTBE緩沖液，以恒功率75W電泳30min直到電壓回升，用注水器沖洗凝 膠的上表面以沖走析出的尿素和碎膠，插上梳子。在PCR產(chǎn)物中加入0.5倍體積的上樣緩沖 液，95 °C變性5min，冰浴冷卻3min以上，每個點樣孔點樣5ul，1800伏恒壓電泳約80min，當二 甲苯青FF到達2/3膠板時停止電泳。取下膠板，用自來水沖洗降溫。
[0081 ] 1 X TBE: Tris-basel08g，硼酸55g，0 · 5M EDTA(PH8 · 0)40ml，定容至 1000ml即成10 X TBE，使用時稀釋10倍即為1 X TBE工作液；
[0082] 上樣緩沖液:98 % (體積比）去離子甲酰胺，lOmmol/LEDTA，0.005 % (質(zhì)量比）二甲 苯青FF，0.005% (質(zhì)量比）溴酚藍。
[0083]銀染法染色：
[0084]將兩塊玻璃板分離開來，長玻璃板連同凝膠用蒸餾水漂洗3次，每次3min，放入染 色液（含〇 . 15%的AgN03)中染色lOmin，用蒸餾水快速漂洗5-6s。放入顯影液（含0.2%的 似0!1，0.04%的甲醛，35°(：)中顯影，至帶型清晰，然后在蒸餾水中漂洗1次，室溫下自然晾 干，拍照保存。觀察膠板上各引物在雙親中的擴增帶型，雙親帶型有差異的引物即為多態(tài)性 引物。
[0085] 4、篩選得到的多態(tài)性引物在RIL群體中的分析
[0086] 以550個RIL群體為模板，利用目標區(qū)間的分子標記進行基因型檢測。統(tǒng)計基因型 結(jié)果，將與父本一致的帶型記為A，與母本一致的帶型記為B，雜合的記為H。在此基礎(chǔ)上，采 用JoinMap 4.0進行遺傳圖譜構(gòu)建，從而計算出各標記在目標區(qū)間內(nèi)的遺傳位置。其中， ZMM4056和ZMM4067這兩個標記與芝麻種皮顏色顯著相關(guān)，將芝麻黑種皮基因定位在第4條 連鎖群上37kb的范圍內(nèi)。
[0087] 實施例2:與芝麻種皮顏色基因緊密連鎖的分子標記在芝麻種質(zhì)資源中的應(yīng)用
[0088] 利用實施例1獲得的與芝麻種皮顏色基因連鎖的SSR標記在96份不同遺傳背景材 料上進行驗證，其中48份材料為白色種皮芝麻品種，48份材料為黑色種皮芝麻品種，以確定 該標記用于分子標記輔助選擇的準確性。采用實施例1中步驟中的PCR擴增和檢測方法。 [0089]表1 96份芝麻地方品種材料的種皮顏色
[0090]
[0091]
[0092]
[0093] 檢測結(jié)果顯示見圖1。圖1中從左到右各樣品分別為編號為1，2,3…96的芝麻。分子 標記引物ZMM4056F/ZMM4056R擴增的與黑色種皮基因連鎖的SSR標記特征條帶為266bp，其 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示;分子標記引物ZMM4056F/ZMM4056R引物擴增的與白色種皮 基因連鎖的SSR標記特征條帶為258bp，其核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示。檢測結(jié)果表明該 SSR標記在96份材料中的驗證結(jié)果準確性為100%。
[0094] 另一檢測結(jié)果見圖2,圖2中從左到右各樣品分別為編號為1，2,3…96的芝麻。分子 標記引物ZMM4067F/ZMM4067R擴增的與黑色種皮基因連鎖的SSR標記特征條帶為144bp，其 核苷酸序列如SEQ. ID. N0.3所示;分子標記引物ZMM4056F/ZMM4056R引物擴增的與白色種皮 基因連鎖的SSR標記特征條帶為136bp，其核苷酸序列如SEQ.ID.N0.4所示。檢測結(jié)果表明該 SSR標記在96份材料中的驗證結(jié)果準確性為100%。
【主權(quán)項】
1. 一個與芝麻黑色種皮基因 SiPPO緊密連鎖的SSR分子標記，命名為ZMM4056，其特征在 于:核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 權(quán)利要求1所述的與芝麻黑色種皮基因 SiPPO緊密連鎖的SSR分子標記ZMM4056引物， 其特征在于：引物序列為： ZMM4056F:5 '-GCAGAAGGGTCAATATCGGA-3， ZMM4056R:5 '-ATCCAAACCCCAGAAAATCC-3 '。3. -個與芝麻黑色種皮基因 SiPPO緊密連鎖的SSR分子標記，命名為ZMM4067，其特征在 于:核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。4. 權(quán)利要求3所述的芝麻黑色種皮基因 SiPPO緊密連鎖的SSR分子標記ZMM4067引物，其 特征在于：引物序列為： ZMM4067F:5 '-GCTTAAACTTGGTTGTCGGG-3 ' ZMM4067R:5'-AAACCCTATCATTTCTTTGCCA-3'。5. 與芝麻黑色種皮基因 SiPPO緊密連鎖的SSR分子標記鑒定方法，其特征在于：用權(quán)利 要求2所述的ZMM4056引物擴增芝麻葉片總DNA，其中黑色種皮芝麻品種DNA的擴增片段大小 為266bp，白色種皮芝麻品種DNA擴增片段大小為258bp。6. 與芝麻黑色種皮基因 SiPPO緊密連鎖的SSR分子標記鑒定方法，其特征在于：用權(quán)利 要求4所述的ZMM4067引物擴增芝麻葉片總DNA，其中黑色種皮芝麻品種DNA的擴增片段大小 為144bp，白色種皮芝麻品種DNA擴增片段大小為136bp。7. 權(quán)利要求2所述的ZMM4056引物在芝麻育種中的應(yīng)用，其特征在于:應(yīng)用方法為：用權(quán) 利要求2所述的ZMM4056引物擴增芝麻種質(zhì)資源葉片總DNA，擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電 泳后，如果獲得266bp的擴增片段，則表明該芝麻品種種皮顏色為黑色，如果獲得258bp的擴 增片段，則表明該芝麻品種種皮顏色為白色。8. 權(quán)利要求4所述的ZMM4067引物在芝麻育種中的應(yīng)用，其特征在于:應(yīng)用方法為：用權(quán) 利要求4所述的ZMM4067引物擴增芝麻種質(zhì)資源葉片總DNA，擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電 泳后，如果獲得144bp的擴增片段，則表明該芝麻品種種皮顏色為黑色，如果獲得136bp的擴 增片段，則表明該芝麻品種種皮顏色為白色。
【文檔編號】C12Q1/68GK105838785SQ201610176228
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月25日
【發(fā)明人】張秀榮, 魏鑫, 周瑢, 王林海, 張艷欣
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所