專利名稱：肺癌檢測的唾液生物標記的制作方法
肺癌檢測的唾液生物標記相關申請的交叉引用本申請要求2010年2月10日提交的臨時申請USSN第61/303，205號的優(yōu)先權，該專利申請通過引用全文納入本文。聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)下完成發(fā)明的權利聲明本發(fā)明是在政府支持下由國家衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)授予的基金號DE016275資助完成。政府享有本發(fā)明的某些權利。背景根據(jù)國家癌癥研究院(National Cancer Institute),肺癌是癌癥死亡的主要原因(http://www. cancer, gov/cancertopics/types/lung)。2008 年，僅在美國就診斷出約 215，000例新肺癌患者。約87%的這些患者有非小細胞肺癌(NSCLC)。吸煙特別是香煙，迄今為止是肺癌的主要原因。在美國，估計當前有4千5百萬和4千5百萬前吸煙者處于發(fā)生肺癌的風險中。估計肺癌至少在未來50年內仍然是主要的健康問題。因為沒有可行的方法來篩選大量處于風險的人們，所以超過75%的肺癌在晚期才診斷出。早前診斷提供改善治愈率的希望。嘗試就肺癌發(fā)展鑒定和分類高風險個體和早期檢測。光譜細胞學(spectumcytology)和胸部X射線初始用作篩選工具。不幸的是,這些方案不能增加可治愈病例的數(shù)目。用靈敏度高于胸部X射線的計算機化斷層(CT)掃描取代這些方案。不幸的是，風險人群CT篩選的廣泛應用有數(shù)個缺陷，包含高假陽性(良性肺結節(jié)的檢測)和鑒定中心腫瘤的能力弱。因為所述的高假陽性率接近50%，估計就CT篩選防止的每個肺癌死亡而言要進行兩個不必要的侵入性操作。同樣，需要用于檢測肺癌的方法，并且特別是能檢測所述疾病早期的生物標記并且很大程度是非侵入性的。發(fā)明概述根據(jù)所述發(fā)明的一些實施方式，提供測定測試對象中出現(xiàn)或發(fā)生肺癌可能性的方法。所公開的方法包含分析對象的唾液樣品，用特異性檢測唾液樣品中生物標記的試驗，所述生物標記選自下組=CCNI (細胞周期蛋白I) (SEQ ID NO: I)、EGFR(表皮生長因子受體)(SEQ ID N0:2)、FGF9(成纖維細胞生長因子 19) (SEQ ID NO:3)、GREB1 蛋白(SEQ ID N0:4)、LZTS(亮氨酸拉鏈、推定的抑制物I) (SEQ ID NO:5)、BRAF(v_raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物BI (SEQ IDN0:6)、FRS2(成纖維細胞生長因子受體底物2) (SEQ ID NO: 7)、ANXAl (膜聯(lián)蛋白Al) (SEQ ID N0:8)、Hp2(觸珠蛋白 2) (SEQ ID N0:9)、鋅 α2糖蛋白(SEQID NO: 10)、剴托口卜啉單胞菌(Porphyromonas catoniae) 16S rRNA、昭和彎曲菌(Campylobacter showae) 16SrRNA、唾液鏈球菌(Streptocococcus salivaris) 16S rRNA、直腸彎曲菌(Campylobacterrectus) 16S rRNA、小韋榮菌(Veillonella parvula) 16S rRNA、口金桿菌(Kigellaoralis) 16S rRNA 和Btt鄰顆粒鏈菌(Granulicatella adiacens) 16S rRNA。測定所述生物標記的相對發(fā)生率并且與對照作比較，從而測定所述測試對象的肺癌狀態(tài)。在一些實施方式中，提供測定測試對象出現(xiàn)或發(fā)生肺癌可能性的方法，所述方法需要檢測唾液樣品中至少兩種生物標記。在另一些實施方式中，提供測定測試對象出現(xiàn)和發(fā)生肺癌可能性的方法，所述方法需要檢測剖托卩卜啉單胞菌(Porphyromonas catoniae)16S rRNA和昭和彎曲菌(Camplylobacter showae) 16S rRNA。例如，測定這些不例中所述生物標記或所述生物標志物(biomaker)和其他標記的相對發(fā)生率并且與對照作比較，從而測定所述測試對象的肺癌狀態(tài)。在一些實施方式中，提供測定測試對象出現(xiàn)或發(fā)生肺癌可能性的方法，所述方法需要檢測唾液樣品中至少三種生物標記。在另一些實施方式中，提供測定測試對象出現(xiàn)或發(fā)生肺癌可能性的方法，所述方法需要檢測GREB1、CCNI和FRS。在另一些實施方式中，提供測定測試對象出現(xiàn)或發(fā)生肺癌可能性的方法，所述方法需要檢測。例如，測定這些示例中所述生物標記或所述生物標志物(biomaker)和其他標記的相對發(fā)生率并且與對照作比較，從而測定所述測試對象的肺癌狀態(tài)。
在另一些實施方式中，測定測試對象出現(xiàn)或發(fā)生肺癌可能性的方法包含檢測編碼至少一種生物標記的核酸的試驗。例如，所述核酸能通過質譜、聚合酶鏈反應(PCR)、微陣列雜交、熱測序、毛細管陣列測序或固相測序來檢測。在另一些實施方式中，測定測試對象出現(xiàn)或發(fā)生肺癌可能性的方法包含檢測編碼至少一種生物標記的多肽的試驗。例如，所述多肽能通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)、Western印跡法、流式細胞術、免疫熒光、免疫組織化學或質譜來檢測。根據(jù)本發(fā)明的其他實施方式，公開了評價治療有效性的方法。所述方法包含用特異性檢測生物標記的試驗分析第一唾液樣品，所述生物標記選自下組CCNI、EGFR、FGF9、GREB I蛋白、LZTS、BRAF、FRS2、ANXAl、Hp2、鋅α 2糖蛋白、剖托卟啉單胞菌16S rRNA、昭和彎曲菌16S rRNA、唾液鏈球菌16S rRNA、直腸彎曲菌16S rRNA、小韋榮菌16S rRNA、口金桿菌16S rRNA和毗鄰顆粒鏈菌16S rRNA。所述第一分析提供第一表達概況。將治療應用于對象。用特異性檢測至少兩種生物標記的試驗進行第二唾液樣品分析，所述生物標記選自下組CCNI、EGFR、FGF9、GREBl 蛋白、LZTS、BRAF、FRS2、ANXAI、Hp2、鋅 α 2 糖蛋白、剴托口卜啉單胞菌16S rRNA、昭和彎曲菌16S rRNA、唾液鏈球菌16S rRNA、直腸彎曲菌16S rRNA、小韋榮菌16S rRNA、口金桿菌16S rRNA和毗鄰顆粒鏈菌16S rRNA，從而提供第二表達概況。比較所述第一和第二表達概況以評價治療的有效性。在另一個實施方式中，提供固體支持物，其中所述固體支持物包含為至少兩種生物標記選擇的捕獲結合探針，所述生物標記選自CCNI、EGFR、FGF9、GREBI蛋白、LZTS、BRAF,FRS2、剴托卟啉單胞菌16S rRNA、昭和彎曲菌16S rRNA、唾液鏈球菌16S rRNA、直腸彎曲菌16S rRNA、小韋榮菌16S rRNA、口金桿菌16S rRNA和毗鄰顆粒鏈菌16S rRNA。在一些實施方式中，提供第一和第二固體支持物，其中所述第一固體支持物包含為生物標記選擇的捕獲結合探針，所述生物標記選自CCNI、EGFR、FGF9、GREBl蛋白、LZTS、BRAF, FRS2、剴托卟啉單胞菌16S rRNA、昭和彎曲菌16S rRNA、唾液鏈球菌16SrRNA、直腸彎曲菌16S rRNA、小韋榮菌16S rRNA、口金桿菌16S rRNA和毗鄰顆粒鏈菌16S rRNA,并且其中所述第二固體支持物包含為生物標記選擇的捕獲結合配體，所述生物標記選自ΑΝΧΑ1、Ηρ2、鋅α 2糖蛋白和隹丐衛(wèi)蛋白。
在一些實施方式中，藥盒的所述捕獲結合探針是抗體。在另一些實施方式中，所述藥盒提供用于選擇性擴增生物標記的一種或多種引物，其中所述生物標記選自下組CCNI、EGFR、FGF9、GREB1 蛋白、LZTS、BRAF、FRS2、剴托卟啉單胞菌 16S rRNA、昭和彎曲菌 16S rRNA、唾液鏈球菌16S rRNA、直腸彎曲菌16S rRNA、小韋榮菌16S rRNA、口金桿菌16S rRNA和毗鄰顆粒鏈菌16S rRNA。在一些實施方式中，一種或多種所述引物有可檢測標記。根據(jù)所述發(fā)明的一些實施方式，提供測定測試對象中出現(xiàn)或發(fā)生肺癌可能性的方法。所公開方法包含用特異性結合唾液樣品中至少17種生物標記的試驗分析對象唾液樣品。所述生物標記選自下組CCNI (細胞周期蛋白I) (SEQ IDN0:1)、EGFR(表皮生長因子受體)(SEQ ID N0:2)、FGF9(成纖維細胞生長因子 19) (SEQ ID NO: 3), GREBl 蛋白(SEQ IDNO:4)、LZTS(亮氨酸拉鏈、推定的抑制物I) (SEQ ID NO:5)、BRAF(ν-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物BI (SEQ IDN0:6)、FRS2(成纖維細胞生長因子受體底物2) (SEQ ID NO: 7)、ANXA1 (膜聯(lián)蛋白 Al) (SEQ ID N0:8)、Hp2(觸珠蛋白 2) (SEQ ID N0:9)、鋅 α 2糖蛋白(SEQID NO: 10)、剴托卟啉單胞菌16S rRNA、昭和彎曲菌16S rRNA、唾液鏈球菌16S rRNA、直腸彎曲菌16SrRNA、小韋榮菌16S rRNA、口金桿菌16S rRNA和毗鄰顆粒鏈菌16S rRNA。測定至少17種 生物標記的相對發(fā)生率并且與對照作比較，從而測定所述測試對象的肺癌狀態(tài)。在上述任何一種測定測試對象出現(xiàn)或發(fā)生肺癌可能性的方法的實施方式中，所述生物標記的數(shù)目能是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17 或更多。這些和其他實施方式中，參照下列描述和圖片，特性和潛在優(yōu)勢變得顯而易見。附圖
簡要說明圖I是收集唾液方案的示意圖。發(fā)明詳述簡介肺癌的早期檢測提供更簡易的治療(更小的手術、更少的放射或化療)和提高的生存率。常規(guī)篩選(CT、X射線、光譜細胞學)的靈敏度和特異性不太令人滿意。因此，使用非侵入性收集樣品鑒定生物標記的敏感試驗對肺癌檢測理想。由健康個體產生或由受特定系統(tǒng)疾病影響的個體產生的生物標記都能用作監(jiān)控健康狀態(tài)、疾病發(fā)生、治療反應和結果的信號(tell-tale)分子。唾液是生物標記的易得來源。作為臨床診斷生物液體，唾液有很多優(yōu)勢；樣品收集簡單、非侵入性并且對患者部分引起的焦慮更少。唾液的使用提供了大規(guī)模篩選的經濟有效方法。本發(fā)明公開17種唾液生物標記的診斷/預后的重要性，包含檢測指示7種菌株的16S rRNA。肺癌檢測中的這些生物標記包含CCNI (細胞周期蛋白I) (SEQ ID NO: I)、EGFR(表皮生長因子受體)(SEQ ID NO: 2)、FGF9 (成纖維細胞生長因子19) (SEQ ID NO: 3),GREBl 蛋白(SEQ ID NO:4)、LZTS (亮氨酸拉鏈、推定的抑制物 I) (SEQ ID NO: 5) ,BRAF(v-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物BI (SEQ ID NO:6)、FRS2(成纖維細胞生長因子受體底物2) (SEQID NO: 7)、ANXAl (膜聯(lián)蛋白 Al) (SEQ ID N0:8)、Hp2 (觸珠蛋白 2) (SEQ ID NO: 9)、鋅 α 2糖蛋白(SEQ ID NO: 10)、剖托卟啉單胞菌16S rRNA、昭和彎曲菌16S rRNA、唾液鏈球菌16SrRNA、直腸彎曲菌16S rRNA、小韋榮菌16S rRNA、口金桿菌16S rRNA、毗鄰顆粒鏈菌16SrRNA、和其組合。唾液中的這些和其他生物標記的檢測用于肺癌的診斷和預后。
檢測唾液生物標記(蛋白和核酸)的方法包含諸如如ELISA、PCR如RT-PCR或質譜等技術，單獨或與其他標記組合。任何特異性探針能用于檢測，例如抗體、受體、配體、RT-PCR等。質譜也能用于蛋白檢測。因此，本發(fā)明能單獨使用或作為傳統(tǒng)抗原分析的補充以增強肺和其他癌癥的診斷。定義CCNI (細胞周期蛋白 I) (SEQ ID NO: I)、EGFR(表皮生長因子受體)(SEQ IDNO: 2),FGF9(成纖維細胞生長因子19) (SEQ ID NO:3)、GREBl蛋白(SEQ IDNO:4)、LZTS(亮氨酸拉鏈、推定的抑制物I) (SEQ ID NO: 5)、BRAF(v-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物BI (SEQ IDN0:6)、FRS2(成纖維細胞生長因子受體底物2) (SEQ ID NO: 7)、ANXAl (膜聯(lián)蛋白Al) (SEQ IDN0:8)、Hp2(觸珠蛋白2) (SEQ ID N0:9)、鋅α2糖蛋白(SEQ ID NO: 10)、剴托卟啉單胞菌16S rRNA、昭和彎曲菌16S rRNA、唾液鏈球菌16S rRNA、直腸彎曲菌16S rRNA、小韋榮菌16SrRNA、口金桿菌16S rRNA、毗鄰顆粒鏈菌16S rRNA指核酸，例如基因、DNA、前mRNA、mRNA和 多肽、多態(tài)性變體、等位基因、突變體和種間同源物，與由本文所述參考核酸編碼的多肽或氨基酸序列有高于約60%氨基酸序列相同性、65%、70%、75%、80%、85%、90%，優(yōu)選91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高氨基酸序列相同性，優(yōu)選超過至少約25、50、100、200、500、1000或更多氨基酸區(qū)域的區(qū)域。本發(fā)明的核酸和蛋白質包括天然產生的或重組的分子。提供所述核酸或蛋白序列，例如在SEQ ID NO: 1-9中。剴托卟啉單胞菌、昭和彎曲菌、唾液鏈球菌、直腸彎曲菌、小韋榮菌、口金桿菌、田比鄰顆粒鏈菌指菌株。能使用任何數(shù)量的方法來檢測樣品中的這些和其他菌株，包含例如檢測16S rRNA (核糖核酸或脫氧核糖核酸)、檢測染色體DNA、mRNA或適當生長條件下在合適生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自樣品的細菌?！òㄖ溉说陌┖桶┌Y、肉瘤、腺癌、淋巴癌、白血病等，包括實體瘤和淋巴癌，腎、乳腺、肺、腎、膀胱、結腸、卵巢、前列腺、胰腺、胃、腦、頭頸、皮膚、子宮、睪丸、食道和肝癌，包括肝細胞肝癌(hepatocarcinoma)、淋巴瘤,包括非霍奇金淋巴瘤(如,伯基特(Burkitt)、小細胞和大細胞淋巴瘤)和霍奇金淋巴瘤、白血病和多發(fā)性骨髓瘤?！爸委熖幚怼焙汀鞍┌Y治療”指化療、激素治療、放療和免疫治療?？苫Q術語“過量表達”、“過度表達”或“過量表達的”指，與正常細胞相比，癌癥細胞中通常蛋白在可檢測地更高水平轉錄或翻譯。所述術語包含與正常細胞相比，由于轉錄、轉錄后處理、翻譯、翻譯后處理、細胞定位(如細胞器、細胞質、核、細胞表面)和RNA和蛋白穩(wěn)定性引起的過量表達。能使用傳統(tǒng)檢測mRNA (如RT-PCR、PCR、雜交)或蛋白(如ELISA、免疫組織化學技術、質譜)的技術檢測過量表達。與正常細胞相比，過量表達能是10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在某些示例中，過量表達是相較正常細胞轉錄或翻譯的I倍、2倍、3倍、4倍或更高水平。可互換術語“癌癥相關抗原”或“腫瘤特異性標記”或“腫瘤標記”指，與正常細胞相比，在細胞內表達、癌細胞表面表達或癌細胞分泌，并且用于診斷癌癥、提供癌細胞診斷和藥學試劑優(yōu)選靶向的分子(通常蛋白或核酸，如RNA)。與正常細胞相比，癌癥相關抗原經常在癌癥細胞中過量表達，例如與正常細胞相比，過量表達約I. 2倍、約2倍、約3倍或更多。癌癥相關抗原經常是在癌細胞中不正常合成的細胞表面分子，例如，與正常細胞表達的分子相比，含有缺失、添加或突變的分子。癌癥相關抗原經常只表達在癌細胞表面，而在正常細胞表面不合成或表達。細胞表面腫瘤標記的不例包含乳腺癌的蛋白c-erbB-2和人表皮生長因子受體(HER)，前列腺癌的PSMA和多種癌癥(包括乳腺、卵巢和直腸癌)的糖粘蛋白。技術人員應理解，標記可以單獨使用或與其他標記聯(lián)合以用于任何用途，如本文公開的肺癌診斷或預后。 在兩種或多種核酸或多肽序列中，術語“相同”或“相同性”百分數(shù)指，采用BLAST或BLAST 2. O序列比較算法以下文所述默認參數(shù)、或通過手工比對或目測檢查所確定的(參見例如，NCBI網站http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/等)，在指定區(qū)域相同或其中有特定百分數(shù)的氨基酸殘基或核苷酸相同(即，就比較窗口或指定區(qū)域上的最大對應性進行比較和比對時，相同性約60%，優(yōu)選相同性為65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)的兩個或多個序列或子序列。然后,可稱這些序列“基本相同”。該定義也指或可應用于，測試序列的互補序列。該定義還包括含缺失和/或添加
的序列，以及含取代的序列。如下文所述，優(yōu)選的算法可考慮缺口等。優(yōu)選在長度至少約25個氨基酸或核苷酸的區(qū)域上存在相同性，或者更優(yōu)選在長度為50-100個氨基酸或核苷酸的區(qū)域上存在相同性。對于序列比較，一般將一種序列用作與測試序列比較的參比序列。使用序列比較算法時，測試和參比序列均輸入計算機，必要時指定子序列坐標，指定序列算法程序參數(shù)。優(yōu)選可使用默認的程序參數(shù)，或者可指定另外的參數(shù)。然后，該序列比較算法根據(jù)程序參數(shù)計算出測試序列相對于參比序列的序列相同性百分數(shù)。本文所用的“比較窗口 ”包括參考選自20-600，通常約50-200，更常見約100-150的任一數(shù)量的毗連位置的區(qū)段，其中對兩個序列進行最優(yōu)比對后，可將序列與具有相同數(shù)量毗連位置的參比序列作比較。比對序列的比較方法是本領域熟知的?？赏ㄟ^例如Smith 和 Waterman 的局部同源性算法，Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)，通過 Needleman 和Wunsch的同源性比對算法，J. Mol. Biol. 48:443 (1970)，通過Pearson和Lipman的相似性搜索法，Proc. Naf I. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)，通過計算機執(zhí)行這些算法(威斯康星遺傳學軟件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和TFASTA,遺傳學計算機組(Genetics Computer Group),威斯康星州麥迪遜的科學路575號(575Science Dr. , Madison, WI)),或通過手工比對和目測(參見例如，Current Protocolsin Molecular Biology (《新編分子生物學實驗指南》)(Ausubel等編，1987-2005,威利國際科學(Wiley Interscience)))進行最優(yōu)序列比對以便比較。適合測定序列相同性和序列相似性百分數(shù)的算法示例分別是BLAST和BLAST 2. O算法，參見 Altschul 等，Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)和 Altschul 等，J. Mol.Biol. 215:403-410(1990)。使用BLAST和BLAST 2. 0，設定本文所述的參數(shù)，以確定本發(fā)明核酸和蛋白質的序列相同性百分數(shù)。進行BLAST分析的軟件可從國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得(http://ncbi.nlm.nih.gov/)。此算法包括首先通過鑒定查詢序列中長度為W的短字來鑒定高評分序列對(HSP)，與數(shù)據(jù)庫序列中長度相同的字比對時它們能匹配或滿足一些正值的閾值評分T。T稱為相鄰字評分閾值(Altschul等，同上)。這些初始相鄰字命中用作啟動搜索的種子，以便找到含有它們的較長HSP。只要可提高累積比對評分，該字命中在沿各序列的兩個方向上延伸。就核苷酸序列而言，采用參數(shù)M(—對匹配殘基的獎勵評分；總是>0)和N(錯配殘基的罰分；總是〈O)計算累積評分。就氨基酸序列而言，用評分矩陣計算累積評分。出現(xiàn)以下情況時中止字命中在各個方向上的延伸累積比對評分比最大獲得值降低X ;由于一個或多個負評分殘基比對的累積，累積評分變?yōu)榱慊蛄阋韵?；或者達到任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對核苷酸序列而言)采用的默認值如下字長(W) 11，期望值(E)10，M=5，N=-4，以及比較兩條鏈。對氨基酸序列而言，BLASTP程序使用的默認值為字長3，期望值(E)10，BL0SUM62評分矩陣(參見Henikoff和Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:10915 (1989))比對(B) 50，期望值(E) 10，M=5，N=_4，以及比較兩條鏈?！昂怂帷敝该撗鹾颂呛塑账峄蚝颂呛塑账峒捌鋯捂溁螂p鏈形式的聚合物，和其互補物。特異性指配體結合靶標的能力，親和性為所述靶標非特異性配體的至少I. 2、
I.5、2、3、5、8、10、20、50、100、150、200、500、1000 或更高倍?！こ橇碛姓f明，具體核酸序列也隱含其保守修飾變體(如，簡并密碼子取代)和互補序列，以及明確指出的序列。具體說，可通過產生一個或多個選定(或所有)密碼子的第三個位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來獲得簡并密碼子取代(Batzer等，Nucleic Acid Res. 19:5081(1991) ;0htsuka 等，J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；Rossolini 等，Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994))。術語核酸與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可互換使用。特定核酸序列也隱含“剪接變體”和編碼癌抗原截短形式的核酸序列。類似地，核酸編碼的特定蛋白也隱含由該核酸的剪接變體或截短形式編碼的蛋白。顧名思義，“剪接變體”是基因可變剪接的產物。轉錄后，初始核酸轉錄物可剪接使得不同(可變)核酸剪接產物編碼不同多肽。產生剪接變體的機制不同，但包括外顯子的可變剪接(alternate splicing)。該定義也包括由同一核酸經讀出轉錄產生的可變多肽(alternatepolypeptide)。該定義中包括剪接反應的任何產物,包含所述剪接產物的重組形式。核酸能在5’末端或3’末端截短。多肽能在N末端或C末端截短。核酸或多肽序列的截短形式能天然發(fā)生或重組產生。術語“氨基酸”指天然產生的和合成的氨基酸，以及作用方式類似于天然產生氨基酸的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然產生的氨基酸是遺傳密碼編碼的氨基酸，以及隨后修飾的氨基酸，如羥基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸?！鞍被犷愃莆铩敝概c天然產生的氨基酸具有相同基本化學結構的化合物，即α碳結合于氫、羧基、氨基和R基，如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這種類似物具有修飾的R基(如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但與天然產生的氨基酸的基本化學結構保持相同。氨基酸模擬物指結構不同于氨基酸的普通化學結構，但作用方式類似于天然產生氨基酸的化合物。本文中氨基酸可用IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的俗稱三字母符號或單字母符號表示。同樣，核苷酸可用其普遍接受的單字母代碼表示?！氨Ｊ匦揎椬凅w”可應用于氨基酸和核酸序列。對于特定的核酸序列，保守修飾變體指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者當核酸不編碼氨基酸序列時，指基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能相同的核酸編碼任何給定的蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和G⑶都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在密碼子指定丙氨酸的每個位置上，可將所述密碼子改變成所述的任何相應密碼子而不改變編碼的多肽。這類核酸變異是“沉默變異”，這是保守修飾變異的一種。本文編碼多肽的每種核酸序列也描述該核酸的每種可能的沉默變異。本領域技術人員應認識，可修飾核酸中的各個密碼子(除了 AUG和TGG，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，TGG通常是色氨酸的唯一密碼子)，以產生功能相同的分子。因此，多肽編碼核酸的各沉默變異隱含于就所述表達產物描述的各序列中，但不針對實際的探針序列。至于氨基酸序列，本領域技術人員將認識到，在編碼序列中改變、加入或刪除一個氨基酸或較少百分數(shù)氨基酸的單個核酸、肽、多肽或蛋白質序列取代、缺失或添加是“保守修飾變體”，其中改變導致氨基酸被化學上相似的氨基酸所取代。提供功能上相似氨基酸的保守取代表是本領域熟知的。這類保守修飾的變體是本發(fā)明的多態(tài)性變體、種間同源物和等位基因的補充且并不排除它們。以下八組各自含有可互相保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G) ；2)天 冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K) ；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W) ；7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)甲硫氨酸(M)(參見例如Creighton,Proteins (《蛋白質》)(1984))?！擞洝ɑ颉蓹z測部分〃是可通過光譜、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其它物理手段檢測的組合物。例如，可用的標記包括熒光染料、電子密集試劑、酶(例如，ELISA中常用的酶)、生物素、地高辛、或半抗原與蛋白質，所述半抗原或蛋白質通過在肽內摻入放射性標記從而可以檢測或用于檢測與所述肽特異性反應的抗體。用于例如細胞或核酸、蛋白質或載體時，術語“重組”表示所述細胞、核酸、蛋白質或載體已通過引入異源核酸或蛋白質或對天然核酸或蛋白質的改變進行修飾，或所述細胞源自如此修飾的細胞。例如，重組細胞因此表達不存在于天然(非重組)形式細胞內的基因或表達原本異常表達、低表達或完全不表達的天然基因。術語“嚴謹雜交條件”指通常在核酸的復合混合物中，探針與其靶標子序列雜交但不與其他序列雜交的條件。嚴謹條件是序列依賴性的，在不同情況下不同。較長的序列在較高溫度下特異性雜交。有關核酸雜交的廣泛指南參見Tijssen, Techniques inBiochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes (《生物化學和分子生物學技術與核酸探針雜交》)，“Overview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid assays (核酸測定的雜交原理和方案概覽)”(1993)。通常，嚴謹條件選擇為比特定序列在確定離子強度、pH下的熱解鏈溫度(Tm)低約5-10°C。Tm是50%靶標互補探針與靶序列雜交平衡時的溫度(在確定離子強度、pH和核酸濃度下)(由于靶序列過量存在，在Tm時50%探針被平衡地占據(jù))。也可加入去穩(wěn)定劑如甲酰胺以獲得嚴謹條件。在選擇性或特異性雜交中，陽性信號至少是背景雜交的兩倍，優(yōu)選10倍。示范性嚴謹雜交條件可以如下所述50%甲酰胺、5x SSC和1%SDS，42°C孵育，或者5x SSC、1%SDS、65°C 孵育，用 0. 2x SSC 和 0. 1%SDS 在 65°C 洗滌。如果核酸編碼的多肽基本相同，那么在嚴謹條件下彼此不雜交的核酸仍基本相同。例如，用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡并性產生核酸拷貝時可能發(fā)生這種情況。在這種情況下，核酸一般在中等嚴謹?shù)碾s交條件下雜交。示范性“中等嚴謹雜交條件”包括在40%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS的緩沖液中37°C雜交，并在IX SSC中45V洗滌。陽性雜交至少是背景的兩倍。本領域普通技術人員不難認識到，可利用替代的雜交和洗滌條件提供相似嚴謹性的條件。很多文獻提供確定雜交參數(shù)的其他原則，例如Current Protocols inMolecular Biology (《新編分子生物學實驗指南》)，Ausubel等,見上。對PCR而言，盡管退火溫度可以根據(jù)引物長度在約32°C -48°C變化，約36°C的溫度通常用于低嚴謹擴增。就高度嚴謹PCR擴增而言，盡管高嚴謹退火溫度可根據(jù)引物長度和特異性在約50°C -約65°C范圍內，典型溫度是約62°C。高和低嚴謹擴增的典型循環(huán)條件包括90°C -95°C 30秒-2分鐘的變性期、持續(xù)30秒-2分鐘的退火期和約72°C 1-2 分鐘的延伸期。例如，在 Innis 等(1990)PCR Protocols, A Guide to Methodsand Applications (《PCR方案方法與應用指南》，學術出版社有限公司(AcademicPress, Inc.)，紐約)中，提供了低和高度嚴謹擴增反應的方案和原則?！翱贵w”指包含基本由全部或部分已識別免疫球蛋白基因編碼的一種或多種多肽。例如，人中已識別的免疫球蛋白基因包含K、λ和重鏈基因座，其共同組成大量可變區(qū)基·因，并且包含恒定區(qū)基因μ、δ、Υ、ε和α，其分別編碼IgM, IgD、IgG、IgE和IgA同種型。本文抗體意在包含全長抗體和抗體片段，并且可以指來自任何生物體的天然抗體、工程改造的抗體或用于實驗、治療或如下進一步定義的其他目的的重組生成的抗體?？贵w片段包含F(xiàn)ab、Fab’、F (ab’ ) 2、Fv、scFv或抗體的其他抗原結合子序列，并且包含通過修飾全抗體或使用重組DNA技術從頭合成抗體而產生的抗體子序列。術語“抗體”指單克隆和多克隆兩種抗體?？贵w能是拮抗劑、激動劑、中和性、抑制性或刺激性。生物標記生物標記可以來自流行病學研究、動物研究、病理生理考慮和終末器官(end-organ)實驗。理想地，生物標記對有意義的結果測量有高預測值，在合適設計的預測試驗中能夠或被證實，通過替代標記結果的相應改變來反映治療成功，并且應該在臨床實踐中易于評價。生物標記能與其他診斷工具聯(lián)用或單獨使用。術語“替代標記”、“生物分子標記”、“生物標記”或“標記”(本文有時也稱作“靶標分析物”、“靶標物質”或“靶標序列”)指其檢測提供對象狀態(tài)的信息的分子。在多個示例性實施方式中，所述生物標記用于評估病理狀態(tài)。所述生物標記的測量能單獨使用或與獲自相關對象的其他數(shù)據(jù)聯(lián)用以測定對象狀態(tài)。在一個實施方式中，所述生物標記是在取自一種表型狀態(tài)(如有疾病)對象樣品中相較另一表型狀態(tài)(如沒有疾病)“差異性存在”。在一個實施方式中，所述生物標記是在取自沒有經歷治療或一種類型治療的對象樣品中相較另一類型治療“差異性存在”?；蛘?，所述生物標記能在甚至如果沒有表型不同時“差異性存在”，例如所述生物標記可以檢測無癥狀風險。生物標記可以相對于對照過量表達(過量充足)或過低表達(不夠充足)。所述生物標記能是等位基因變體，野生型核酸或蛋白的截短或突變形式。所述生物標記能是剪接變體。生物標記能以多種方式測定為“差異性存在”，例如，在不同表型狀態(tài)之間，如果不同組中生物標記的均值或中值水平(特別是如下文所述的相關mRNA表達水平)計算為統(tǒng)計學顯著。統(tǒng)計學顯著性的常見檢驗包含t檢驗、ANOVA、克-瓦二氏(Kruskal-Wal I is)、威爾科克森(Wilcoxon)、曼-惠特尼(Mann-Whitney)和讓步比等。如本文所述，生物標記例如可以是小分子、分析物或靶標分析物、核酸、蛋白、代謝物或任何其衍生物或這些分子的任何和全部組合，發(fā)現(xiàn)蛋白和核酸在本發(fā)明中有特別應用。本領域人員應理解，大量分析物可以使用本方法檢測；基本上，如下所述生成結合配體的任何生物標記可以使用本發(fā)明方法檢測。在多個實施方式中，用于本發(fā)明組的生物標記能檢測為任何組合中的蛋白或核酸(如mRNA或cDNA轉錄物)。在多個實施方式中，測量所述生物標記的蛋白形式。本領域人員應理解，蛋白分析可以使用標準技術如ELISA試驗完成。在多個實施方式中，測量所述生物標記的核酸形式(如對應的mRNA)。在多個示例性實施方式中，用蛋白試驗測量來自特定組的一種或多種生物標記或用核酸試驗測量來自相同組的一種或多種生物標記。
本領域人員應理解，有大量可能的蛋白性靶標分析物和靶標物質,可使用本發(fā)明檢測。術語“蛋白”、“多肽”或“寡肽”指由一個或多個肽鍵連接的至少兩個或更多肽或氨基酸。蛋白或氨基酸可以天然或非天然產生，并且也可以是類似物、衍生物或擬肽結構。術語“蛋白”指野生型序列、野生型序列變體和包含類似物或衍生氨基酸的序列或序列變體。在多個實施方式中,本文所述序列變體可用作生物標記,所述序列變體包含蛋白和核酸,根據(jù)如剪接變體、包含缺失、添加、替換的變體、片段、前原蛋白、經處理前原蛋白(如沒有信號肽)、經處理前蛋白(如產生活性形式)、非人序列和變體非人序列。在多個實施方式中，所述生物標記是核酸。術語“核酸”或“寡核苷酸”或本文語法等同形式指至少兩個共價連接在一起的核苷酸。本發(fā)明的核酸通常包含磷酸二酯鍵，盡管在一些如下面概括的示例中，例如在使用結合配體探針中，包含的核酸類似物可以有替代的主鏈。生物標記也能是細菌核酸或蛋白?？谇皇羌毦拇髢欤卸嘤?00種或種系型，其中超過50%沒有培養(yǎng)過。在一些實施方式中，評價細菌菌群組成和動態(tài)變化是肺癌的生物標記。近期開發(fā)的基于16S rRNA的寡核苷酸微陣列(人口腔微生物鑒定微陣列)使概括有和沒有肺癌的患者中口腔微生物囷群成為可能。在一些實施方式中，樣品中細囷16SrRNA的出現(xiàn)、缺失或水平可以與疾病或病癥相關?！凹毦敝感〉脑松?線性尺寸約
Iμ m)，有非分隔的環(huán)形DNA并且核糖體約為70S?！?16S RNA”指原核核糖體的30S亞基的核酸組分；編碼16S rRNA的所述基因或16S rRNA自身。所述物種或種系型的菌株16S rRNA的差異少于約2%。密切相關種或種系型16S rRNA的差異通常為約2%-約4%，而屬的16SrRNA的差異通常是約5%-約10%。為分辨細菌群的相同性，例如能設計微陣列探針，以利用16S rRNA基因的保守特性。例如，與更保守特性區(qū)互補的探針在大系統(tǒng)發(fā)生組中鑒定物種，每組對應更高分類(例如，界(domain)、門、綱、目、或科)。與更多可變區(qū)互補的探針區(qū)分屬和種。生物標記也能包含微小RNA?！拔⑿NA” (miR)指調節(jié)基因表達的較小、天然產生的非編碼RNA (18-24核苷酸)的種類。很多微小RNA在種之間高度保守，并且存在于廣泛范圍的種中植物、線蟲、果蠅和人。微小RNA具有與一種或多種信使RNA分子(mRNA)部分或完全互補序列，并且其主要功能是負調節(jié)基因表達。特別地，微小RNA結合mRNA的3’非翻譯區(qū)(3-UTR)，因此以多種方式(例如mRNA剪接、轉錄抑制和脫腺苷化)產生mRNA的下調。多種實驗方案和不同技術用于鑒定新的微小RNA，和研究其在不同生物過程中的表達模式。使用小RNA克隆方案從不同尺寸RNA樣品中成功克隆和鑒定新的微小RNA。其他方案是已經在其他種中描述或使用單獨計算機方法或與微陣列分析和序列定點克隆聯(lián)用的微小RNA的推定微小RNA同源物。用于微小RNA檢測和概況的第一種技術之一是Northern印跡，其中在膠分離后，用互補32P、地高辛標記寡核苷酸或修飾的鎖核酸(Locked-nucleic-acid(LNA))寡核苷酸完成雜交。已開發(fā)展用于特定鑒定微小RNA的其他技術是修改的侵入檢測試驗(invaderassay)(合成寡核苷酸、探針,其合適重疊瓣(overlap-flap)結構由 結構特異性5*核酸酶進行酶剪切)和原位雜交(使用含有化學修飾核苷酸如LNA的熒光標記互補探針)。微小RNA檢測和概況的其他廣泛使用的技術是應用基于寡核苷酸微陣列的檢測平臺，用DNA捕獲探針或使用修飾的鎖核酸(LNA)寡核苷酸，其中核糖部分用連接2’ -O和4’ -C原子的額外橋修飾。另外，定量實時PCR (使用Taqman或SYBR綠色技術的逆轉錄酶/聚合酶鏈反應)已經用于前體或成熟的微小RNA的檢測和概況。所述技術靈敏并且需要少量起始材料以檢測個體成熟微小RNA。已經開發(fā)出提供qRT-PCR靈敏度的Taqman微小RNA陣列，而同一時間能同時檢測一個樣品中不同的微小RNA。生物標記也能包含代謝物?！按x物”或“小分子”指樣品中出現(xiàn)的有機和無機分子。所述術語不包含大的高分子，例如大蛋白(如分子量超過2，000、3，000、4，000、5，000、6，000、7，000、8，000、9，000 或 10，000 的蛋白)、大核酸(如分子量超過 2,000,3,000,4，000,5, 000,6, 000,7, 000,8, 000,9, 000或10，000的核酸)或大型多糖(如分子量超過2，000,3, 000,4, 000,5, 000,6, 000,7, 000,8, 000,9, 000 或 10，000 的多糖)。溶液中通常不含所述分子的代謝物。〃代謝物概況〃或〃小分子概況〃指靶向細胞、組織、器官、生物體或其部分(如細胞隔室)內完整或部分的小分子總量。所述總量包含所出現(xiàn)小分子的數(shù)量和/或類型。所述“小分子概況”可以使用單一技術或多種不同技術測定。能通過使用技術例如GC-MS (氣相色譜-質譜)和LC-MS (液相色譜-質譜)分析樣品來建立代謝物概況。生物標記組本文所述生物標記的任意組合用于組裝成如本文檢測或測量的生物標記組。如本領域通常所理解，組合可以指整個組或任何亞組或其亞組合。所述術語“生物標記組”、“生物標記概況”或“生物標記指紋”指生物標記的組。本文所用的這些術語也能指測量的任何生物標記形式。因此，如果CCNI是生物標記組的一部分，那么例如CCNI mRNA或例如蛋白能視作組的一部分。個體生物標記用作診斷，而生物標記的組合有時在測定特定狀態(tài)上能提供的價值高于單獨生物標記。特別地，樣品中多種生物標記的檢測能增加測試的靈敏度和/或特異性。因此在多個實施方式中，生物標記組可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或更多種生物標記。在多個示例性實施方式中，所述生物標記組由最小數(shù)目生物標記組成以產生最大量的信息。因此在多個實施方式中，生物標記組由1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或更多種生物標記組成。當生物標記組“由”一組生物標記“組成”時，沒有那些組以外的生物標記出現(xiàn)。在示例性實施方式中，所述生物標記組由本文所述I種生物標記組成。在多個實施方式中，所述生物標記組由本文所述2種生物標記組成。在多個實施方式中，所述生物標記組由本文所述3種生物標記組成。在多個實施方式中，所述 生物標記組由本文所述4種或更多種生物標記組成。在多個示例性實施方式中，生物標記組包含選自下組的生物標記或由其組成CCNI(細胞周期蛋白I) (SEQ ID NO: I)、EGFR(表皮生長因子受體)(SEQ IDN0:2)、FGF9 (成纖維細胞生長因子19) (SEQ ID N0:3)、GREB1蛋白(SEQ IDNO:4)、LZTS(亮氨酸拉鏈、推定的抑制物I) (SEQ ID N0:5)、BRAF(v-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物Bl(SEQ ID N0:6)、FRS2(成纖維細胞生長因子受體底物2) (SEQ ID NO:7)、ANXAl (膜聯(lián)蛋白Al) (SEQ ID N0:8)、Hp2(觸珠蛋白2) (SEQ ID N0:8)、B鏈(Chain B)、MHc樣鋅α 2糖蛋白和Prol之間形成的復合物的結晶結構、剖托卟啉單胞菌16S rRNA、昭和彎曲菌16S rRNA、唾液鏈球菌16S rRNA、直腸彎曲菌16S rRNA、小韋榮菌16S rRNA、口金桿菌16SrRNA。生物標記也能是臨床參數(shù)。所述術語“臨床參數(shù)”指對象健康狀態(tài)的所有非樣品或非分析生物標記或其他特性，例如但不限于年齡、種族、性別、家族史、身高和體重。本發(fā)明的生物標記顯示肺癌診斷中的統(tǒng)計學顯著差異。在多個實施方式中，單獨或聯(lián)用這些生物標記的診斷測試顯示至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%和約100%的靈敏度和特異性。生物標記的測量和檢測生物標記通常能通過本領域技術人員已知的多種試驗、方法和檢測系統(tǒng)來測量和檢測。所述術語“測量”、“檢測”或“進行測量”指整體屬性的定量或定性測定，例如定量分子的量或濃度或分子的活性水平。所述術語“濃度”或“水平”能指絕對或相對數(shù)量。測量分子也可以包含測定所述分子的消失或出現(xiàn)。多個方法包含但不限于折光率光譜(RI)、紫外光譜(UV)、熒光分析、電化學分析、放射化學分析、近紅外光譜(近IR)、紅外(IR)光譜，核磁共振波譜法(NMR)、光散射分析(LS)、質譜、裂解質譜、濁度法、分散拉曼光譜、氣相色譜、液相色譜、與質譜結合的氣相色譜、與質譜結合的液相色譜、與質譜結合的基體輔助激光解吸電離飛行時間(MALDI-T0F)、與質譜結合的離子噴霧光譜、毛細管電泳、比色法和表面等離振子共振(例如根據(jù)Biacore生命科學公司(Biacore Life Sciences)提供的系統(tǒng))。也參見PCT公開W0/2004/056456和W0/2004/088309。在這方面，生物標記能使用上述檢測方法或本領域技術人員已知的其他方法測量。能使用特定設計或調節(jié)的檢測標記的試劑來相似地檢測其他生物標記。不同類型的生物標記和其測量能結合于本發(fā)明的組合物和方法。在多個實施方式中，測量所述生物標記的蛋白形式。在多個實施方式中，測量所述生物標記的核酸形式。在示例性實施方式中，核酸形式是mRNA。在多個實施方式中，蛋白生物標記的測量與核酸生物標記的測量聯(lián)用。檢測mRNA的方法，例如RT-PCR、實時PCR、分支DNA、NASBA和其他方法為本領域熟知。使用數(shù)據(jù)庫條目提供的生物標記序列的序列信息，使用本領域普通技術人員熟知的技術能檢測(若有)和測量生物標記序列的表達。例如，序列數(shù)據(jù)庫條目中的序列或本文公開的序列能用于構建檢測生物標記RNA序列的探針,如在Northern印跡雜交分析或特異和優(yōu)選定量擴增特異核酸序列的方法中。另一個示例中，所述序列能用于構建特異擴增生物標記序列的引物，如基于擴增的檢測方法中，例如基于逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)。當基因表達的改變與基因擴增、缺失、多態(tài)性和突變相關時，測試和參比群的序列對比能通過比較測試和參比細胞群中所檢測DNA序列的相對量來完成。除了 Northern印跡和RT-PCR以夕卜，測量RNA還能用例如其他靶標擴增方法(如TMA, SDA、NASBA)、信號擴增方法(如bDNA)、核酸酶保護試驗、原位雜交等。在本發(fā)明的一個實施方式中，是生物芯片試驗。本文的“生物芯片”或“芯片”指通常包含固體支持物或底物的組合物，連接捕獲結合配體(也稱為吸附、親和試劑或結合配體，或核酸測量時的捕獲探針)并能結合蛋白、核酸或兩者都結合。通常，當生物芯片用于測量蛋白和核酸生物標記時，測量所述蛋白生物標記的芯片與用于測量核酸生物標記的芯片分開。用于測量核酸的附加平臺和方法的非限定性示例見公開US/2006/0275782、US/2005/0064469和DE10201463。在多個實施方式中，在相同平臺例如某一芯片上測量生物標記。在多個實施方式中，使用不同平臺和/或不同使驗操作測量生物標記?！?br> 本文的“結合配體”、“捕獲結合配體”、“捕獲結合物質”、“捕獲探針”或其語法等同形式指用于檢測靶標分析物、靶標物質或靶標序列(全部互換使用)的出現(xiàn)或進行相對或者絕對定量，并且會結合靶標分析物、靶標物質或靶標序列的化合物。通常，所述捕獲結合配體或捕獲探針使靶標物質或靶標序列連接到固體支持物上以用于本文進一步所述的檢測目的。所述靶標物質和所述捕獲結合配體可以直接或間接連接。在示例性實施方式中，所述靶標物質是生物標記。本領域技術人員應理解，所述結合配體的組成取決于生物標記的組成。多種生物標記的結合配體已知或能使用已知技術容易地發(fā)現(xiàn)。例如，當所述生物標記是蛋白時，所述結合配體包含蛋白(如下面進一步討論，特別包含抗體或其片段(Fab等))或小分子。所述結合配體也可有與其他種類蛋白的交叉反應性?？乖?抗體對、受體-配體以及糖和其結合伴侶也是合適的分析物-結合配體對。在多個實施方式中，所述結合配體可以是核酸。當?shù)鞍资前袠藭r，核酸結合配體有特別用途；或者，如通常描述于美國專利5，270，163 ;5，475，096 ;5，567，588 ;5，595，877 ;5，637，459 ;5，683，867 ;5，705，337 和相關專利中，所述專利通過引用納入本文，能開發(fā)核酸“適配子”以結合幾乎任何生物標記。當核酸是結合靶標時，核酸結合配體也有特別用途。有大量文獻涉及基于組合化學方法開發(fā)結合伴侶。在這些實施方式中，當所述結合配體是核酸時，優(yōu)選組合物和技術概括于PCT公開TO/1998/020162中，其通過引用納入本文。在多個示例性實施方式中，所述捕獲結合配體是抗體。這些實施方式特別用于檢測生物標記的蛋白形式。檢測或測量所述生物標記的水平(如轉錄水平)涉及所述生物標記與捕獲結合配體結合，當所述生物標記mRNA在固體支持物上檢測時，本文通常稱為“捕獲探針”。在這個意義上，所述生物標記是靶標序列。所述術語“靶標序列”或“靶標核酸”或其語法等同形式指核酸序列，可以是基因的一部分、調節(jié)序列、基因組DNA、cDNA、RNA，包含mRNA和rRNA或其他。如本文所概括，所述靶標序列可以是來自樣品的靶標序列，或第二靶標例如擴增反應如PCR的產物等。在一些實施方式中，測量核酸因而能指測量核酸的互補鏈。其可以是任意長度，應理解更長的序列有更高特異性。
所述靶標序列也可以包含不同靶結構域；例如，樣品靶標序列的第一靶結構域可以與第一捕獲探針雜交，第二靶結構域可以與標記探針雜交(如“夾心試驗”模式)等。所述靶結構域可以如所示相鄰或分開。除非另有說明，所述術語“第一”和“第二”不意在賦予序列就所述靶標序列5’ -3’方向的取向。例如，假定所述靶標的5’ -3’方向，所述第一靶結構域可以定位在第二結構域的5’或第二結構域的3’。當核酸用作靶標分析物時，所述發(fā)明試驗能采用很多實施方式。在一個實施方式中，所述試驗在溶液模式中使用許多基于溶液的模式完成。在一個實施方式中，使用本領域熟知的終點或實時PCR模式。這些試驗可以在單獨管或孔中作為組完成，或者使用單個管或孔中的引物和不同標記組作為多重試驗完成。除了基于PCR溶液模式以外，能使用其他模式，包括但不限于例如使用FRET染料對基于連接的試驗。在這個實施方式中，只有與靶標序列雜交的兩個(或多個)探針連接后生成信號。在很多實施方式中，所述試驗在固體支持物上使用與表面相連的捕獲探針完成。如本文討論，所述捕獲探針(或有時稱為捕獲結合配體)能共價連接到表面，例如使用的捕 獲探針末端用官能團修飾，例如氨基，連接到修飾表面例如硅烷化玻璃?；蛘撸苁褂梅枪矁r連接，例如靜電力、疏水/親水粘附。如本領域技術人員所理解和本文所討論，在多種表面可能有很多種連接。在這個實施方式中，所述試驗能利用很多模式。在一個實施方式中，所述靶標序列包含本文所述的可檢測標記。在這個實施方式中，所述標記通常以下面兩種方法之一在所述靶標擴增中加入靶標序列在所述擴增步驟中使用任一標記的引物或使用標記的dNTP，這兩種都為本領域熟知。所述標記是如本文討論的一級或二級標記。例如，在一個實施方式中，所述引物和/或dNTP上的標記是一級標記,例如突光團?；蛘?所述標記可以是二級標記，例如生物素或酶；例如，在一個實施方式中，所述引物或dNTP用生物素標記，然后加入鏈霉親和素/標記復合物。在一個實施方式中，所述鏈霉親和素/標記復合包含標記，例如熒光團。在另一個實施方式中，所述鏈霉親和素/標記復合包含酶標記。例如，所述復合物能包含辣根過氧化物酶，且加入TMB后，辣根過氧化物酶的作用使TMB沉淀，引起光學可檢測事件。這有特定優(yōu)勢，因為光學檢測不需要使用熒光計。在另一個實施方式中，所述固相試驗依賴于使用標記的可溶捕獲配體，當所述靶標分析物是核酸時，有時稱為“標記探針”或“信號探針”。在這個模式中，所述試驗是“夾心”類型試驗，其中所述捕獲探針結合到所述靶標序列的第一結構域上并且所述標記探針結合到第二結構域上。在這個實施方式中，所述標記探針能是一級(如熒光團)或二級(如生物素或酶)標記。在一個實施方式中，如本文討論，所述標記探針包含生物素，并且使用鏈霉親和素/酶復合物。如上所述，例如，所述復合物能包含辣根過氧化物酶，且加入TMB后，辣根過氧化物酶的作用使TMB沉淀，引起光學可檢測事件。在一些實施方式中，靶標物質的檢測需要能以多種方法納入的“標記”或“可檢測標記”(如下所述)。因此，在多個實施方式中，上述組合物包含“標記”或“可檢測標記”。在一個實施方式中，標記所述靶標物質(或靶標分析物或靶標序列)；結合所述靶標物質，因此提供在固體支持物表面上的標記。在本文中有特定應用的實施方式中，使用沒有標記靶標物質的夾心模式。在這些實施方式中，“捕獲”或“錨定”結合配體連接到如本文所述的檢測表面上，并且可溶結合配體(通常稱為“信號探針”、“標記探針”或“可溶捕獲配體”)獨立結合所述靶標物質，并且直接或間接包含至少一種標記或可檢測標記。本文的“標記”或“標記的”指化合物有連接的至少一種分子、元素、同位素或化學化合物以能夠檢測該化合物。盡管標記也包含顆粒例如磁性顆粒，通常標記分成四類a)可以是放射性或重同位素的同位素標記山)磁性、電、熱；c)有色或發(fā)光染料；和d)酶。所述染料可以為發(fā)色團或磷，但是由于熒光染料的強信號為解碼提供良好信噪比，優(yōu)選熒光染料。本發(fā)明使用的合適染料包括但不限于，熒光鑭系復合物(包含銪和鋱的那些)，熒光素，羅丹明，四甲基羅丹明，伊紅，赤蘚紅，香豆素，甲基香豆素，芘，孔雀石綠，芪，螢光黃，級聯(lián)藍(Cascade Blue),德克薩斯紅，Alexa染料和其他描述于Richard P. Haugland的第6版Molecular Probes Handbook (分子探針手冊)的染料,所述手冊通過引用明確納入本文。其他標記包含納米晶體或Q點，如描述于美國專利6，544，732，所述專利通過引用納入。在多個實施方式中，使用二級可檢測標記。二級可檢測標記是間接檢測的標記；例如，二級標記能結合或與一級檢測標記反應以用于檢測，能作用于其他產物以生成一級標記(例如酶)，或可以使包含二級標記的所述化合物從未標記材料中分開等。二級標記包括 但不限于，結合伴侶對之一；化學修飾部分；核酸酶抑制劑，酶例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、熒光素酶等。二級標記也能包含其他標記。在多個實施方式中，所述二級標記是結合伴侶對。例如，所述標記可以是結合其結合伴侶的半抗原或抗原。例如，合適的結合伴侶對包括但不限于抗原(例如蛋白(包含肽))和抗體(包含其片段(Fab等))；蛋白和小分子，包含生物素/鏈霉親和素；酶和底物或抑制劑；其他蛋白-蛋白相互作用對；受體-配體；和糖和其結合伴侶。也使用核酸-核酸結合蛋白對。通常，所述對中較小的成員連接到NTP上以納入引物。優(yōu)選結合伴侶對包括但不限于，生物素(或亞氨基-生物素)和鏈霉親和素，地高辛(digeoxinin)和抗體，和Prol inx 試劑。在發(fā)明的所述夾心模式中，酶作為二級標記，連接到可溶捕獲配體上。在一些實施方式中使用辣根過氧化物酶具有特定用途，當結合3，3’，5，5’四甲基聯(lián)苯胺(TMB)形成有色沉淀時，則被檢測到。在一些示例中，所述可溶捕獲配體包含生物素，然后結合酶-鏈霉親和素復合物并且加入TMB形成有色沉淀。在多個實施方式中，所述標記或可檢測標記是結合酶(例如辣根過氧化物酶)。在多個實施方式中，所述系統(tǒng)依賴于檢測反應產物的沉淀或例如用以檢測的電屬性改變。在多個實施方式中，沒有化合物包含標記。如本文使用的術語“熒光信號生成部分”或“熒光團”指在一個波長吸收能量并且在另一個波長再發(fā)射能量的分子或分子部分。能檢測的熒光屬性包含熒光強度、熒光壽命、發(fā)射光譜特性、能量轉移等。能生成來自信號分子的信號并且通過很多檢測系統(tǒng)加以檢測，所述系統(tǒng)包括但不限于，掃描電子顯微鏡、近場掃描光學顯微鏡(NSOM),全內反射突光顯微鏡(TIRFM)等。文獻中可發(fā)現(xiàn)對應用所述技術分析和檢測表面納米級結構的大量指導，如下列通過引用納入的參考文獻所不Reimer 等編，Scanning Electron Microscopy:Physics ofImage Formation and Microanalysis (掃描電子顯微鏡成像的物理學和微量分析)，第
2版(施普林格出版公司(Springer)，1998) ;Nie 等，Anal. Chem.，78:1528-1534(2006)；Hecht 等，Journal Chemical Physics, 112:7761-7774(2000) ；Zhu 等編，Near-FieldOptics:Principles and Applications (近場光學原理和應用)(新加坡的世界科學出版公司(World Scientific Publishing), 1999) ;Drmanac,PCT 公開 W0/2004/076683 ；Lehr等，Anal. Chem. , 75:2414-2420 (2003) ；Neuschafer 等，Biosensors&BioeIectronics, 18:489-497 (2003) ；Neuschafer 等，美國專利 6，289，144 等。因此，熒光團檢測系統(tǒng)包含能用于測量上述熒光屬性的任何設備。在多個實施方式中，所述檢測系統(tǒng)包含激發(fā)源、熒光團、分離發(fā)射光子和激發(fā)光子的濾波器、和記錄光子發(fā)射和生成可記錄輸出的檢測器，在一些實施方式中，作為電子信號或照相影像。檢測設備的例包含但不限于突光分光光度計和微板讀數(shù)儀、突光顯微鏡、突光掃描儀(包含如微陣列讀數(shù)儀)和流式細胞儀。在多個示例性實施方式中，所述生物標記與結合配體的結合為特異性或選擇性，并且所述結合配體是結合對的一部分。本文的“特異性結合”或“選擇性結合”或“選擇”生物標記指所述配體結合所述生物標記的特異性足以區(qū)分所述生物標記和檢測樣品中的其他成分或污染物。
所述術語“固體支持物”或“底物”指任何材料，所述材料能修飾以包含合適于連接或結合捕獲結合配體的離散單獨位點。合適底物包含金屬表面，例如金、電極、玻璃和經修飾或功能化玻璃、塑料(包含丙烯酸、聚苯乙烯和苯乙烯及其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚碳酸酯、聚氨酯、特氟龍、其衍生物等)、多糖、尼龍或硝酸纖維素、樹脂、云母、二氧化硅或基于二氧化硅的材料包含硅和修飾的硅、碳、金屬、無機玻璃、玻璃纖維、陶瓷、GETEK(聚環(huán)氧丙烷和纖維玻璃的混合物)和其他多種聚合物。本發(fā)明特定使用下述ClonDiag 材料。通常，生物芯片的表面包含很多可尋址位點，每個包含捕獲結合配體。本文的“陣列定位”、“可尋址位點”、“盤”或“位點”指包含共價連接捕獲結合配體的底物上的定位。本文的“陣列”指規(guī)則、順序模式(如基質)上的多個捕獲結合配體。所述陣列的大小取決于陣列的組成和最終應用。能生成包含約兩種或更多乃至數(shù)千種不同捕獲結合配體。根據(jù)所述陣列的最終應用，通常所述陣列會包含3、4、5、6、7或更多種捕獲結合配體。在本發(fā)明中，所述陣列能包含對照、標記的復制物等。示例范圍是約3-約50。在一些實施方式中，所述發(fā)明組合物可以不采用陣列模式；即對一些實施方式，也可以生成包含單個捕獲配體的組合物。另外，在一些陣列中，可使用多個底物，組合物不同或者相同。因此，例如，大陣列可以包含多個更小底物。因此，在一方面，所述發(fā)明提供的組合物包括含用于生物標記組中每種生物標記的捕獲結合配體的固體支持物。在多個實施方式中，所述捕獲配體是核酸。在多個實施方式中，所述捕獲結合配體是抗體。在多個實施方式中，所述組合物還包含用于生物標記組中每種生物標記的可溶結合配體?？梢允褂帽绢I域已知的很多不同生物芯片陣列平臺。例如，能用陣列平臺，例如 GeneChip (昂飛(Affymetrix) )、CodeLink 生物陣列(安瑪西亞(Amersham))、表達陣列系統(tǒng)(應用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems) )、SurePrint微陣列(安捷倫(Agilent) )、Sentlix LD 珠芯片或 Sentrix 陣列矩陣(Array Matrix)(億明達(Illumina))和Verigene (納米球公司(Nanosphere))實施本發(fā)明所述的組合物和方法。
在多個示例性實施方式中，生物標記的檢測和測量使用比色方法和系統(tǒng)以提供指示靶標分析物或靶標物質的結合。在比色方法中，結合靶標物質如生物標記的出現(xiàn)會造成樣品或底物在一個或多個波長的吸光度或透光性改變。在所述波長的吸光度或透光性檢測因而指示靶標物質的出現(xiàn)。比色法檢測系統(tǒng)包含能用于測量上述比色屬性的任何設備。通常，所述設備是分光光度計、色度計或任何能在一個或多個波長測量吸光度或透光性的設備。在多個實施方式中，所述檢測系統(tǒng)包含光源；濾波器或單色儀；樣品容器例如比色皿或反應瓶；記錄透射光的檢測器，例如光敏電阻器；和顯示器或成像元件。在多個示例性實施方式中，ClonDiag芯片平臺用于生物標記的比色檢測。在多 個實施方式中，使用ClonDiag陣列管(ArrayTube) (AT)。陣列管的一個獨特特性是聯(lián)合微探針陣列(生物芯片)和微反應瓶。在靶標序列是核酸的多個實施方式中，通過擴增和生物素化樣品所含靶標序列并可選地消化擴增產物來完成靶標序列的檢測。然后使擴增產物與ClonDiag芯片所含探針雜交。鏈霉親和素_酶偶聯(lián)物溶液例如聚辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)物溶液，接觸ClonDiag芯片。洗滌后，染料溶液例如鄰茴香胺底物溶液，接觸所述芯片。所述染料的氧化產生能比色檢測的沉淀。所述ClonDiag平臺的進一步描述參見Monecke S、Slickers P、Hotzel H等，Clin Microbiol Infect 2006, 12:718 - 728 ；MoneckeS> Berger-Bachi B > Coombs C 等，Clin Microbiol Infect 2007，13:236-249 ;Monecke S、Leube I 和 Ehricht R, Genome Lett 2003, 2:106 - 118 ；Monecke S 和 Ehricht R, ClinMicrobiol Infect 2005，11:825-833 ;德國專利 DE10201463 ;美國公開 US/2005/0064469和 ClonDiag, ArrayTube(AT)Experiment Guideline for DNA-Based Applications (基于DNA應用的ClonDiag，陣列管(AT)實驗指南)，I. 2版，2007，所有內容通過引用全文納入本文。本領域技術人員會理解，能使用很多與過氧化物酶反應的其他染料以生成比色改變，例如3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。特定試驗方案信息參見www. clondiag. com/technologies/publications, php。在靶標物質是蛋白的多個實施方式中，所述陣列管生物芯片包含捕獲結合配體，例如抗體。樣品接觸所述生物芯片，并且使樣品中出現(xiàn)的任何靶標物質結合捕獲結合配體抗體。使可溶捕獲結合配體或檢測混合物例如辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗體結合所述靶標物質。然后加入染料例如TMB并且使其與辣根過氧化物酶反應，生成沉淀和通過合適檢測設備檢測的顏色改變。使用陣列管檢測蛋白的進一步描述參見例如Huelseweh B, EhrichtR 和 Marschall H-J, Proteomics, 2006, 6, 2972-2981 ；和 ClonDiag，ArrayTube(AT)Experiment Guideline for DNA-Based Applications (基于 DNA 應用的 ClonDiag,陣列管(AT)實驗指南)，I. 2版，2007，所有內容通過引用全文納入本文。用ClonDiag AT讀數(shù)儀器完成透光性的檢測和分析。合適的讀數(shù)儀器和檢測設備包含陣列管工作站ATS和ATR 03。除了陣列管之外，能使用ClonDiag陣列條(ArrayStrip) (AS)。所述陣列條提供用于高體積測試的96孔模式。每個陣列條由標準的8孔條組成，具有整合到每個孔底部的微陣列。多至12個陣列條能插入到一個微板框架中，使平行多參數(shù)測試能多至96個樣品。所述陣列條能使用陣列條處理器ASP處理，其能運行在基于陣列分析中需要的全部液體處理、孵育和檢測步驟。在檢測蛋白的多個實施方式中，使用陣列條檢測蛋白的方法包含用緩沖液或封閉溶液調節(jié)AS陣列；在AS孔中加入多至96個樣品溶液使其結合蛋白；3x洗滌；用HRP連接的二抗偶聯(lián)；3x洗滌；用TMB染色沉淀；和AS陣列成像及可選的數(shù)據(jù)存儲。本領域技術人員熟悉可以用于運行本文所述方法的多種其他免疫試驗模式和其變體。通常參見E. Maggio, Enzyme-Immunoassay (酶-免疫試驗)，(佛羅里達州伯克萊屯的 CRC 出版社公司(CRC Press), 1980);也參見美國專利 4，727，022; 4, 659，678; 4, 376，110;4，275，149; 4，233，402;和 4，230，767。通常，根據(jù)本發(fā)明運行的免疫試驗可以是均質試驗或非均質試驗。在均質試驗中，所述免疫反應通常涉及特異性抗體(如抗生物標記蛋白抗體)、標記分析物和感興趣樣品。抗體與標記分析物結合后，直接或間接修飾來自標記的信號。免疫反應和其程度檢測都能在均質溶液中進行?？梢允褂玫拿庖呋瘜W標記包含自由基、放射性同位素、熒光染料、酶、噬菌體或輔酶。在非均質試驗方法中，試劑通常是樣品、抗體和生產可檢測信號的方法。可以使用·上述樣品。所述抗體能固定在支持物上，例如珠(如蛋白A和蛋白G瓊脂糖珠)、板或片，并且接觸液相中懷疑含有抗原的樣品。然后所述支持物從液相分離，并且使用生成所述信號的方法檢查支持物相或液相的可檢測信號。所述信號與樣品中分析物的存在有關。生成可檢測信號的方法包含使用放射性標記、熒光標記或酶標記。例如，如果待檢測抗原包含第二結合位點，結合所述位點的抗體能偶聯(lián)到可檢測基團并且在分離步驟前加入到液相反應溶液中。固體支持物上可檢測基團的出現(xiàn)指示測試樣品中抗原的存在。合適免疫試驗的示例包含免疫印跡、免疫熒光方法、免疫沉淀、化學發(fā)光方法、電化學發(fā)光(ECL)或酶聯(lián)免疫試驗?？贵w能根據(jù)已知技術例如被動結合來偶聯(lián)到適于診斷試驗(如蛋白A或蛋白G瓊脂糖珠，如膠乳或聚苯乙烯材料形成的微球、板、片或孔)的固體支持物上。本文所述抗體可以根據(jù)已知技術類似偶聯(lián)到可檢測標記或基團上，例如放射性標記(如35S、125I、131I)、酶標記(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶)和熒光標記(如熒光素、Alexa、綠色熒光蛋白、羅丹明)。使用本文所述的任何方法和組合物，能測試樣品以測定生物標記組的水平。因此，在一方面，本發(fā)明提供測試患者樣品以測定樣品中生物標記組濃度的方法。在一些實施方式中，所述方法包含將樣品接觸含有固體支持物的組合物，所述固體支持物包含用于生物標記組中每種生物標記的捕獲結合配體或捕獲探針。本發(fā)明提供就很多醫(yī)療(包含診斷和治療)、工業(yè)、法醫(yī)學和研究應用測定肺健康或肺癌狀態(tài)的藥盒。藥盒包含載體，例如盒、紙盒、管等，其中的封閉限制中有一種多種容器，例如瓶、管、安瓿、瓶子、囊袋、包膜等。在多個實施方式中，所述藥盒包含選自用于本文所公開多種生物標記和生物標記組測量的一種或多種培養(yǎng)基或培養(yǎng)基成分和試劑的一種或多種組分。例如，本發(fā)明的藥盒還可以包含相同或不同容器中的一種或多種DNA聚合酶、一種或多種引物、一種或多種合適緩沖液、一種或多種核苷酸(例如脫氧核苷三磷酸(dNTP)和優(yōu)選熒光標記dNTP)和標記成分。所述一種或多種組分可以包含在相同容器中，或包含在分開的容器中以在使用前混合。本發(fā)明的藥盒也可以包含完成本發(fā)明方法的一種或多種說明書或方案。藥盒也可以包含計算機或計算機組成，例如計算機可讀的存儲介質或設備。存儲介質的示例包含但不限于光盤例如CD、DVD和藍光盤(BD);磁光盤；磁性介質例如磁帶和內部硬盤和可移動盤；半導體存儲裝置如EPROM、EEPROM和閃存；和RAM。所述計算機可讀存儲介質可以包含編碼涉及本文所公開多種治療和處理方案的軟件。所述軟件可以通過計算機解讀以提供操作者根據(jù)本文提供的多種生物標記測量濃度來處理。在多個實施方式中，所述藥盒包含涉及有風險閾值檢測的基于側流醫(yī)療點快速測試的生物標記試驗，或有對所述組分生物標記定量試驗的生物芯片。診斷和治療方法本發(fā)明的組合物和方法能用于預后、診斷和治療對象的疾病。本發(fā)明提供用于測量對象樣品中生物標記的實驗室和醫(yī)療點測試的組合物和方法。通常本發(fā)明能應用于很多不同疾病。在示例性實施方式中，所述疾病是肺癌。本文公開的所述生物標記和生物標記組能用于某些方法以診斷、鑒定或篩選對象，所述對象有疾病、沒有疾病或有疾病的風險；監(jiān)控經歷疾病治療的對象；測定或指示新治療或治療改變；相對其他疾病或疾病亞分類內疾病差異性診斷與該疾病相關的疾病狀態(tài)；評價患者中疾病的嚴重性或嚴重性變化；分期有所述疾病的對象和選擇或修改用于治
療有疾病對象的治療或干預。在一個示例性實施方式中，本發(fā)明的所述方法用于鑒定和/或診斷無疾病癥狀或有前癥狀的對象。本文中“無癥狀”或“前癥狀”不意在顯示疾病的傳統(tǒng)癥狀或足夠異常。在多個實施方式中，測定對象疾病預后、診斷對象疾病或治療對象疾病的方法包含對象樣品中生物標記組的測量。在多個示例性實施方式中，生物標記組由以下兩種或多種組成:CCNI(細胞周期蛋白I) (SEQ ID NO: I)、EGFR(表皮生長因子受體)(SEQ ID NO:2),FGF9(成纖維細胞生長因子19) (SEQID NO:3)、GREBl蛋白(SEQ ID NO:4)、LZTS(亮氨酸拉鏈、推定的抑制物I) (SEQ ID NO: 5)、BRAF(v-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物BI (SEQ IDNO:6)、FRS2(成纖維細胞生長因子受體底物2) (SEQ ID NO:7)、ANXAl (膜聯(lián)蛋白Al) (SEQID N0:8)、Hp2(觸珠蛋白 2) (SEQ ID NO:8)、B 鏈(Chain B)、MHc 樣鋅 α 2 糖蛋白和 Prol之間形成的復合物的結晶結構、剖托卟啉單胞菌、昭和彎曲菌、唾液鏈球菌、直腸彎曲菌、小韋榮菌、口金桿菌。術語“疾病狀態(tài)”包含疾病的任何可區(qū)分表現(xiàn)，包含沒有疾病。例如，疾病狀態(tài)包括但不限于疾病的出現(xiàn)或消失、疾病發(fā)展的風險、疾病的分期、疾病的進展(如伴隨時間的疾病發(fā)展或疾病緩解)、疾病的嚴重性和治療疾病的有效性或反應。本發(fā)明內容中的“對象”是動物，優(yōu)選哺乳動物。哺乳動物可以是人，非人靈長類，小鼠，大鼠，狗，貓，馬，或牛，但不限于這些例子。在多個示例性實施方式中，對象是人并且可以指患者。人以外的哺乳動物能有利地用作代表疾病或獸醫(yī)應用的動物模型的對象。對象能是原先診斷或鑒定有疾病，并且可選已經接受，或正在接受疾病的治療干預的人?；蛘?，對象也可以是先前未診斷有疾病的對象。例如，對象可以顯示有一種或多種疾病風險因子，或沒有顯示疾病風險因子，或無疾病癥狀。對象也能是正患有疾病或有發(fā)展疾病風險的對象。在某些實施方式中，所述對象可已經接受治療或能是治療候選。本領域技術人員應理解，所述生物標記可以使用數(shù)種設計成獲得更可預測對象和分析變化的技術進行測量。術語“樣品”指獲自對象的樣品或培養(yǎng)物，并且包含液體、氣體和固體，包括例如樣品組織。在多個示例性實施方式中，樣品包含唾液。本領域技術人員應理解，可以在樣品上完成幾乎任何實驗操作或樣品準備步驟。例如，可對樣品應用洗滌步驟和/或片段化。在多個實施方式中，直接測量對象上的生物標記組，而不需要從患者獲得分離樣品。一方面，本發(fā)明提供診斷對象疾病的方法，所述方法包含生物標記組的測量；和將疾病與所述測量相關聯(lián)。術語“關聯(lián)”通常指測定一種數(shù)據(jù)類型和另一種或狀態(tài)之間的關系。在多個實施方式中，將疾病與所述測量相關聯(lián)包含對比所述測量與參考生物標記概況或一些其他參考值。在多個實施方式中，將疾病與所述測量相關聯(lián)包含測定對象目前是否處于疾病狀態(tài)中。生物標記組的含量或活性測量能與參考值作比較。然后鑒定對象樣品中生物標記測量相較參考值的差異。在示例性實施方式中，由下面進一步描述的風險類別給出所述參考值。
在多個實施方式中，所述參考值是基線值?；€值是來自一個或多個對象的有效量生物標記的復合樣品，所述對象沒有疾病，無疾病癥狀，或有某一水平的疾病?；€值也能包含來自對象的樣品的生物標記量，所述對象由于處理或治療已顯示疾病風險因子的改善。在這些實施方式中，為比較所述取自對象的樣品，相似計算生物標記的量。參考值也能包含取自對象的生物標記量，所述對象有由侵入性或非侵入性技術確定的疾病或有發(fā)展疾病的高風險?？蛇x地，選擇鑒定有疾病或發(fā)展疾病風險增加的對象以接受治療方案從而減緩疾病的發(fā)生或者降低或預防發(fā)展疾病的風險。如果生物標記量相對參考值隨時間而改變，那么認為疾病是累進的(或者，所述治療沒有預防進展)，而如果生物標記量隨時間保持恒定(相對于參考群，或本文使用的“恒定”)則疾病不是累進的。就參考值而言，本發(fā)明上下文中使用的術語“恒定”解釋為包含隨時間的改變。本發(fā)明的生物標記能用于生成對象的“參考生物標記概況”，所述對象根據(jù)某一閾值沒有疾病，沒有疾病風險或不預期發(fā)生疾病。本文公開的所述生物標記也能用于生成取自對象的“對象生物標記概況”，所述對象有疾病或有疾病風險。所述對象生物標記概況能與參考生物標記概況作比較以診斷或鑒定對象有發(fā)生疾病的風險，監(jiān)控疾病進展以及疾病進展速率和監(jiān)控疾病治療特征的有效性。本發(fā)明的所述參考和對象生物標記概況能包含在機器可讀介質中，例如但不限于，模擬磁帶如VCR可讀的那些；光學介質例如CD-ROM、DVD-ROM等，和固態(tài)存儲器等。本發(fā)明的生物標記組測量能使操作者影響對患者的治療。因此，本發(fā)明提供治療對象疾病的方法，包含對象樣品中生物標記組的測量和影響對患者的治療。術語“治療”和“處理”可以互換使用。在某些實施方式中，所述治療能選自但不限于起始治療、持續(xù)治療、調節(jié)治療或結束治療(ending therapy)。治療也包含任何可以防止疾病的預防性檢測。在某些實施方式中，處理包含給予患者疾病調節(jié)藥。所述藥物能用于診斷或鑒定有疾病或有疾病風險的對象的治療或預防。在某些實施方式中，調節(jié)治療指改變治療的持續(xù)時間、頻率或強度，例如改變劑量水平。在多個實施方式中，影響治療包含使患者或傳達給患者需要改變生活方式，例如，增加鍛煉、改變飲食、減少或戒除吸煙等。所述治療也能包含手術，例如乳房切除。生物標記水平的處理能監(jiān)控疾病治療過程。疾病治療方案的有效性能通過隨時間檢測獲自對象樣品的一種或多種有效量生物標記和比較所檢測生物標記量來監(jiān)控。例如，第一樣品能在對象接受治療前獲得，而一種或多種后續(xù)樣品在對象治療后或治療中獲得。所述樣品中生物標記水平的改變可以提供治療有效性的指示。
為鑒定適合特異對象的治療或藥物，來自對象的測試樣品也能接觸治療制劑或藥物，并且能測定一種或多種生物標記的水平。生物標記水平可與獲自治療前和治療后或者接觸治療制劑或藥物的對象樣品作比較，或可與獲自顯示所述治療或接觸引起相對疾病改善的一個或多個對象的樣品作比較。因此，一方面，本發(fā)明提供評價對象治療有效性的方法，包含在對象第一樣品的生物標記組中進行第一測量；影響對對象的治療；在對象第二樣品的生物標記組中進行第二測量和比較第一和第二測量以評價治療的有效性。另外，適合給予特定對象的治療或預防試劑能通過檢測獲自對象的有效量生物標記(可以是兩種或更多)和使來自對象樣品暴露于測定來自對象樣品中生物標記量的測試混合物而鑒定。因此，有疾病對象或有發(fā)展疾病風險的對象的處理或治療方案能根據(jù)獲自對象的樣品的生物標記量來選擇并與參考值作比較。兩種或多種處理或治療方案能平行評價，以確定哪個處理或治療方案對用于對象延遲發(fā)生或減慢疾病進展最有效。在多個實施方式中，對是否開始或繼續(xù)疾病處理給出建議。藥物處理在多個示例性實施方式中，影響治療包含給予對象疾病調節(jié)藥。對象可以用一種·或多種疾病調節(jié)藥處理，直到測量生物標記的改變水平回到群中測量的基線值，所述群沒有疾病、經歷疾病的更輕階段或形式，或顯示由于疾病調節(jié)藥處理產生的疾病生物標記的改善。另外，涉及生物標記或臨床參數(shù)水平改變的提高可以是疾病調節(jié)藥處理的結果。很多化合物例如疾病調節(jié)藥可以使用本發(fā)明方法用于治療對象或監(jiān)控進展。在某些實施方式中，所述疾病調節(jié)藥包含。這些和其他藥物的有益效果能通過評價臨床和實驗室生物標記觀察到。本文公開的任何藥物或藥物組合可以給予患者治療疾病。本文所述藥物能以多種方式制備，經常根據(jù)本領域或本文公開或參考的多種已知制劑制備。在多個實施方式中,本文公開的任何藥物或藥物組合不給予患者治療疾病。在這些實施方式中，所述操作者可以避免給予藥物或藥物組合，可以建議不給予所述對象藥物或藥物組合，或者可以防止給予對象藥物或藥物組合。在多個實施方式中，除了那些建議或已經給予的以外，可選給予一種或多種其他藥物。其他藥物通常不會是不推薦或應該避免的任何藥物。在示例性實施方式中，一種或多種其他藥物包含一種或多種降血糖藥。決策矩陣由操作者選擇的所述治療能取決于樣品中測定的生物標記濃度。在多個示例性實施方式中，所述治療取決于每種生物標記的測量濃度落入各生物標記特定分類范圍中的哪個類別。在多個示例性實施方式中，治療取決于生物標記組指示的不同癥狀或疾病的風險水平組合。關于生物標記的濃度測量，所述術語“分類”指生物標記可有的可能濃度部分的亞組。每個分類可以與操作者選擇的標記或類別相關。所述標記可以指例如有或處于疾病狀態(tài)的個體的風險水平。所述分類和標記可以來自當前文獻或根據(jù)操作者的發(fā)現(xiàn)。生物標記組的每個生物標記能因此與單獨分類組(例如風險類別)相關。合并每個生物標記的一種分類形成“決定點”。在多個示例性實施方式中，所述決定點的完整組包含所有可能的η元分類，其中η是生物標記組的生物標記數(shù)目。所述完整組會有Hi1 Xm2 X... mn可能的決定點，其中Hli是生物標記i的分類數(shù)目。每個決定點能與并不必需唯一的病癥或疾病狀態(tài)相關。即，一種或多種決定點能與相同疾病狀態(tài)相關。每個可能的決定點與病癥或疾病狀態(tài)的相關能稱為“疾病分類矩陣”或“疾病分類樹”。因此，通過關聯(lián)生物標記組測量和決定點，所述操作者能分類患者的病癥或疾病狀態(tài)。每個決定點也能與并不必需唯一的特定治療相關。即，一種或多種決定點能與相同治療相關。每個可能的決定點和一種或多種治療的相關能稱為“治療決定矩陣”或“治療決定樹”。每個決定點能與多于一種的信息類型相關。例如，疾病狀態(tài)和治療都能由決定點指示。本文使用的冠詞“一個”、“一種”和“所述”不排除指示物的復數(shù)，除非另有明確說 明。連詞“或”不是互斥的，除非另有明確說明。術語“包含”用于指非限制性示例。
實施例提供以下實施例以說明而非限制本發(fā)明。實施例I :唾液轉錄體組學(transciptomic)概況和分析唾液收集未刺激的全唾液樣品用前面建立的方案收集。要求對象在收集前限制進食、飲酒、吸煙或口腔衛(wèi)生程序至少30分鐘。擦除唇膏，并且所述對象用淡水漱口一次。通常，患者捐獻約5-10ml唾液。然后以2，600g在4°C離心樣品15分鐘。然后在_80°C存儲所述上清液，直到使用。值得注意的是，每Iml唾液樣品中加入包含I μ I抑肽酶、10 μ I PMSF (氟化磺酰苯基甲烷)和3μ I釩酸鈉(所有這些來自密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司(Sigma))的蛋白酶抑制劑混合物。mRNA的分離和分析從330 μ I唾液上清液中使用MagMax 病毒RNA分離試劑盒(德克薩斯州奧斯汀的安碧公司(Ambion))分離RNA。這個過程使用KingFisher mL技術(馬薩諸塞州沃森姆的熱科學公司(Thermo Scientific))，接著用TURBO DNase處理(德克薩斯州奧斯汀的安碧公司)以除去污染DNA來自動完成。90 μ I的已提取DNA (100 μ I中)濃縮到11 μ 1，并且使用RiboAmp RNA擴增試劑盒(加利福尼亞州日照谷的分子設備公司(Molecular Devices, Sunnyvale, CA))線性擴增。純化后,轉錄cDNA并且使用體外轉錄標記的GeneChip .表達3’擴增試劑(加州圣克拉拉的艾菲美特(Affymetrix, Santa Clara,CA))進行生物素化。約20μ g標記RNA然后用艾菲美特人基因組U133Plus 2. O陣列進行GeneChip 分析。進行芯片雜交和掃描?；蜿嚵械慕y(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)庫中的CEL 文件能使用 Bioconductor 2. 2(http://www. bioconductor,org)引入到統(tǒng)計R 2. 7. O (http://www. r-project. org)中。所述探針對數(shù)強度誤差估計(PLIER)表達測量在對每個微陣列數(shù)據(jù)組的背景校正和分位數(shù)標準化后計算。對所有樣品進行探針組水平分位數(shù)標準化以使所有數(shù)據(jù)組中效果大小相似。最終，對每個探針組，應用兩個樣品t檢驗來鑒定差異性表達。獲得每個探針組的估計值和P值后，每個探針組的P值能對假發(fā)現(xiàn)率(FDR)校正。在O. 05FDR水平選擇基因，并且在癌癥和正常樣品之間有癌癥效果大小>2倍改變。生物標記候選物的篩選由微陣列概況生成的所述生物標記候選還通過用于微陣列分析的相同組樣品的實時定量RT-PCR (qPCR)篩選。為此，總RNA使用逆轉錄酶和基因特異引物以及下列熱循環(huán)條件來逆轉錄60°C I分鐘，50°C 30分鐘，95°C 2分鐘，然后15次循環(huán)的95°C 15秒、500C 30秒、72°C 10秒。這些步驟后用72°C最終延伸5分鐘并且然后冷卻到4°C。預擴增產物用ExoSAP-IT (USB公司(USB Corporation))清洗并且在水中1/40稀釋。2 μ I cDNA用于qPCR。qPCR在96孔板中以10μ I反應體積進行，使用強力SYBR(E)-GrcenMasterMix (美國加利福尼亞州福斯特城的應用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems))在95°C持續(xù)15分鐘以起始變性，然后在ABI 7500HT快速實時PCR系統(tǒng)(美國加利福尼亞州福斯特城的應用·生物系統(tǒng)公司)中進行40次循環(huán)的95°C 30秒和60°C 30秒。對所有候選mRNA進行一式兩份的全部qPCR。PCR的特異性根據(jù)每個基因的熔解曲線確定，并且檢查平均閾值循環(huán)(Ct)。用于預擴增所用外引物對的擴增子長度為約100_130bp，用于qPCR所用內引物對為60-80bp。使用Primer Express3. O軟件設計RT-qPCR引物(美國加利福尼亞州福斯特城的應用生物系統(tǒng)公司)。所有引物由西格瑪吉諾思公司(Sigma-GenosysX德克薩斯州伍德蘭)合成，并且只要可能，擴增子跨內含子區(qū)域。從生物標記Ct值中減去GAPDH Ct值生成Λ Ct來標準化原始數(shù)據(jù)。曼-惠特尼(Mann-Whitney)秩和檢驗用于生物標記組間的比較。qPCR的數(shù)據(jù)分析使用2_et方法完成，其中GAPDH用作參考基因。使用非參數(shù)威爾科克森檢驗比較兩組之間基于qPCR的基因表達值。為就RNA輸入標準化，還對GAPDH進行qPCR。標準化原始數(shù)據(jù)是通過從標記Ct值中減去GAPDH Ct值以提供Λ Ct，并且然后用R 2. 7. O 的 stats、實用程序包(www. r-project. org)和 Bioconductor 2. 2 的 ROC 程序包(WWW. bioconductor, org)分析。使用曼-惠特尼U檢驗來完成統(tǒng)計學比較,考慮到對照和胰腺癌組的兩個不同分布。區(qū)分對象組之間(P值〈O. 05)的生物標記用曲線下面積(AUC)值鑒定和比較。所述AUC是基于構建就靈敏度與一減特異性作圖的接受者操作特性(ROC)曲線。所述AUC值用ROC曲線的數(shù)值積分計算。所述值的范圍能是O. 5-1. O。O. 5的值指示生物標記不優(yōu)于擲硬幣，而I. O指示相對最好的診斷準確性。七種mRNA生物標記用肺癌對象和對照對象之間的差異表達來鑒定。組合三種mRNA生物標記(GREB1、CCNI和FRS2)的邏輯回歸模型區(qū)分對照對象和肺癌患者，生成的ROC-圖AUC值為約O. 91，有約91%靈敏度和約88%特異性。實施例2 :唾液蛋白質組學概況和分析蛋白的分離和分析收集獲自10例健康對照對象和10例肺癌對象的唾液，并且以2600g 4°C離心15分鐘。收集獲自10例健康對照對象和10例肺癌對象的唾液上清液形成用于蛋白質組學概況的對照樣品和癌癥樣品。所收集唾液樣品中的250 μ g蛋白用甲醇沉淀，并且然后在2-D細胞裂解緩沖液(30mM Tris-HCl，pH 8. 8，包含7M尿素，2M硫脲和4%CHAPS洗滌劑)中重新懸浮。肺癌和對照的每個收集樣品的總蛋白分別用花青染料Cy2和Cy5標記。然后合并所述兩個標記樣品組并進行二維差異凝膠電泳。標記樣品加樣后，根據(jù)安瑪西亞生物科學公司(Amersham Biosciences)提供的方法運行等電聚焦(IEF) (pH3_10)。轉移到13. 5%SDS凝膠前，IPG條在SDS凝膠運行緩沖液中沖洗。所述SDS凝膠在15°C運行直到染料前端跑出所述凝膠。SDS-PAGE后，凝膠圖像立即用Typhoon TRIO (安瑪西亞生物科學公司)掃描。從膠內(in-gel) DeCyder 分析獲得蛋白表達水平的倍數(shù)變化。切掉凝膠上倍數(shù)變化大于I. 5的點，并且然后洗滌多次以除去染色染料和其他化學物質。干燥凝膠點以吸收最大體積的消化緩沖液。在包含測序級修飾胰蛋白酶(美國普洛麥格公司(Promega))的消化緩沖液中再水化干燥2D凝膠點。37°C膠內消化蛋白過夜。從凝膠中用TFA提取緩沖液并振蕩來提取消化肽。使用C-18Zip-tips (密理博公司(Millipore))使消化的胰蛋白酶肽脫鹽。所述脫鹽肽與CHCA基質(α -氰-4-羥基肉桂酸)混合并且在MALDI板的孔上點樣以進行MALDI-TOF MS(ABI4800)鑒定。蛋白鑒定基于肽指紋質量作圖(使用MS譜)和肽片段作圖(使用MS/MS譜)。合并的MS和MS/MS譜使用配有MASCOT搜索引擎的GPS探測器(GPS Explorer)軟件進行數(shù)據(jù)庫搜索，以從一級序列數(shù)據(jù)庫中鑒定蛋白?！ど飿擞浐蜻x物的篩選四個蛋白(膜聯(lián)蛋白Al、觸珠蛋白HP2、白介素I受體拮抗劑、鋅^12糖蛋白)。鈣衛(wèi)蛋白用市售ELISA試劑盒確認。癌癥組和對照中觸珠蛋白HP2、鋅α 2糖蛋白和鈣衛(wèi)蛋白的分布分別顯示P值為O. 00903、O. 05和O. 048的顯著差異。在2-D凝膠分析(上面)中鑒定的四種蛋白在最初樣品組上進行Western印跡法分析。還原的蛋白樣品(每個泳道15 μ g總蛋白)加載入10%雙Tris凝膠中并且在MES SDS運行緩沖液中以150V運行I小時。預染色蛋白標準品(英杰公司(Invitrogen))用于追蹤蛋白遷移。所述蛋白用iB]ot (英杰公司(Invitrogen))轉移到硝酸纖維素膜上。然后所述膜用包含 IOmM Tris-HCl, pH 7. 6，150mM NaCl 和 O. l%(v/v) Tween -20 (西格瑪 _ 艾爾德里奇公司(Sigma-Aldrich))的洗滌緩沖液清洗，然后在包含5%脫脂牛奶的洗滌緩沖液中封閉I小時。在洗滌緩沖液中進一步清洗后，所述膜用一抗(小鼠抗膜聯(lián)蛋白Al (阿柏堪穆公司(Abeam))、小鼠抗觸珠蛋白(LifeSpan生物科學公司(LifeSpan Biosciences))、小鼠抗ZAG(圣克魯茲生物技術公司(Santa Cruz Biotech))、小鼠抗肌動蛋白(西格瑪-艾爾德里奇公司)孵育，所有都根據(jù)生產商說明書，在封閉緩沖液中室溫孵育2小時。所述膜然后洗滌，再根據(jù)生產商說明書室溫應用二抗(來自綿羊的抗小鼠IgG過氧化物酶連接物質特異性全抗體，GE醫(yī)療保健公司(GE Healthcare)) I小時。最終，洗滌所述膜并用ECLPlus 檢測試劑盒(GE醫(yī)療保健公司)觀察。所述條帶的信號強度用圖像J軟件(美國馬里蘭州貝塞斯達的NIH)測量。代表感興趣蛋白的條帶強度除以相同印跡中相應β肌動蛋白表達的強度來標準化。根據(jù)生產商說明書(細胞科學(Cell Sciences))完成鈣衛(wèi)蛋白的ELISA。所有唾液在樣品稀釋液中稀釋100倍。所有樣品都重復二次加載。實施例3 :唾液的微生物生物標記收集獲自10例健康對照對象和10例肺癌對象的唾液，并且在2600g 4°C離心15分鐘。傾出所述上清液，沉淀用于DNA分離。
使用UltraClean 微生物DNA分離試劑盒(MO生物實驗室公司(MO BioLaboratories))根據(jù)生產商說明書提取DNA。分離的DNA然后提交福塞斯研究所(ForsythInstitute)(美國馬薩諸塞州劍橋)，使用其人口腔微生物鑒定微陣列服務分析微生物?；趤碜詫φ蘸头伟ο蟮奈㈥嚵懈艣r，鑒定出11種微生物在兩個對象組中差異性存在。使用實時PCR測定最初DNA樣品的細菌株含量。對所有物種設計特定引物，并且運行實時PCR以定量肺癌樣品和對照樣品中的細菌量。實時PCR鑒定出7種細菌在樣品組中差異性存在。鑒定出兩種細菌剴托卟啉單胞菌和昭和彎曲菌在肺癌對象中相較對照更加豐富。實施例4:篩選方法在訪問中篩選接受常規(guī)牙科護理的患者。例如，62歲女性患者，和前吸煙者，在口腔檢測前要求提供唾液樣品。收集唾液樣品并且在護理點分析或提交相關實驗室分析。檢測唾液樣品的本發(fā)明生物標記和可選的其他生物標記。分析結果提供給牙醫(yī)，并且告知患 者是否有肺癌。SEQ ID NO: I 細胞周期蛋白 I (NM_001237. 3) ccatttcaat agtcgcgggatacttgaactgcaagaacag ccgccgctcc ggcgggctgc tcgctgcatc tctgggcgtc tttggctcgccacgctgggcagtgcctgcc tgcgcctttc gcaacctcct cggccctgcg tggtctcgag ctgggtgagcgagcgggcgggctggtaggc tggcctgggc tgcgaccggc ggctacgact attctttggc cgggtcggtgcgagtggtcggctgggcaga gtgcacgctg cttggcgccg caggctgatc ccgccgtcca ctcccgggagcagtgatgttgggcaactct gcgccggggc ctgcgacccg cgaggcgggc tcggcgctgc tagcattgcagcagacggcgctccaagagg accaggagaa tatcaacccg gaaaaggcag cgcccgtcca acaaccgcggacccgggccgcgctggcggt actgaagtcc gggaacccgc ggggtctagc gcagcagcag aggccgaagacgagacgggttgcacccctt aaggatcttc ctgtaaatga tgagcatgtc accgttcctc cttggaaagcaaacagtaaacagcctgcgt tcaccattca tgtggatgaa gcagaaaaag aagctcagaa gaagccagctgaatctcaaaaaatagagcg tgaagatgcc ctggctttta attcagccat tagtttacct ggacccagaaaaccattggtccctcttgat tatccaatgg atggtagttt tgagtcacca catactatgg acatgtcaattgtattagaagatgaaaagc cagtgagtgt taatgaagta ccagactacc atgaggatat tcacacataccttagggaaatggaggttaa atgtaaacct aaagtgggtt acatgaagaa acagccagac atcactaacagtatgagagctatcctcgtg gactggttag ttgaagtagg agaagaatat aaactacaga atgagaccctgcatttggctgtgaactaca ttgataggtt cctgtcttcc atgtcagtgc tgagaggaaa acttcagcttgtgggcactgctgctatgct gttagcctca aagtttgaag aaatataccc cccagaagta gcagagtttgtgtacattacagatgatacc tacaccaaga aacaagttct gagaatggag catctagttt tgaaagtccttacttttgacttagctgctc caacagtaaa tcagtttctt acccaatact ttctgcatca gcagcctgcaaactgcaaagttgaaagttt agcaatgttt ttgggagaat taagtttgat agatgctgac ccatacctcaagtatttgcc atcagttattgctggagctg cctttcattt agcactctac acagtcacgg gacaaagctggcctgaatca ttaatacgaaagactggata taccctggaa agtcttaagc cttgtctcat ggaccttcaccagacctacc tcaaagcaccacagcatgca caacagtcaa taagagaaaa gtacaaaaat tcaaagtatcatggtgtttc tctcctcaacccaccagaga cactaaatct gtaacaatga aagactgcct ttgttttctaagatgtaaat cactcaaagtatatggtgta cagtttttaa cttaggtttt aattttacaa tcatttctgaatacagaagt tgtggccaag tacaaattatggtatctatt actttttaaa tggttttaat ttgtatatcttttgtatatgtatctgtctt agatatttggctaattttaagtggttttgt taaagtatta atgatgccag
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SEQ ID NO:2EGFR(NM—005228.3)ccccggcgca gcgcggccgc agcagcctccgccccccgca
cggtgtgagcgcccgacgcg gccgaggcggccggagtccc gagctagccc cggcggccgccgccgcccag
accggacgacaggccacctc gtcggcgtccgcccgagtcc ccgcctcgcc gccaacgccacaaccaccgc
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aaatcatctgtgcccagcag tgctccgggcgctgccgtgg caagtccccc agtgactgctgccacaacca
gtgtgctgcaggctgcacag gcccccgggagagcgactgc ctggtctgcc gcaaattccgagacgaagcc
acgtgcaaggacacctgccc cccactcatgctctacaacc ccaccacgta ccagatggatgtgaaccccg
agggcaaatacagctttggt gccacctgcg tgaagaagtg tccccgtaat tatgtggtgacagatcacgg
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tgcgaagggccttgccgcaa agtgtgtaacggaataggta ttggtgaatt taaagactcactctccataa
atgctacgaatattaaacac ttcaaaaactgcacctccat cagtggcgat ctccacatcctgccggtggc
atttaggggtgactccttca cacatactcctcctctggat ccacaggaac tggatattctgaaaaccgta
aaggaaatcacagggttttt gctgattcaggcttggcctg aaaacaggac ggacctccatgcctttgaga
acctagaaatcatacgcggc aggaccaagcaacatggtca gttttctctt gcagtcgtcagcctgaacat
aacatccttgggattacgct ccctcaaggagataagtgat ggagatgtga taatttcaggaaacaaaaat
權利要求
1.一種用于診斷對象中肺癌狀態(tài)的方法，所述方法包含 a)用特異性檢測生物標記的試驗來分析所述對象的唾液樣品，所述生物標記選自CCNI、EGFR、FGF9、GREBl 蛋白、LZTS、BRAF、FRS2、ANXA1、觸珠蛋白 Hp2、鋅 α 2 糖蛋白、鈣衛(wèi)蛋白、剖托R卜啉單胞菌(Porphyromonas catoniae) 16S rRNA、昭和彎曲菌(Campylobactershowae) 16S rRNA、唾液鏈球菌(Streptocococcus salivaris) 16S rRNA、直腸彎曲菌(Campylobacter rectus) 16S rRNA、小韋榮菌(Veillonella parvula) 16S rRNA、口金桿菌(Kigella oralis) 16S rRNA 和Btt鄰顆粒鏈菌(Granulicatella adiacens) 16S rRNA ;和 b)測定所述樣品中的所述生物標記是否相對于對照差異性表達；從而提供肺癌狀態(tài)。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，測量至少兩種所述生物標記。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述至少兩種生物標記之一是剴托卟啉單胞菌16S rRNA，和所述至少兩種生物標記之一是昭和彎曲菌16SrRNA。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，測量至少三種所述生物標記。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述至少三種生物標記之一是GREB1，其中所述至少三種生物標記之一是CCNI，和其中所述至少三種生物標記之一是FRS2。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述至少三種生物標記之一是觸珠蛋白2，其中所述至少三種生物標記之一是膜聯(lián)蛋白Al，和其中所述至少三種生物標記之一是鋅α2糖蛋白。
7.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述試驗檢測編碼至少一種生物標記的核酸，并且其中所述核酸通過質譜、PCR、微陣列雜交、熱測序、毛細管陣列測序或固相測序檢測。
8.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述試驗檢測至少一種生物標記的多肽，并且其中所述多肽通過ELISA、Western印跡法、流式細胞術、免疫熒光、免疫組織化學或質譜檢測。
9.一種評價對象中治療有效性的方法，所述方法包含 (a)用特異性檢測生物標記的試驗分析來自所述對象的第一唾液樣品，所述生物標記選自CCNI、EGFR、FGF9、GREB1 蛋白、LZTS、BRAF、FRS2、ANXA1、觸珠蛋白 Hp2、鋅 α 2 糖蛋白、鈣衛(wèi)蛋白、剖托卟啉單胞菌16S rRNA、昭和彎曲菌16S rRNA、唾液鏈球菌16S rRNA、直腸彎曲菌16S rRNA、小韋榮菌16S rRNA、口金桿菌16S rRNA和毗鄰顆粒鏈菌16S rRNA，從而提供第一表達概況； (b)對所述對象施加治療； (C)用特異性檢測至少兩種生物標記的試驗分析來自所述對象的第二唾液，所述生物標記選自CCNI、EGFR、FGF9、GREB I 蛋白、LZTS、BRAF、FRS2、ANXAl、觸珠蛋白 Hp2、鋅 α 2糖蛋白、鈣衛(wèi)蛋白、剖托卟啉單胞菌16S rRNA、昭和彎曲菌16S rRNA、唾液鏈球菌16S rRNA、直腸彎曲菌16SrRNA、小韋榮菌16S rRNA、口金桿菌16S rRNA和毗鄰顆粒鏈菌16S rRNA ；從而提供第二表達概況； (e)比較所述第一和第二表達概況，從而評價治療有效性。
10.一種包含固體支持物的藥盒，其中所述固體支持物包含對生物標記具有選擇性的捕獲結合探針，所述生物標記選自CCNI、EGFR、FGF9、GREBl蛋白、LZTS, BRAF, FRS2、剴托卟啉單胞菌16S rRNA、昭和彎曲菌16S rRNA、唾液鏈球菌16S rRNA、直腸彎曲菌16S rRNA、小韋榮菌16S rRNA、口金桿菌16S rRNA和毗鄰顆粒鏈菌16S rRNA。
11.一種包含第一和第二固體支持物的藥盒，其中所述第一固體支持物包含對至少兩種生物標記具有選擇性的捕獲結合探針，所述生物標記選自CCNI、EGFR、FGF9、GREBl蛋白、LZTS、BRAF、FRS2、剴托卟啉單胞菌16S rRNA、昭和彎曲菌16S rRNA、唾液鏈球菌16S rRNA、直腸彎曲菌16S rRNA、小韋榮菌16S rRNA、口金桿菌16S rRNA和毗鄰顆粒鏈菌16S rRNA,并且其中所述第二固體支持物包含用于ANXA1、觸珠蛋白Hp2、鋅α 2糖蛋白、鈣衛(wèi)蛋白的捕獲結合配體。
12.如權利要求11所述的藥盒，其特征在于，所述捕獲結合配體是抗體。
13.一種包含用于選擇性擴增至少兩種生物標記的一種或多種引物的藥盒，所述生物標記選自CCNI、EGFR、FGF9、GREBl蛋白、1^了3、8狀？、？1 2、剴托卟啉單胞菌16S rRNA、昭和彎曲菌16S rRNA、唾液鏈球菌16SrRNA、直腸彎曲菌16S rRNA、小韋榮菌16S rRNA、口金桿菌16S rRNA和毗鄰顆粒鏈菌16S rRNA，其中，每種所述引物可選包含可檢測標記。
14.一種用于診斷對象中肺癌狀態(tài)的方法，所述方法包含 a)用特異性檢測唾液樣品中至少17種生物標記的試驗來分析所述對象的唾液樣品，其中所述至少17種生物標記選自CCNI、EGFR、FGF9、GREB1蛋白、LZTS、BRAF、FRS2、ANXA1、觸珠蛋白Hp2、鋅α 2糖蛋白、鈣衛(wèi)蛋白、剖托卟啉單胞菌16S rRNA、昭和彎曲菌16S rRNA、唾液鏈球菌16S rRNA、直腸彎曲菌16S rRNA、小韋榮菌16S rRNA、口金桿菌16S rRNA和毗鄰顆粒鏈菌16S rRNA ;和 b)測定所述樣品中所述至少17種生物標記是否相對于對照差異性表達；從而提供肺癌狀態(tài)。
全文摘要
本文顯示涉及肺癌的生物標記。本文鑒定的唾液生物標記(CCNI、EGFR、FGF9、GREB1蛋白、LZTS、BRAF、FRS2、ANXA1、觸珠蛋白Hp2、鋅α2糖蛋白、鈣衛(wèi)蛋白、剴托卟啉單胞菌16S rRNA、昭和彎曲菌16S rRNA、唾液鏈球菌16S rRNA、直腸彎曲菌16S rRNA、小韋榮菌16S rRNA、口金桿菌16SrRNA和毗鄰顆粒鏈菌16S rRNA)為具有靈敏度和特異性的肺癌檢測生物試驗創(chuàng)造基礎。也包含了某些方式和方法，所述方式和方法使用多種生物標記評價生成的數(shù)據(jù)，以證實發(fā)現(xiàn)并且在臨床、診斷和治療應用中進一步使用多重肺癌試驗。
文檔編號C12Q1/68GK102906275SQ201180018189
公開日2013年1月30日 申請日期2011年2月10日 優(yōu)先權日2010年2月10日
發(fā)明者D·T·王, 張磊, 肖華, H·周 申請人:加利福尼亞大學董事會