本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鑒定植物品種的方法。
背景技術(shù)：
柿是柿科(ebenaceae)柿屬(diospyros)的喬木樹種。柿屬植物共有約500種、1000多個(gè)栽培品種。柿的果實(shí)是中國(guó)、韓國(guó)和日本的重要傳統(tǒng)食物。柿的樹皮、葉、果實(shí)和種子是藥物的來源。柿也是城市園林綠化的重要喬木樹種。柿樹通常根據(jù)果實(shí)和花的特征進(jìn)行分類，果期和花期以外的時(shí)間存在鑒定難的問題。由于表型標(biāo)記和dna分子標(biāo)記的數(shù)量少，現(xiàn)有標(biāo)記靈敏度有限，存在同物異名和同名異物現(xiàn)象，柿屬植物的鑒定仍然是全球研究的難點(diǎn)。柿屬植物種質(zhì)資源的精確鑒定對(duì)于育種和利用以及眾多領(lǐng)域的科學(xué)研究是重要的基礎(chǔ)工作。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明設(shè)計(jì)了可用于柿屬植物pcr擴(kuò)增的引物，鑒別方法操作簡(jiǎn)單，易于推廣，提供待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式通式，為實(shí)現(xiàn)上述效果，本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)柿屬植物的方法，是利用泛素連接酶基因序列中的變異位點(diǎn)構(gòu)建核苷酸分子式，進(jìn)而鑒定或輔助鑒定待測(cè)柿屬植物的方法，具體包括如下步驟：
(1)以待測(cè)柿屬植物的基因組dna為模板，用由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈dna分子組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr產(chǎn)物；
(2)將所述pcr產(chǎn)物測(cè)序，截掉所述pcr產(chǎn)物序列自5’端起的第53個(gè)核苷酸記為第1位，截掉所述pcr產(chǎn)物的核苷酸序列自5’末端起的前52個(gè)核苷酸以及第749個(gè)(含)以后的核苷酸，得到長(zhǎng)度為696bp的dub序列；
(3)將所述dub序列與dna序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的全部序列放在一起，進(jìn)行比對(duì)，自動(dòng)生成一個(gè)dna比對(duì)序列矩陣；
所述dna序列庫(kù)為如下(a1)或(a2)：
(a1)由序列表中序列3至序列6中的至少一種組成；
(a2)由序列表中序列3至序列6中的至少一種，和序列7至序列14中的至少一種組成。
(4)根據(jù)所述dna比對(duì)序列矩陣列出所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式；
所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式的通式為：
b4b9b39b42b162b186b196b201b225b227b274b299b321b340b344b628；
在所述通式中，所述b4、所述b9、所述b39、所述b42、所述b162、所述b186、所述b196、所述b201、所述b225、所述b227、所述b274、所述b299、所述b321、所述b340、b344和b628，依次表示在所述dna序列比對(duì)數(shù)據(jù)矩陣中的第4、9、39、42、162、186、196、201、225、227、274、299、321、340、344和628個(gè)位點(diǎn)；
在所述通式中，每一個(gè)b為a、t、c和g中的任一種或兩種；
當(dāng)所述待測(cè)柿屬植物為純合型時(shí)，在所述通式中，每一個(gè)b為a、t、c和g中的任一種，在測(cè)序時(shí)顯示單一峰；當(dāng)所述待測(cè)柿屬植物為雜合型時(shí)，在所述通式中，每一個(gè)b可能為a、t、c和g中的兩種，在測(cè)序時(shí)會(huì)得到明顯的疊加雙峰。
(5)將步驟(4)所得所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式與核苷酸分子式組i進(jìn)行比對(duì)；
所述核苷酸分子式組i由如下a1)-a12)共12種核苷酸分子式組成：
a1)c4t9a39c42a162c186g196t201g225c227c274g299t321a340c344t628；
a2)c4c9g39c42a162c186a196t201g225c227c274g299c321a340c344t628；
a3)c4c9g39c42a162c186a196t201g225c227c274g299y321a340c344t628；
a4)c4c9g39c42r162y186g196t201g225c227c274g299c321a340c344t628；
a5)t4t9g39c42a162c186g196t201g225c227c274a299c321a340c344t628；
a6)c4t9g39c42a162c186g196t201c225t227c274g299c321a340c344t628；
a7)c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340t344t628；
a8)c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340y344t628；
a9)c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340c344t628；
a10)c4t9g39c42a162c186g196t201g225t227g274g299c321a340c344t628；
a11)c4t9g39y42a162c186g196t201g225t227g274g299c321a340c344t628；
a12)c4y9g39c42a162c186g196t201g225c227c274g299t321a340c344t628；
在a1)-a12)中，y表示t和c；r表示a和g(即所述待測(cè)柿屬植物的相應(yīng)位點(diǎn)為雜合型)；
(6)根據(jù)步驟(5)的比對(duì)結(jié)果，按照如下方法對(duì)所述待測(cè)柿屬植物進(jìn)行品種鑒定：
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a1)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為臺(tái)灣烏木；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a2)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為烏柿x3號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a3)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為烏柿5號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a4)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為老鴉柿；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a5)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為金棗柿；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a6)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為浙江柿164號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a7)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為浙江柿873號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a8)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為君遷子4號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a9)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為君遷子8號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a10)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為美洲柿20-80號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a11)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為美洲柿20-82號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a12)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為油柿20-75號(hào)。
進(jìn)一步，以上本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定待測(cè)柿屬植物的方法，其操作步驟可轉(zhuǎn)化為如下：
(1)以待測(cè)柿屬植物的基因組dna為模板，用由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈dna分子組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr產(chǎn)物；
(2)將所述pcr產(chǎn)物測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與核苷酸序列組i進(jìn)行比對(duì)；
所述核苷酸序列組i由序列表中序列3-14，共12個(gè)序列組成；
(3)根據(jù)步驟(2)的比對(duì)結(jié)果，按照如下方法對(duì)所述待測(cè)柿屬植物進(jìn)行鑒定：
若所述pcr產(chǎn)物的核苷酸序列中含有序列3，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為臺(tái)灣烏木；
若所述pcr產(chǎn)物的核苷酸序列中含有序列4，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為烏柿x3號(hào)；
若所述pcr產(chǎn)物的核苷酸序列中含有序列5，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為烏柿5號(hào)；
若所述pcr產(chǎn)物的核苷酸序列中含有序列6，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為老鴉柿；
若所述pcr產(chǎn)物的核苷酸序列中含有序列7，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為金棗柿；
若所述pcr產(chǎn)物的核苷酸序列中含有序列8，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為浙江柿164號(hào)；
若所述pcr產(chǎn)物的核苷酸序列中含有序列9，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為浙江柿873號(hào)；
若所述pcr產(chǎn)物的核苷酸序列中含有序列10，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為君遷子4號(hào)；
若所述pcr產(chǎn)物的核苷酸序列中含有序列11，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為君遷子8號(hào)；
若所述pcr產(chǎn)物的核苷酸序列中含有序列12，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為美洲柿20-80號(hào)；
若所述pcr產(chǎn)物的核苷酸序列中含有序列13，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為美洲柿20-82號(hào)；
若所述pcr產(chǎn)物的核苷酸序列中含有序列14，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為油柿20-75號(hào)。
在上述方法中，所述待測(cè)柿屬植物為如下12種植物中的任一種：臺(tái)灣烏木、烏柿x3號(hào)、烏柿5號(hào)、老鴉柿、金棗柿、浙江柿164號(hào)、浙江柿873號(hào)、君遷子4號(hào)、君遷子8號(hào)、美洲柿20-80號(hào)、美洲柿20-82號(hào)、油柿20-75號(hào)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)柿屬植物的試劑盒。
本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)柿屬植物的試劑盒，具體可包括引物對(duì)、記載有核苷酸分子式組i的對(duì)比卡；
所述引物對(duì)具體由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈dna分子組成；
所述核苷酸分子式組i具體由如下a1)-a12)共12種核苷酸分子式組成：
a1)c4t9a39c42a162c186g196t201g225c227c274g299t321a340c344t628；
a2)c4c9g39c42a162c186a196t201g225c227c274g299c321a340c344t628；
a3)c4c9g39c42a162c186a196t201g225c227c274g299y321a340c344t628；
a4)c4c9g39c42r162y186g196t201g225c227c274g299c321a340c344t628；
a5)t4t9g39c42a162c186g196t201g225c227c274a299c321a340c344t628；
a6)c4t9g39c42a162c186g196t201c225t227c274g299c321a340c344t628；
a7)c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340t344t628；
a8)c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340y344t628；
a9)c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340c344t628；
a10)c4t9g39c42a162c186g196t201g225t227g274g299c321a340c344t628；
a11)c4t9g39y42a162c186g196t201g225t227g274g299c321a340c344t628；
a12)c4y9g39c42a162c186g196t201g225c227c274g299t321a340c344t628；
在a1)-a12)中，y表示t和c；r表示a和g(即所述待測(cè)柿屬植物的相應(yīng)位點(diǎn)為雜合型)；
所述待測(cè)柿屬植物可為如下12種植物中的任一種：臺(tái)灣烏木、烏柿x3號(hào)、烏柿5號(hào)、老鴉柿、金棗柿、浙江柿164號(hào)、浙江柿873號(hào)、君遷子4號(hào)、君遷子8號(hào)、美洲柿20-80號(hào)、美洲柿20-82號(hào)、油柿20-75號(hào)。
所述試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測(cè)柿屬植物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述待測(cè)柿屬植物為如下12種植物中的任一種：臺(tái)灣烏木、烏柿x3號(hào)、烏柿5號(hào)、老鴉柿、金棗柿、浙江柿164號(hào)、浙江柿873號(hào)、君遷子4號(hào)、君遷子8號(hào)、美洲柿20-80號(hào)、美洲柿20-82號(hào)、油柿20-75號(hào)。
本發(fā)明的目的還在于提供一種柿屬植物的核苷酸分子式通式，所述核苷酸分子式通式是b4b9b39b42b162b186b196b201b225b227b274b299b321b340b344b628，所述b4、所述b9、所述b39、所述b42、所述b162、所述b186、所述b196、所述b201、所述b225、所述b227、所述b274、所述b299、所述b321、所述b340、b344和b628是dna序列中第4、9、39、42、162、186、196、201、225、227、274、299、321、340、344和628個(gè)核苷酸位點(diǎn)，所述b是a、g、t、c中任意一種或任意兩種。
作為優(yōu)選方案，所述dna序列是待測(cè)序列，所述待測(cè)序列是通過以待測(cè)柿屬植物基因組dna為模板，用序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈dna分子組成的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr產(chǎn)物，對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將所述pcr產(chǎn)物自5’端起的第53個(gè)核苷酸記為第1位，截掉所述pcr產(chǎn)物的核苷酸序列自5’末端起的前52個(gè)核苷酸以及第749個(gè)(含)以后的核苷酸，得到的待測(cè)序列。
進(jìn)一步，所述核苷酸分子式通式的應(yīng)用步驟如下：
(1)以待測(cè)柿屬植物的基因組dna為模板，用由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈dna分子組成的引物對(duì)其進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr產(chǎn)物；
(2)將所述pcr產(chǎn)物測(cè)序后，所述pcr產(chǎn)物序列自5’端起的第53個(gè)核苷酸記為第1位，截掉所述pcr產(chǎn)物的核苷酸序列自5’末端起的前52個(gè)核苷酸以及第749個(gè)(含)以后的核苷酸，得到待測(cè)序列，讀取待測(cè)序列第4、9、39、42、162、186、196、201、225、227、274、299、321、340、344和628個(gè)核苷酸位點(diǎn)，列出所述待測(cè)柿屬植物的dna序列的核苷酸分子式；
(3)將所述待測(cè)柿屬植物的dna序列的核苷酸分子式，核苷酸分子式組i進(jìn)行比對(duì)；
所述核苷酸分子式組i由如下a1)-a12)共12種核苷酸分子式組成：
a1)c4t9a39c42a162c186g196t201g225c227c274g299t321a340c344t628；
a2)c4c9g39c42a162c186a196t201g225c227c274g299c321a340c344t628；
a3)c4c9g39c42a162c186a196t201g225c227c274g299y321a340c344t628；
a4)c4c9g39c42r162y186g196t201g225c227c274g299c321a340c344t628；
a5)t4t9g39c42a162c186g196t201g225c227c274a299c321a340c344t628；
a6)c4t9g39c42a162c186g196t201c225t227c274g299c321a340c344t628；
a7)c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340t344t628；
a8)c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340y344t628；
a9)c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340c344t628；
a10)c4t9g39c42a162c186g196t201g225t227g274g299c321a340c344t628；
a11)c4t9g39y42a162c186g196t201g225t227g274g299c321a340c344t628；
a12)c4y9g39c42a162c186g196t201g225c227c274g299t321a340c344t628；
在a1)-a12)中，y表示t和c；r表示a和g；
(4)根據(jù)步驟(3)的比對(duì)結(jié)果，按照如下方法對(duì)所述待測(cè)柿屬植物進(jìn)行鑒定：
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a1)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為臺(tái)灣烏木；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a2)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為烏柿x3號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a3)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為烏柿5號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a4)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為老鴉柿；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a5)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為金棗柿；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a6)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為浙江柿164號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a7)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為浙江柿873號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a8)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為君遷子4號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a9)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為君遷子8號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a10)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為美洲柿20-80號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a11)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為美洲柿20-82號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a12)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為油柿20-75號(hào)。
進(jìn)一步，所述待測(cè)柿屬植物為如下12種中的任一種：臺(tái)灣烏木、烏柿x3號(hào)、烏柿5號(hào)、老鴉柿、金棗柿、浙江柿164號(hào)、浙江柿873號(hào)、君遷子4號(hào)、君遷子8號(hào)、美洲柿20-80號(hào)、美洲柿20-82號(hào)、油柿20-75號(hào)。
有益效果
本發(fā)明以柿屬植物的鑒定過程為例，實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的利用該分子式鑒定植物(如柿屬植物)的方法較為精確、操作簡(jiǎn)捷，可以提高相關(guān)產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)效率和質(zhì)量監(jiān)控水平，有效彌補(bǔ)以往方法的不足，并提供了柿屬植物的核苷酸分子式的通式，簡(jiǎn)化了鑒別程序；另外，該方法同時(shí)實(shí)現(xiàn)了非花期果期(如苗期)的精準(zhǔn)鑒定；提供一種便于柿屬植物鑒定的試劑盒，試劑盒包含引物對(duì)、記錄核苷酸分子式的對(duì)比卡。本方法對(duì)于促進(jìn)柿屬植物的育種、柿產(chǎn)業(yè)和城市園林綠化事業(yè)的發(fā)展及環(huán)境保護(hù)具有重要意義。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
柿屬植物：臺(tái)灣烏木的幼葉采自北京植物園；烏柿x3號(hào)、烏柿5號(hào)、老鴉柿、金棗柿、浙江柿164號(hào)、浙江柿873號(hào)、君遷子4號(hào)、君遷子8號(hào)、美洲柿20-80號(hào)、美洲柿20-82號(hào)、油柿20-75號(hào)的幼葉采自陜西省楊陵市國(guó)家柿種質(zhì)資源圃。
實(shí)施例1、利用核苷酸分子式鑒定柿屬植物方法的建立及其應(yīng)用
為了構(gòu)建能夠用于有效鑒定柿屬植物的核苷酸分子式，本發(fā)明的發(fā)明人從以下柿屬植物系列中獲得泛素連接酶基因的一段非保守區(qū)dna序列，并對(duì)其中的多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。作為供試材料的柿屬植物共12種，具體如下：臺(tái)灣烏木、烏柿x3號(hào)、烏柿5號(hào)、老鴉柿、金棗柿、浙江柿164號(hào)、浙江柿873號(hào)、君遷子4號(hào)、君遷子8號(hào)、美洲柿20-80號(hào)、美洲柿20-82號(hào)、油柿20-75號(hào)。
一、引物設(shè)計(jì)
根據(jù)泛素連接酶基因的一段非保守區(qū)dna序列兩端的保守區(qū)，設(shè)計(jì)如下引物：
正向引物：5’-acttagggtagggaggttgc-3’(序列1)；
反向引物：5’-ggatagccaggaagggtga-3’(序列2)。
二、pcr擴(kuò)增及pcr產(chǎn)物的序列測(cè)定
以作為供試材料的臺(tái)灣烏木、烏柿x3號(hào)、烏柿5號(hào)、老鴉柿、金棗柿、浙江柿164號(hào)、浙江柿873號(hào)、君遷子4號(hào)、君遷子8號(hào)、美洲柿20-80號(hào)、美洲柿20-82號(hào)和油柿20-75號(hào)等12種柿屬植物的幼嫩葉片為實(shí)驗(yàn)材料，采用植物基因組dna提取試劑盒(中國(guó)天根生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為dp305)提取各樣品材料的基因組dna。以所得基因組dna為模板，采用步驟一設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增。結(jié)果顯示，每份柿屬植物均可得到一條長(zhǎng)度約為8222-824bp的pcr產(chǎn)物。
對(duì)純化后的各pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得了含有若干多態(tài)位點(diǎn)的長(zhǎng)度為696bp的dna序列，記為dub序列。根據(jù)供試的12種柿屬植物的測(cè)序結(jié)果，將dub序列定義為所述pcr產(chǎn)物的核苷酸序列自5’端起的第53-748位(696bp)。將所述pcr產(chǎn)物的核苷酸序列自5’端起的第53個(gè)核苷酸記為第1位。這個(gè)變異的高頻率發(fā)生區(qū)域，未來也可能出現(xiàn)較長(zhǎng)或較短的序列變化，可能會(huì)因待測(cè)樣品的不同而略有變化，屆時(shí)可根據(jù)實(shí)際情況獲得比對(duì)序列矩陣，確定后面的多態(tài)位點(diǎn)的位置順序編號(hào)。
結(jié)果顯示，臺(tái)灣烏木的dub序列為序列表中序列3；
烏柿x3號(hào)的dub序列為序列表中序列4；
烏柿5號(hào)的dub序列為序列表中序列5；
老鴉柿的dub序列為序列表中序列6；
金棗柿的dub序列為序列表中序列7；
浙江柿164號(hào)的dub序列為序列表中序列8；
浙江柿873號(hào)的dub序列為序列表中序列9；
君遷子4號(hào)的dub序列為序列表中序列10；
君遷子8號(hào)的dub序列為序列表中序列11；
美洲柿20-80號(hào)的dub序列為序列表中序列12；
美洲柿20-82號(hào)的dub序列為序列表中序列13；
油柿20-75號(hào)的dub序列為序列表中序列14。
三、序列比對(duì)
將步驟二所得的12種柿屬植物的dub序列進(jìn)行比對(duì)，dna比對(duì)序列矩陣是根據(jù)特定的計(jì)分規(guī)則，將兩個(gè)或多個(gè)序列按位置比較排列后產(chǎn)生的數(shù)據(jù)集，最大限度地反映了序列間的相似性。其中涉及到的特定的計(jì)分規(guī)則和算法等相關(guān)常識(shí)和原理在“生物序列分析”方面的專著中均有記載。所述dna比對(duì)序列矩陣可直接反映各序列在同一核苷酸位點(diǎn)之間是否存在差異，以及存在怎樣的差異。找到核苷酸字母有差異的列在所述dna比對(duì)序列矩陣中的位置，核準(zhǔn)該位置位于所述dna比對(duì)序列矩陣5’端起的位置順序編號(hào)，即確定了一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。
利用clustalx或mega等軟件比對(duì)，獲得dna比對(duì)序列矩陣(alignedsequencematrix)，如表1中的柿屬植物鑒定用16個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)。
表112種柿屬植物的dub序列中的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)
注：y表示t和c；r表示a和g。即當(dāng)所述待測(cè)柿屬植物為純合型時(shí)，在所述通式中，每一個(gè)b為a、t、c和g中的任一種，在測(cè)序時(shí)顯示單一峰；當(dāng)待測(cè)柿屬植物的相應(yīng)位點(diǎn)為雜合型，在測(cè)序時(shí)相應(yīng)雜合位點(diǎn)會(huì)檢測(cè)到明顯的疊加雙峰?！岸鄳B(tài)位點(diǎn)的位置編號(hào)”為在所述dna比對(duì)序列矩陣中的位置編號(hào)。
只有通過比對(duì)排序，才能顯示出樣品間序列差異的規(guī)律性，這是生物信息學(xué)理論和原理的組成部分。圖1為12種柿屬植物的dubdna比對(duì)序列矩陣的部分截圖。
圖112種柿屬植物的dna對(duì)比序列矩陣的部分截圖
四、用于柿屬植物鑒定的核苷酸分子式構(gòu)建
根據(jù)表1中所列的柿屬植物的每個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的核苷酸字母及其在dna比對(duì)序列矩陣中的位置，列出各柿屬植物相應(yīng)的核苷酸分子式，具體如下：
臺(tái)灣烏木、烏柿x3號(hào)、烏柿5號(hào)、老鴉柿、金棗柿、浙江柿164號(hào)、浙江柿873號(hào)、君遷子4號(hào)、君遷子8號(hào)、美洲柿20-80號(hào)、美洲柿20-82號(hào)、油柿20-75號(hào)。
臺(tái)灣烏木的核苷酸分子式為c4t9a39c42a162c186g196t201g225c227c274g299t321a340c344t628；
烏柿x3號(hào)的核苷酸分子式為c4c9g39c42a162c186a196t201g225c227c274g299c321a340c344t628；
烏柿5號(hào)的核苷酸分子式為c4c9g39c42a162c186a196t201g225c227c274g299y321a340c344t628；
老鴉柿的核苷酸分子式為c4c9g39c42r162y186g196t201g225c227c274g299c321a340c344t628；
金棗柿的核苷酸分子式為t4t9g39c42a162c186g196t201g225c227c274a299c321a340c344t628；
浙江柿164號(hào)的核苷酸分子式為
c4t9g39c42a162c186g196t201c225t227c274g299c321a340c344t628；
浙江柿873號(hào)的核苷酸分子式為
c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340t344t628；
君遷子4號(hào)的核苷酸分子式為c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340y344t628；
君遷子8號(hào)的核苷酸分子式為c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340c344t628；
美洲柿20-80號(hào)的核苷酸分子
式:c4t9g39c42a162c186g196t201g225t227g274g299c321a340c344t628；
美洲柿20-82號(hào)的核苷酸分子式:c4t9g39y42a162c186g196t201g225t227g274g299c321a340c344t628；
油柿20-75號(hào)的核苷酸分子式為c4y9g39c42a162c186g196t201g225c227c274g299t321a340c344t628；
以上各核苷酸分子式中的y均表示t和c；r均表示a和g。即核苷酸分子式中含有的y或r為柿屬植物基因組內(nèi)的雜合位點(diǎn)，在測(cè)序時(shí)會(huì)得到明顯的疊加雙峰。
五、用核苷酸分子式鑒定柿屬植物
(1)以待測(cè)柿屬植物的基因組dna為模板，用由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈dna分子組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr產(chǎn)物；
(2)將所述pcr產(chǎn)物測(cè)序后，截掉所述pcr產(chǎn)物的核苷酸序列自5’末端起的前52個(gè)核苷酸(所述52個(gè)核苷酸為pcr產(chǎn)物5’端的保守區(qū)序列；當(dāng)然也可以同時(shí)截掉pcr產(chǎn)物3’端的第749個(gè)(含)以后的核苷酸)，剩余序列作為待比對(duì)序列，即dub序列(非保守區(qū))；
(3)將所述待比對(duì)序列即dub序列與dna序列庫(kù)中的全部序列放在一起進(jìn)行比對(duì)，得到dna比對(duì)序列矩陣；
所述dna序列庫(kù)為如下(a1)或(a2)：
(a1)由序列表中序列3至序列6中的至少一種組成；
(a2)由序列表中序列3至序列6中的至少一種，和序列7至序列14中的至少一種組成，序列3-6為長(zhǎng)度695bp的序列；序列8為長(zhǎng)度694bp的序列；序列7，9-14為長(zhǎng)度696bp的序列；
(4)根據(jù)所述dna比對(duì)序列矩陣列出所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式；
所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式的通式，即多態(tài)性位點(diǎn)的組合式的通式為：
b4b9b39b42b162b186b196b201b225b227b274b299b321b340b344b628；
在所述通式中，所述b4、所述b9、所述b39、所述b42、所述b162、所述b186、所述b196、所述b201、所述b225、所述b227、所述b274、所述b299、所述b321、所述b340、b344和b628，依次表示在所述dna序列比對(duì)數(shù)據(jù)矩陣中的第4、9、39、42、162、186、196、201、225、227、274、299、321、340、344和628個(gè)位點(diǎn)(對(duì)應(yīng)dub序列的第4、9、39、42、162、186、196、201、225、227、274、299、321、340、344和628個(gè)核苷酸位點(diǎn))；
在所述通式中，每一個(gè)b為a、t、c和g中的任一種或兩種(當(dāng)所述待測(cè)柿屬植物的具體核苷酸位點(diǎn)為純合型位點(diǎn)時(shí)，在所述通式中，每一個(gè)b為a、t、c和g中的任一種，在測(cè)序時(shí)顯示單一峰；當(dāng)所述待測(cè)柿屬植物的具體核苷酸位點(diǎn)為雜合型位點(diǎn)時(shí)，在所述通式中，每一個(gè)b為a、t、c和g中的兩種，在測(cè)序時(shí)會(huì)得到明顯的疊加雙峰)。
(5)按照如下方法對(duì)所述待測(cè)柿屬植物進(jìn)行鑒定：
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為c4t9a39c42a162c186g196t201g225c227c274g299t321a340c344t628，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為臺(tái)灣烏木；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為c4c9g39c42a162c186a196t201g225c227c274g299c321a340c344t628，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為烏柿x3號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為c4c9g39c42a162c186a196t201g225c227c274g299y321a340c344t628，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為烏柿5號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為c4c9g39c42r162y186g196t201g225c227c274g299c321a340c344t628，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為老鴉柿；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為t4t9g39c42a162c186g196t201g225c227c274a299c321a340c344t628，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為金棗柿；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為c4t9g39c42a162c186g196t201c225t227c274g299c321a340c344t628，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為浙江柿164號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340t344t628，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為浙江柿873號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340y344t628，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為君遷子4號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340c344t628，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為君遷子8號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為c4t9g39c42a162c186g196t201g225t227g274g299c321a340c344t628，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為美洲柿20-80號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為c4t9g39y42a162c186g196t201g225t227g274g299c321a340c344t628，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為美洲柿20-82號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為c4y9g39c42a162c186g196t201g225c227c274g299t321a340c344t628，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為油柿20-75號(hào)。
六、柿屬植物的新分類檢索表
根據(jù)步驟五所得各樣品的核苷酸分子式編制出12種柿屬植物的新分類檢索表，見表2。
表212種柿屬植物的新分類檢索表
七、一種用于鑒定待測(cè)柿屬植物的試劑盒
本發(fā)明同時(shí)提供了一種用于鑒定待測(cè)柿屬植物的試劑盒包括引物對(duì)、記載有核苷酸分子式組i的對(duì)比卡；
用于pcr擴(kuò)增的引物對(duì)由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈dna分子組成；
核苷酸分子式組i由如下a1)-a12)共12種核苷酸分子式組成：
a1)c4t9a39c42a162c186g196t201g225c227c274g299t321a340c344t628；
a2)c4c9g39c42a162c186a196t201g225c227c274g299c321a340c344t628；
a3)c4c9g39c42a162c186a196t201g225c227c274g299y321a340c344t628；
a4)c4c9g39c42r162y186g196t201g225c227c274g299c321a340c344t628；
a5)t4t9g39c42a162c186g196t201g225c227c274a299c321a340c344t628；
a6)c4t9g39c42a162c186g196t201c225t227c274g299c321a340c344t628；
a7)c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340t344t628；
a8)c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340y344t628；
a9)c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340c344t628；
a10)c4t9g39c42a162c186g196t201g225t227g274g299c321a340c344t628；
a11)c4t9g39y42a162c186g196t201g225t227g274g299c321a340c344t628；
a12)c4y9g39c42a162c186g196t201g225c227c274g299t321a340c344t628；
在a1)-a12)中，y表示t和c；r表示a和g；
待測(cè)柿屬植物為如下12種植物中的任一種：臺(tái)灣烏木、烏柿x3號(hào)、烏柿5號(hào)、老鴉柿、金棗柿、浙江柿164號(hào)、浙江柿873號(hào)、君遷子4號(hào)、君遷子8號(hào)、美洲柿20-80號(hào)、美洲柿20-82號(hào)、油柿20-75號(hào)。
八、一種柿屬植物的核苷酸分子式通式及應(yīng)用方法
一種柿屬植物的核苷酸分子式通式，其特征在于所述核苷酸分子式通式是b4b9b39b42b162b186b196b201b225b227b274b299b321b340b344b628，所述b4、所述b9、所述b39、所述b42、所述b162、所述b186、所述b196、所述b201、所述b225、所述b227、所述b274、所述b299、所述b321、所述b340、b344和b628是dna序列中第4、9、39、42、162、186、196、201、225、227、274、299、321、340、344和628個(gè)核苷酸位點(diǎn)，所述b是a、g、t、c中任意一種或任意兩種。
dna序列是待測(cè)序列，待測(cè)序列是通過以待測(cè)柿屬植物基因組dna為模板，用序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈dna分子組成的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr產(chǎn)物，對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將所述pcr產(chǎn)物自5’端起的第53個(gè)核苷酸記為第1位，截掉所述pcr產(chǎn)物的核苷酸序列自5’末端起的前52個(gè)核苷酸以及第749個(gè)(含)以后的核苷酸，得到的待測(cè)序列。
核苷酸分子式通式的應(yīng)用方法，步驟如下：
(1)以待測(cè)柿屬植物的基因組dna為模板，用由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈dna分子組成的引物對(duì)其進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr產(chǎn)物；
(2)將所述pcr產(chǎn)物測(cè)序后，所述pcr產(chǎn)物序列自5’端起的第53個(gè)核苷酸記為第1位，截掉所述pcr產(chǎn)物的核苷酸序列自5’末端起的前52個(gè)核苷酸以及第749個(gè)(含)以后的核苷酸，得到待測(cè)序列，讀取待測(cè)序列第4、9、39、42、162、186、196、201、225、227、274、299、321、340、344和628個(gè)核苷酸位點(diǎn)，列出所述待測(cè)柿屬植物的dna序列的核苷酸分子式；
(3)將所述待測(cè)柿屬植物的dna序列的核苷酸分子式，核苷酸分子式組i進(jìn)行比對(duì)；
所述核苷酸分子式組i由如下a1)-a12)共12種核苷酸分子式組成：
a1)c4t9a39c42a162c186g196t201g225c227c274g299t321a340c344t628；
a2)c4c9g39c42a162c186a196t201g225c227c274g299c321a340c344t628；
a3)c4c9g39c42a162c186a196t201g225c227c274g299y321a340c344t628；
a4)c4c9g39c42r162y186g196t201g225c227c274g299c321a340c344t628；
a5)t4t9g39c42a162c186g196t201g225c227c274a299c321a340c344t628；
a6)c4t9g39c42a162c186g196t201c225t227c274g299c321a340c344t628；
a7)c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340t344t628；
a8)c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340y344t628；
a9)c4t9g39c42a162c186g196c201c225c227c274g299c321a340c344t628；
a10)c4t9g39c42a162c186g196t201g225t227g274g299c321a340c344t628；
a11)c4t9g39y42a162c186g196t201g225t227g274g299c321a340c344t628；
a12)c4y9g39c42a162c186g196t201g225c227c274g299t321a340c344t628；
在a1)-a12)中，y表示t和c；r表示a和g；
(4)根據(jù)步驟(3)的比對(duì)結(jié)果，按照如下方法對(duì)所述待測(cè)柿屬植物進(jìn)行鑒定：
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a1)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為臺(tái)灣烏木；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a2)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為烏柿x3號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a3)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為烏柿5號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a4)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為老鴉柿；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a5)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為金棗柿；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a6)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為浙江柿164號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a7)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為浙江柿873號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a8)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為君遷子4號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a9)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為君遷子8號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a10)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為美洲柿20-80號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a11)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為美洲柿20-82號(hào)；
若所述待測(cè)柿屬植物的核苷酸分子式為a12)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)柿屬植物為或候選為油柿20-75號(hào)。
待測(cè)柿屬植物為如下12種植物中的任一種：臺(tái)灣烏木、烏柿x3號(hào)、烏柿5號(hào)、老鴉柿、金棗柿、浙江柿164號(hào)、浙江柿873號(hào)、君遷子4號(hào)、君遷子8號(hào)、美洲柿20-80號(hào)、美洲柿20-82號(hào)、油柿20-75號(hào)。
實(shí)施例2、鑒定柿屬的油柿20-76號(hào)
為了驗(yàn)證實(shí)施例1建立的核苷酸分子式對(duì)于柿屬植物鑒定的有效性和特異性，本發(fā)明的發(fā)明人還采集了柿屬植物油柿20-76號(hào)的葉片，并按照實(shí)施例1的方法，提取其基因組dna，用由序列1和序列2所示的兩條單鏈dna分子構(gòu)成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增和測(cè)序，獲得了1份柿屬植物的dub序列。其中，油柿20-76號(hào)的dub序列為序列表中序列15所示。
將序列15這份柿屬植物的dub序列與前述12種柿屬植物的序列放在一起，利用軟件(如mega軟件)進(jìn)行比對(duì)，獲得dna比對(duì)序列矩陣，進(jìn)一步列出：油柿20-76號(hào)的核苷酸分子式，為：c4c9g39c42a162c186g196t201g225c227c274g299t321a340c344t628。
實(shí)施例3、鑒定柿屬的德陽柿1101號(hào)
采集柿屬植物德陽柿1101號(hào)的葉片，并按照實(shí)施例1的方法，提取其基因組dna，用由序列1和序列2所示的兩條單鏈dna分子構(gòu)成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增和測(cè)序，獲得了6份柿屬植物的dub序列。其中，德陽柿1101號(hào)的dub序列為序列表中序列16所示。
將序列16這6份柿屬植物的dub序列與前述12種柿屬植物的序列放在一起，利用軟件(如mega軟件)進(jìn)行比對(duì)，獲得dna比對(duì)序列矩陣，進(jìn)一步列出：油柿20-76號(hào)的核苷酸分子式，為：c4c9g39c42a162c186g196t201g225c227c274g299t321a340c344t628。
實(shí)施例4、鑒定柿屬的德陽柿1115號(hào)
采集柿屬植物德陽柿1115號(hào)的葉片，并按照實(shí)施例1的方法，提取其基因組dna，用由序列1和序列2所示的兩條單鏈dna分子構(gòu)成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增和測(cè)序，獲得了6份柿屬植物的dub序列。其中德陽柿1115號(hào)的dub序列為序列表中序列17所示。
將序列17這份柿屬植物的dub序列與前述12種柿屬植物的序列放在一起，利用軟件(如mega軟件)進(jìn)行比對(duì)，獲得dna比對(duì)序列矩陣，進(jìn)一步列出：德陽柿1115號(hào)的核苷酸分子式，為c4t9g39c42a162c186g196t201g225c227c274g299t321a340c344t628。
實(shí)施例5、鑒定柿屬的安溪油柿
采集柿屬植物‘安溪油柿’的葉片，并按照實(shí)施例1的方法，提取其基因組dna，用由序列1和序列2所示的兩條單鏈dna分子構(gòu)成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增和測(cè)序，獲得了1份柿屬植物的dub序列?！蚕褪痢膁ub序列為序列表中序列18所示。
將序列18這份柿屬植物的dub序列與前述12種柿屬植物的序列放在一起，利用軟件(如mega軟件)進(jìn)行比對(duì)，獲得dna比對(duì)序列矩陣，進(jìn)一步列出：‘安溪油柿’的核苷酸分子式，為：c4t9g39c42a162c186g196t201g225c227c274g299t321m340c344c628；其中，m表示a和c。
實(shí)施例6、鑒定柿屬的甜寶蓋
采集柿屬植物‘甜寶蓋’的葉片，并按照實(shí)施例1的方法，提取其基因組dna，用由序列1和序列2所示的兩條單鏈dna分子構(gòu)成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增和測(cè)序，獲得了1份柿屬植物的dub序列。其中‘甜寶蓋’的dub序列為序列表中序列19所示。
將序列19這6份柿屬植物的dub序列與前述12種柿屬植物的序列放在一起，利用軟件(如mega軟件)進(jìn)行比對(duì)，獲得dna比對(duì)序列矩陣，進(jìn)一步列出：‘甜寶蓋’的核苷酸分子式，為：c4t9g39c42a162c186g196t201g225c227c274r299t321m340c344c628；其中，m表示a和c；r表示a和g。
實(shí)施例7、鑒定柿屬的懷胎柿
采集柿屬植物‘懷胎柿’的葉片，并按照實(shí)施例1的方法，提取其基因組dna，用由序列1和序列2所示的兩條單鏈dna分子構(gòu)成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增和測(cè)序，獲得了1份柿屬植物的dub序列。其中‘懷胎柿’的dub序列為序列表中序列20所示。
將序列20這份柿屬植物的dub序列與前述12種柿屬植物的序列放在一起，利用軟件(如mega軟件)進(jìn)行比對(duì)，獲得dna比對(duì)序列矩陣，進(jìn)一步列出：‘懷胎柿’的核苷酸分子式，為：c4t9g39c42a162c186g196t201g225c227c274g299t321a340c344c628。
可見，油柿20-76號(hào)、德陽柿1101號(hào)、德陽柿1115號(hào)、‘安溪油柿’、‘甜寶蓋’、‘懷胎柿’這6份柿屬植物的核苷酸分子式各不相同，且與實(shí)施例1中的12種柿屬植物對(duì)應(yīng)的12種核苷酸分子式均不相同。從而證實(shí)了本發(fā)明方法的有效性和特異性。預(yù)示著本方法在未來分類應(yīng)用方面仍然具有巨大的價(jià)值和潛力。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
<110>山東省林木種質(zhì)資源中心
<120>一種鑒定柿屬植物的方法
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<212>dna
<213>臺(tái)灣烏木(diospyrosdiscolor)
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<213>烏柿x3號(hào)（diospyroscathayensisx3）
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<213>烏柿5號(hào)（diospyroscathayensis5）
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<213>老鴉柿（diospyrosrhombifolia）
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<220>
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<213>金棗柿（diospyrosjinzaoshi）
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<213>浙江柿164號(hào)（diospyrosglaucifolia164）
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<213>浙江柿873號(hào)（diospyrosglaucifolia873）
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<213>君遷子4號(hào)（diospyroslotus4）
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