本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及與甘藍葉片表皮毛有無緊密相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物表皮毛是從其各個器官表皮延伸出來的毛狀結(jié)構(gòu)，它們行使著多種功能，包括保護植物免受病原體、食草動物、紫外線輻射、以及干旱和冰凍的侵害。表皮毛廣泛存在于蕓薹屬物種，如白菜、甘藍型油菜和芥菜中一些類型和品種。甘藍的某些野生類型(比如brassicaincana和b.villosa)長期生在在嚴(yán)苛的自然環(huán)境中，也保留了植株表皮毛的特征，表明表皮毛對于其生存能力的積極作用。然而目前的所有栽培甘藍類型均表現(xiàn)為無表皮毛，比如結(jié)球甘藍、花椰菜、西蘭花、羽衣甘藍、芥藍、抱子甘藍等。利用野生甘藍資源培育具有表皮毛的栽培甘藍，對提高栽培甘藍的抗蟲、抗病、耐干旱及凍害能力，減少農(nóng)藥施用量與成本投入都有積極意義。

在模式之物擬南芥中，表皮毛的形成主要受到ttg1-gl1-gl3三聚體復(fù)合激活因子激活，但同時受到一些反向調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)，如try和cpc等。上述激活因子與反向調(diào)控因子共同作用并形成了一個反饋調(diào)節(jié)循環(huán)機制，在這個循環(huán)中，激活子相關(guān)基因的表達可激活抑制因子的表達，但激活子的表達同時又受到抑制因子的調(diào)控。此外，在蛋白水平，try或者cpc還可取代gl1蛋白與gl3結(jié)合，從而使這個復(fù)合三聚物失活。

目前通過圖位克隆技術(shù)已經(jīng)確認白菜的ttg1是白菜表皮毛形成的調(diào)節(jié)因子(zhangetal.,2009)，同時也發(fā)現(xiàn)gl1基因與白菜和油菜葉片的表皮毛有關(guān)(lietal.,2011；gruberetal.,2006)，但還沒有鑒定控制野生甘藍b.incana表皮毛的基因。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為甘藍品種選育提供一種新選擇。

本發(fā)明的技術(shù)方案是甘藍葉片表皮毛有無緊密相關(guān)的分子標(biāo)記boltrichome-caps01，具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。

該分子標(biāo)記總長659bp，snp出現(xiàn)在378bp，下劃線所示為snp，無毛甘藍為a，有毛甘藍為g。酶切位點在373-374bp之間。該分子標(biāo)記的擴增產(chǎn)物在酶切時所使用的限制性內(nèi)切酶為xagi(又叫econi)。

ttaaaatttggaagatggaggcaagaaatgtgtgttgtttctcatgatccaatatctctctatctccacagcttttcttcccggtactcttcctgctattatttcccacctggtattttgcaagaaaacatttttctctctaagaatggaaatacataagtaaataataaaatgtttgatacaagtgattagcttggatcccattctgcttattaagctaagaagtccctaagcgtagcaaaaagttaaaaaaaaaaacacctagacactaaaacttaggtctagtagttcctaattaatgaaactacgtacaaactataactaattagaacaagaacatgaagcagcaattgaaagatcaagtaggcctaagagagagcaaggacacttagaccagaaggcgatggtgattcaaaaggtcactctgaaacgacaagaacgattttcttcatcatcaggagatggttattttttttttttgtttgttcaacagatcatcaggcgatggtaagcgtaagaatataagtacattcctatgtcatatgttttgtggtaaagtcgttacatctaattttgggagagaaagaaattaaaagaagatacgtacctatcgcctacgagtctgtacattcttaagatgagatcttcctcctgttggc

本發(fā)明還提供了甘藍葉片表皮毛有無緊密相關(guān)的分子標(biāo)記boltrichome-caps01的正向引物，其正向引物序列具有如seqidno.2所示的核苷酸序列(5’-ttaaaatttggaagatggaggc-3’)，反向引物序列具有如seqidno.3所示的核苷酸序列(5’-gccaacaggaggaagatctca-3’)。

本發(fā)明還提供了甘藍品種的鑒定方法，包括如下步驟：以待鑒定品種的基因組dna為模板，擴增分子標(biāo)記boltrichome-caps01，采用限制性內(nèi)切酶xagi酶切擴增產(chǎn)物，酶切結(jié)果進行電泳，電泳后出現(xiàn)659-bp的單一條帶的為無表皮毛的純合品種，出現(xiàn)276-bp和373-bp兩條帶為有表皮毛的純合品種，同時出現(xiàn)659-bp、276-bp和373-bp三種條帶的為無表皮毛的雜合品種；所述的擴增分子標(biāo)記的引物對具有如seqidno.2和seqidno.3所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了所述的分子標(biāo)記在甘藍育種中的用途。

本發(fā)明還提供了所述的分子標(biāo)記在選育不同表皮毛性狀的甘藍品種中的用途。

本發(fā)明還提供了所述的分子標(biāo)記引物在甘藍育種中的用途。

本發(fā)明還提供了所述的分子標(biāo)記引物在選育不同表皮毛性狀的甘藍品種中的用途。

本發(fā)明還提供了所述甘藍品種的鑒定方法在甘藍育種中的用途。

本發(fā)明還提供了所述甘藍品種的鑒定方法在選育不同表皮毛性狀的甘藍品種中的用途。

本發(fā)明的有益效果：

該分子標(biāo)記可直接在甘藍表皮毛育種中應(yīng)用。通過表皮毛相關(guān)分子標(biāo)記的早期鑒定和輔助選擇，可盡早確認純合的有毛個體，并選擇出雜合個體進入下一輪選擇，減輕田間材料的種植規(guī)模和后期鑒定工作，有效提高選擇的效率和準(zhǔn)確性。

附圖說明

圖1為甘藍表皮毛性狀snp芯片分析結(jié)果及候選基因位置

上圖表示c01染色體的δ(snp-index)分布情況，紅色虛線表示p＝0.001顯著水平時的閾值；下圖展示表皮毛候選區(qū)間(灰色)及候選基因botry在c01染色體上的位置。

圖2為功能標(biāo)記所使用限制性內(nèi)切酶xagi的酶切位點示意圖；圖中序列是基因botry中含snp的那部分序列，這個snp的存在恰好使有毛的這段序列可以被酶切開，而無毛的不能被切開。

c01(有毛)aaagatcaagtaggcctaagagagggcaaggacacttagaccagaaggcgc41(無毛)aaagatcaagtaggcctaagagagagcaaggacacttagaccagaaggcg

c01為有毛甘藍親本，c41為無毛甘藍親本，序列中白色背景表示雙親snp位點，線條指示序列為xagi可識別的堿基序列，黑色倒三角代表酶切位點。

圖3為功能標(biāo)記在有毛和無毛甘藍中的檢測情況示意圖

m代表marker，c01代表有毛甘藍親本，c41代表無毛甘藍親本，f1代表雜種f1，undigested表示沒有被酶切。

具體實施方式

以下為本發(fā)明方法的一種具體實施方式，但并不是對本發(fā)明方法的限定，任何不超離本發(fā)明實質(zhì)內(nèi)容的變換，仍應(yīng)屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1分子標(biāo)記的獲得

一份無毛甘藍c41(b.oleraceavar.alboglabra，從荷蘭種質(zhì)資源庫征集，征集編號cgn17275)與一份有毛野生甘藍b.incana(從德國植物遺傳與作物研究所征集，征集編號bra1166)發(fā)展的f2分離群體為例，詳細說明獲得與表皮毛有無精密相關(guān)分子標(biāo)記的方法，具體如下：

(一)群體構(gòu)建及表型鑒定：

以一份無毛甘藍與一份有毛野生甘藍b.incana雜交產(chǎn)生f1代，f1代再自交，種植于大田，獲得f2代植株。植株的10葉期通過肉眼觀察第一葉上表皮毛的有無。

(二)snp芯片分析

隨機選擇94份f2植株，于苗期采集幼嫩葉片，采用ctab法提取dna(doyle,1991)，純化后進行油菜60ksnp芯片分析(illuminainc.,ca,usa)，將獲得的snp對應(yīng)到甘藍參考基因組(http://brassicadb.org/brad/index.php)，并依照takagi方法進行的(takagietal.，2013)將snp結(jié)果與表皮毛表型進行關(guān)聯(lián)分析，從c01號染色體上檢測到一個顯著的關(guān)聯(lián)區(qū)間，該區(qū)間跨度1.04mb(如圖1)。

(三)候選基因分析：

從公共數(shù)據(jù)庫(http://brassicadb.org/brad/index.php)查詢上述1.04-mb區(qū)間內(nèi)的所有甘藍基因，根據(jù)對應(yīng)功能注釋和與植物表皮毛有關(guān)的現(xiàn)有文獻，篩選到一個與表皮毛發(fā)育有關(guān)的基因botry(如圖1)。

(四)功能標(biāo)記轉(zhuǎn)化與檢測：

對無毛甘藍親本和有毛甘藍親本提取dna，利用illuminahiseq2500測序平臺進行重測序分析，發(fā)現(xiàn)兩者的botry基因在編碼區(qū)存在snp。根據(jù)甘藍botry基因序列，設(shè)計可擴增出上述snp位點的引物，其正向引物序列為5’-ttaaaatttggaagatggaggc-3’，反向引物序列為5’-gccaacaggaggaagatctca-3’。根據(jù)上述snp類型及附近序列，確定能辨別其堿基類型的限制性內(nèi)切酶為xagi(如圖2)。

在無毛和有毛親本、f1植株以及19個f2材料中進行pcr擴增和xagi酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離后，發(fā)現(xiàn)無毛親本及7份無毛f2僅出現(xiàn)659-bp的單一條帶(不可酶切型)；有毛親本及7份有毛f2植株出現(xiàn)276-bp和373-bp兩種特異條帶(可酶切型)；f1及5份無毛f2植株同時出現(xiàn)659-bp、276-bp和373-bp三種條帶(雜合型)，確定其為雜合基因型植株(如圖3)。

實施例2所述分子標(biāo)記的應(yīng)用

一種與甘藍葉片表皮毛有無緊密相關(guān)的分子標(biāo)記在甘藍育種中的應(yīng)用，其步驟是：

以無毛甘藍c41和有毛甘藍c01(材料來源同實施例1)雜交發(fā)展的50份f2植株(非實施例1中用于snp芯片分析的材料)為研究材料，該部分植株中有17份表現(xiàn)有毛，33份表現(xiàn)無毛。利用實施例1中所發(fā)展的標(biāo)記進行鑒定，步驟如下：

1)以甘藍單株dna為模板；

2)利用下述引物進行pcr過程：

引物的正向序列為：5’-ttaaaatttggaagatggaggc-3’

引物反向序列為：5’-gccaacaggaggaagatctca-3’；

3)pcr反應(yīng)體系：總體積為10μl，具體成分如下表：

表1擴增體系

4)pcr擴增程序：94℃5min，[94℃45s，55℃45s，72℃1min]×35循環(huán)，72℃10min。運行完畢后4℃條件下保存。

5)pcr擴增產(chǎn)物的酶切：每10μl用2.5u的限制性酶xagi在37℃條件下處理1h；

4)酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離后，僅出現(xiàn)659-bp單一條帶(不可酶切型)的有14份材料，其表現(xiàn)均為無毛；僅出現(xiàn)276-bp和373-bp兩種特異條帶(可酶切型)的有17個，均為有毛個體；同時出現(xiàn)659-bp、276-bp和373-bp三種條帶(雜合型)的有19份材料，均表現(xiàn)為無毛，推測其為雜合基因型植株。

5)選擇上述“4)”中出現(xiàn)659-bp單一條帶的材料3份(無毛)，僅出現(xiàn)276-bp和373-bp兩種特異條帶的材料3份(有毛)，同時出現(xiàn)659-bp、276-bp和373-bp三種條帶的雜合材料3份(無毛)，分別自交產(chǎn)生f2：3家系，種植于大田后調(diào)查苗期表皮毛表型。發(fā)現(xiàn)前2類材料的表型不發(fā)生分離，且均與上代表型一致；上代表現(xiàn)為三種條帶的3份無毛材料，其f2:3家系均出現(xiàn)表皮毛性狀的分離現(xiàn)象。該具體結(jié)果見附表1。

表1酶切結(jié)果

6)對表1中的258份f2:3植株進行分子標(biāo)記鑒定，上一世代為可酶切型和不可酶切型的植株，其f2:3植株的酶切結(jié)果與上一世代完全相同；上一世代為雜合型的植株，其產(chǎn)生的97份f2:3植株的酶切結(jié)果出現(xiàn)分離，其中19份有毛個體均被酶切(即為可酶切型)，其余78份無毛個體中，有23份不能被酶切(即為不可酶切型)，55份表現(xiàn)為雜合型。

上述鑒定結(jié)果表明，在育種中通過功能分子標(biāo)記鑒定與篩選，保留僅出現(xiàn)276-bp和373-bp兩種特異條帶的材料即為純合有毛材料；保留同時出現(xiàn)659-bp、276-bp和373-bp三種條帶的材料，可提高下一輪選擇的效率和準(zhǔn)確性，減輕后期篩選鑒定的工作量(理論上可減少33％)，加速育種進程。

sequencelisting

<110>西南大學(xué)

<120>與甘藍葉片表皮毛有無緊密相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用

<130>2017

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>659

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>分子標(biāo)記boltrichome-caps01

<220>

<221>snp位點

<222>(378)..(378)

<223>n為a或g

<400>1

ttaaaatttggaagatggaggcaagaaatgtgtgttgtttctcatgatccaatatctctc60

tatctccacagcttttcttcccggtactcttcctgctattatttcccacctggtattttg120

caagaaaacatttttctctctaagaatggaaatacataagtaaataataaaatgtttgat180

acaagtgattagcttggatcccattctgcttattaagctaagaagtccctaagcgtagca240

aaaagttaaaaaaaaaaacacctagacactaaaacttaggtctagtagttcctaattaat300

gaaactacgtacaaactataactaattagaacaagaacatgaagcagcaattgaaagatc360

aagtaggcctaagagagngcaaggacacttagaccagaaggcgatggtgattcaaaaggt420

cactctgaaacgacaagaacgattttcttcatcatcaggagatggttatttttttttttt480

gtttgttcaacagatcatcaggcgatggtaagcgtaagaatataagtacattcctatgtc540

atatgttttgtggtaaagtcgttacatctaattttgggagagaaagaaattaaaagaaga600

tacgtacctatcgcctacgagtctgtacattcttaagatgagatcttcctcctgttggc659

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>正向引物

<400>2

ttaaaatttggaagatggaggc22

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>反向引物

<400>3

gccaacaggaggaagatctca21