輔助鑒定大豆抗花葉病毒sc7的引物及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種輔助鑒定大豆抗花葉病毒SC7的引物及其檢測方法，通過利用BARCSOYSSR_02_0631分子標(biāo)記的專用引物對(duì)大豆品系抗花葉病毒SC7的相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行早期子代選擇鑒定，不僅避免了傳統(tǒng)方法接種鑒定花葉病毒的傳播，而且減少了隨后的育種工作量和育種周期，因而可快速篩選出抗病高產(chǎn)的大豆育種材料。本發(fā)明經(jīng)濟(jì)效益高，可以應(yīng)用于大豆子代的抗病性選育，可提高育種效率和大豆花葉病毒抗性水平，且提高了育種目的的針對(duì)性。
【專利說明】
輔助鑒定大豆抗花葉病毒SC7的引物及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物檢測領(lǐng)域，具體設(shè)及一種輔助鑒定大豆抗花葉病毒SC7的引物及 其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆常規(guī)育種中因表型選擇易受季節(jié)W及生產(chǎn)安全環(huán)境等因素限制而導(dǎo)致育種 效率低等問題，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)急需注入生物技術(shù)手段，輔之于分子標(biāo)記高效率的基因型定向選 擇，才能高效快速地選育出理想地大豆新品種。隨著生物信息學(xué)和分子遺傳學(xué)W及基因組 學(xué)的迅速發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇育種的應(yīng)用將更加廣泛?；赑CR的分子標(biāo)記(如SSR)具 有共顯性、多態(tài)性高、重復(fù)性好、簡便操作等優(yōu)勢而受遺傳育種家廣泛接受使用。
[0003] 國內(nèi)外許多專家學(xué)者對(duì)大豆花葉病毒進(jìn)行了 WL定位研究。滕衛(wèi)麗等利用與抗 SMV3相關(guān)的SSR標(biāo)記Sattll4和Satt362進(jìn)行檢測，抗病毒資源篩選的與抗性鑒定符合率分 別達(dá)到82.4%和68.8% ;王大剛利用基因組SSR和SNP標(biāo)記將大豆抗性基因 Rscs精細(xì)定位在2 號(hào)染色體上，Rscs兩側(cè)最近的標(biāo)記BARCS0YSSR-02-0610和BARCS0YSSR-02-0616)之間的遺傳 距離為〇.32cM，物理距離不足200kb。馬奎研究指出單獨(dú)使用標(biāo)記Satt334或Sct_033對(duì)Rscmo 在齊黃1號(hào)X南農(nóng)1138的兩個(gè)世代MAS W及對(duì)Rsci2在齊黃22 X南農(nóng)138-2的S個(gè)世代準(zhǔn)確率 均在85% W上，同時(shí)使用兩個(gè)標(biāo)記準(zhǔn)確率達(dá)95%;化n Hong Iang等人把Rsct定位到染色體2 號(hào)和13號(hào)上；國外已經(jīng)把S個(gè)抗花葉病毒基因（Rsvl、Rsv3和Rsv4)分別定位到大豆染色體 13號(hào)、14號(hào)和2號(hào)上。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于提供一種輔助鑒定大豆抗花葉病毒SC7的引物及其檢測方法，通 過利用BARCS0YSSR_02_0631分子標(biāo)記的專用引物對(duì)大豆品系抗花葉病毒SC7的相關(guān)位點(diǎn)進(jìn) 行早期子代進(jìn)行選擇鑒定，減少了育種工作量和育種周期，因而可快速篩選出抗病高產(chǎn)的 大豆育種材料。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0006] 本發(fā)明提供了一種輔助鑒定大豆抗花葉病毒SC7的引物，所述引物如下：
[0007] 前引物：5 ' -TGGTTTAAAAATTGTGGAGACAAA-3 ' ；
[000引 后引物：5 ' -TTGTGATTGAATGATGGAGTAAGA-3 '。
[0009] 上述輔助鑒定大豆抗花葉病毒SC7的引物的檢測方法，包括如下步驟：
[0010] Sl、采用SDS法提取每份大豆的DNA，利用所述引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng) 體系為20化，包括IOXPCR Buffer(含15mM Mg2+)2.0yL，dNTP 0.化L，濃度為2.抓AU的化邑 酶0 .化L，所述前引物0.0祉1，所述后引物0.0如1，d地2〇 12.44化，濃度為20ng/iiL的模板 0魁扣1^; PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min; 94°C變性30sec，55 °C退火30sec，72 °C延伸Imin， 運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，然后72°C延伸8min后于4°C保存；
[0011] S2、在步驟Sl所得的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2.化L Loading Buffer,用聚丙締酷胺膠進(jìn) 行分離，銀染檢測。
[0012]其中，擴(kuò)增后的感病條帶較小，另外一個(gè)較大的為抗病帶型。
[OOU] 其中，所述dNTP的終濃度為lOmM。
[0014] 本發(fā)明具有W下有益效果：
[0015] 本發(fā)明隨機(jī)檢測區(qū)試試驗(yàn)中大豆品種(系)抗病(包括中感)檢出符合率為64.3 %， 感病符合率為100%，即檢測正確率為79.2%，為今后的分子標(biāo)記輔助選擇育種提供了快捷 高效的方法，為設(shè)計(jì)育種提供了一種參考手段，提高了早期選擇的效率，節(jié)約了大量的人力 物力。本發(fā)明經(jīng)濟(jì)效益高，可W應(yīng)用于大豆子代的抗病性選育，可提高育種效率和大豆花葉 病毒抗性水平，且提高了育種目的的針對(duì)性。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例中含有標(biāo)記M的用聚丙締酷胺跑的電泳圖。
[0017] 圖中，Marker帶型和24個(gè)品種（系）帶型。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步 詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā) 明。
[0019] 實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法;所使用的材料、試劑 等，如無特殊說明，均可通過商業(yè)途徑從生物試劑公司買到。
[0020] 所使用的引物為：
[0021] 前引物：5 ' -TGGTTTAAAAATTGTGGAGACAAA-3 ' ；
[0022] 后引物:5' -TTGTGATTGAATGATGGAGTAAGA-3'。
[0023] 實(shí)施例
[0024] 上述引物用于檢測大豆抗花葉病毒SC7性。
[0025] S1、從現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系阜陽大豆綜合試驗(yàn)站區(qū)試試驗(yàn)中隨機(jī)收集到24份大 豆資源材料(純合品種或品系），采用SDS法提取每份大豆的DNA，利用所述引物對(duì)其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20化，包括10 XPCR Buffer(含15mM Mg2+)2.0化，終濃度為IOmM 的dNTP 0.化L，濃度為2.5UAU的Tag酶0.化L，所述前引物0.0如1，所述后引物0.0如1， d地2〇 12.44化，濃度為2〇11旨/化的模板0魁化1^;?〔1?反應(yīng)程序?yàn)?4°(：預(yù)變性5111111;94°(：變性 30sec，55°C退火30sec，72°C延伸Imin,運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，然后72°C延伸Smin后于4°C保存；其 中，擴(kuò)增產(chǎn)物中含有一個(gè)235-27化P之間的DNA片段，為候選的具有抗花葉病毒SC7性狀的待 檢大豆品種(系）；
[00%] S2、在步驟Sl所得的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2.化L Loading Buffer,用聚丙締酷胺膠進(jìn) 行分離，銀染檢測，花葉病毒抗性鑒定采用區(qū)試結(jié)果如表1和圖1所示，其中，抗花葉病毒8C7 性狀為國家/省區(qū)試抗病水平檢測為中感、抗病和高抗等級(jí)的性狀。
[0027]表1花葉病毒抗性鑒定采用區(qū)試結(jié)果表。
[002引
[0029] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W作出若干改進(jìn)和潤飾，運(yùn)些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 輔助鑒定大豆抗花葉病毒SC7的引物，其特征在于，所述引物如下： 前引物：5 ' -TGGITTAAAAATTGTGGAGACAAA-3 ' ； 后引物：5 ' -TTGTGATTGAATGATGGAGTAAGA-3 '。2. 輔助鑒定大豆抗花葉病毒SC7的引物的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟： 51、 采用SDS法提取每份大豆的DNA，利用所述引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 為20yL，包括 10 X PCR Buf f er (含 15mM Mg2+) 2 · OyL，dNTPO · 2yL，濃度為2 · 5UAU 的Tag酶0 · 2μ L，所述前引物0.08μ1，所述后引物0.08μ1，ddH20 12.44yL，濃度為20ng/yL的模板DNA5yL; PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min; 94°C變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸lmin，運(yùn)行35個(gè) 循環(huán)，然后72°C延伸8min后于4°C保存； 52、 在步驟S1所得的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2.5yL Loading Buffer，用聚丙稀酰胺膠進(jìn)行分 離，銀染檢測。3. 如權(quán)利要求2所述輔助鑒定大豆抗花葉病毒SC7的引物的檢測方法，其特征在于，擴(kuò) 增后的感病條帶較小，另外一個(gè)較大的為抗病帶型。4. 如權(quán)利要求2所述輔助鑒定大豆抗花葉病毒SC7的引物的檢測方法，其特征在于，所 述dNTP的終濃度為1 OmM。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105861648SQ201610200675
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年3月25日
【發(fā)明人】王傳之, 孫云飛, 劉武藝, 李揚(yáng)眉, 王敏, 王梓鈺, 李智民, 李素梅, 馮邦杰, 劉新亮, 馬慧慧, 白鵬, 陳乃珍, 閆振, 張婧霖, 李銘
【申請(qǐng)人】阜陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院