本發(fā)明涉及分子基因分型領(lǐng)域，具體而言，涉及用于鹿的多態(tài)性微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記及其用途。
背景技術(shù)：
梅花鹿(cervusnippon)主要分布于東亞，范圍從西伯利亞到韓國(guó)、中國(guó)東部和越南；在日本等西太平洋島嶼也有分布。中國(guó)的梅花鹿主要分布在吉林省，而日本的梅花鹿主要分布于北海道。19世紀(jì)梅花鹿曾經(jīng)被獵到幾乎絕種，20世紀(jì)中開(kāi)始立法保護(hù)，族群在1950年代到1980年代快速恢復(fù)。梅花鹿也被引進(jìn)到澳大利亞、歐洲和美國(guó)。原先的目的是作為公園裝飾用的動(dòng)物，但現(xiàn)在許多變成野生。目前，分布于中國(guó)和日本的梅花鹿亞種已經(jīng)被iucn紅色名錄列為極?；?yàn)l危等級(jí)，我國(guó)的梅花鹿同時(shí)也是國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物。
近年來(lái)，利用分子標(biāo)記對(duì)物種的種群結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性、遷移、雜交、基因流及分子系統(tǒng)地理等的研究已經(jīng)成為保護(hù)遺傳學(xué)和分子生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。主要是因?yàn)樗莿澐址N群保護(hù)管理單元和進(jìn)化顯著性單元、確定保護(hù)等級(jí)及制定優(yōu)先保護(hù)管理措施的基礎(chǔ)。目前，在關(guān)于梅花鹿的分子育種研究中，所應(yīng)用的多態(tài)性微衛(wèi)星分子標(biāo)記大多數(shù)是借鑒已發(fā)布的牛的微衛(wèi)星引物，只有少部分是通過(guò)傳統(tǒng)的克隆方法得到的，且這些微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性都不高，不能滿足對(duì)梅花鹿進(jìn)行保護(hù)、研究、管理及分子育種的要求。
有鑒于此，特提出本發(fā)明。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明涉及微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記和用于擴(kuò)增微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記的引物。本發(fā)明的微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記可用于分子基因分型和/或遺傳指紋法，
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明涉及一種鑒定鹿科動(dòng)物樣品基因型的方法，包括：
1)、提取所述鹿科動(dòng)物樣品的dna；
2)、用選自下列的至少一個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增至少一種微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記：seqidno:30和31；seqidno:32和33；seqidno:34和35；seqidno:36和37；seqidno:38和39；seqidno:40和41；seqidno:42和43；seqidno:44和45；seqidno:46和47；seqidno:48和49；seqidno:50和51；seqidno:52和53；seqidno:54和55；seqidno:56和57；seqidno:58和59；seqidno:60和61；seqidno:62和63；seqidno:64和65；seqidno:66和67；seqidno:68和69；seqidno:70和71；seqidno:72和73；seqidno:74和75；seqidno:76和77；seqidno:78和79；seqidno:80和81；seqidno:82和83；seqidno:84和85以及seqidno:86和87；
或擴(kuò)增各引物對(duì)對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的片段或變體；及
3)、鑒定所述鹿科動(dòng)物樣品中的至少一種多態(tài)等位基因。
在一些實(shí)施方式中，所述鹿科動(dòng)物樣品包括鹿科動(dòng)物的毛發(fā)、體液、骨骼、糞便。
在一些實(shí)施方式中，所述鹿科動(dòng)物樣品的dna的提取方法包括飽和苯酚-氯仿法、樹(shù)脂提取法或磁珠提取法提取。
優(yōu)選的，如上所述的方法，其中步驟2)包括用對(duì)應(yīng)引物對(duì)擴(kuò)增2種或更多微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記；
更優(yōu)選的，其中步驟2)包括用對(duì)應(yīng)引物對(duì)擴(kuò)增3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29種微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記。
優(yōu)選的，如上所述的方法，在步驟2)中，用所述引物對(duì)擴(kuò)增至少一種微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記時(shí)，退火溫度為58℃～62℃，循環(huán)次數(shù)為33～37次；
更優(yōu)選的，退火溫度為60℃，循環(huán)次數(shù)為35次。
如上所述的方法在鹿科動(dòng)物親子鑒定中的應(yīng)用。
如上所述的方法在鹿科動(dòng)物種群中的相同或相關(guān)基因型鑒定中的應(yīng)用。
如上所述的方法在鑒定鹿科動(dòng)物等位基因多態(tài)性中的應(yīng)用。
如上所述的方法在區(qū)分鹿科動(dòng)物種群中突變體中的應(yīng)用。
如上所述的方法在研究鹿科動(dòng)物種群中的遺傳多樣性中的應(yīng)用。
優(yōu)選的，前述任一項(xiàng)所述的方法及應(yīng)用，所述鹿科動(dòng)物包括鹿亞科、麂亞科、獐亞科和美洲鹿亞科動(dòng)物；
更優(yōu)選的，所述鹿科動(dòng)物包括花鹿屬、鹿屬、黇鹿屬和麋鹿屬動(dòng)物；
更優(yōu)選的，所述鹿科動(dòng)物包括馬鹿、白唇鹿、坡鹿、阿氏鹿、菲律賓黑麂、宿氏鹿、鬣鹿、沼鹿、水鹿以及梅花鹿；
更優(yōu)選的，所述鹿科動(dòng)物為梅花鹿。
用于擴(kuò)增至少一種微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記的分離的寡核苷酸引物，其包含選自下列的序列：seqidno:30～87所示核苷酸序列或其片段或變體。
寡核苷酸引物片段可包含部分seqidno:30～87，長(zhǎng)度可以為5～25bp不等。
變體寡核苷酸引物不需要與seqidno:30～87共享任何重疊，但僅需能擴(kuò)增本發(fā)明的微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記。變體寡核苷酸引物也包括與側(cè)接本發(fā)明的微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記的區(qū)互補(bǔ)的任何寡核苷酸引物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員明晰，用于pcr的變體寡核苷酸引物的3’端可不與ssr標(biāo)志物或側(cè)接ssr標(biāo)志物的區(qū)具有任何錯(cuò)配，而5’端可具有錯(cuò)配。
本發(fā)明也提供試劑盒，其包含來(lái)自seqidno:30～87的至少一種寡核苷酸引物或其片段或變體。
優(yōu)選的，在所述的試劑盒中，每對(duì)引物中至少有一條引物的5’端被熒光染料標(biāo)記。
在一些實(shí)施方式中，所述熒光染料選自fam、fitc、sybrgreenⅰ、hex、vic、joe、tamra、tet、rox、cy3、cy5、texas-red、pet、ned、alexafluor、dylight和ftm。
分離的微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記，其由如上所述的引物擴(kuò)增；
優(yōu)選的，所述分離的微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記包含選自下列的序列：seqidno:1～29所示的核苷酸序列或其片段或變體。
根據(jù)seqidno:30～87的各引物對(duì)擴(kuò)增來(lái)自梅花鹿的微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記的等位基因。擴(kuò)增產(chǎn)物大小有所不同，并表示微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記的不同多態(tài)等位基因。因此，本發(fā)明涉及包含由本發(fā)明的引物對(duì)擴(kuò)增的序列的微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記。
在29個(gè)座位中的每一個(gè)的微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記的不同多態(tài)等位基因具有不同序列。本發(fā)明包括29種微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記中的每一種的不同多態(tài)等位基因的序列。例如，29個(gè)序列中的每一個(gè)表示以下由寡核苷酸引物seqidno:30～87擴(kuò)增的10種ssr標(biāo)志物的特定等位基因。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
本發(fā)明提供的引物對(duì)能在鹿科動(dòng)物的樣本中擴(kuò)增出條帶清晰、多態(tài)性高的微衛(wèi)星dna條帶，使得本發(fā)明提供的引物能夠應(yīng)用于梅花鹿的種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳變異水平等方面的研究，采用微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記可以對(duì)梅花鹿的種群遺傳學(xué)研究提供較為豐富的遺傳基礎(chǔ)信息。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
1、梅花鹿的基因組提取與檢測(cè)。
取梅花鹿血液300ul，用biotake血液提取試劑盒提取梅花鹿基因組，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)dna的完整性，酶標(biāo)儀測(cè)定dna濃度和純度，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
2、簡(jiǎn)化基因組測(cè)序獲得梅花鹿微衛(wèi)星序列，并設(shè)計(jì)引物。
取梅花鹿血液300ul，提取基因組后，以牛基因組作為參考，選擇haeiii+hpy166ii進(jìn)行酶切，酶切片段長(zhǎng)度在414-444bp之間，檢索全部非冗余基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的ssr位點(diǎn)，根據(jù)ssrs側(cè)冀序列設(shè)計(jì)pcr引物。
3、對(duì)獲得的梅花鹿微衛(wèi)星序列進(jìn)行分析，高效篩選多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)。
通過(guò)閱讀大量文獻(xiàn)后，從上述獲得的微衛(wèi)星序列中按以下原則篩選多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)
(1)挑選無(wú)間差堿基的、重復(fù)序列長(zhǎng)的微衛(wèi)星位點(diǎn)100個(gè)(單核苷酸重復(fù)的30個(gè)重復(fù)以上，二核苷酸重復(fù)的28個(gè)重復(fù)以上，三、四、五、六核苷酸重復(fù)的10個(gè)以上重復(fù))。但是經(jīng)過(guò)本次試驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：在梅花鹿上，單核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星幾乎沒(méi)有多態(tài)性，二核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星多態(tài)性最高，且重復(fù)數(shù)越多，多態(tài)性越高。
(2)挑選at含量高的微衛(wèi)星序列。
(3)挑選出基本重復(fù)單位為(cng)n以及(gaa)n類型的微衛(wèi)星位點(diǎn)。
4、對(duì)篩選出來(lái)的微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性驗(yàn)證，包括聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細(xì)管電泳分析。
將篩選出來(lái)的100個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物以梅花鹿基因組為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增體系和條件見(jiàn)表1和表2。
表格1pcr反應(yīng)體系
表格2pcr反應(yīng)程序
然后進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，其中70對(duì)引物可以擴(kuò)增出清晰單一的目的條帶。
(1)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析
隨機(jī)選取8個(gè)梅花鹿的血樣作為模板，用聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)試這70個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在上述8個(gè)模板上的多態(tài)性，最后發(fā)現(xiàn)41個(gè)位點(diǎn)有明顯的多態(tài)性。
(2)毛細(xì)管電泳分析
從上述41個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)中挑選出30個(gè)條帶清晰且無(wú)雜帶的位點(diǎn)，將其引物合成5’端帶熒光標(biāo)記的引物，然后用96個(gè)梅花鹿的dna作為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，最后用毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)。為了節(jié)省成本，我們將目的條帶大小不同的引物帶不同的熒光標(biāo)記，然后混合一起上樣。結(jié)果中有一對(duì)引物雜帶太多，無(wú)法對(duì)其進(jìn)行基因判型故舍棄。29對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星引物見(jiàn)表3；其熒光混合信息見(jiàn)表4。
表格3微衛(wèi)星位點(diǎn)及其引物信息
表格4微衛(wèi)星標(biāo)記分組情況
5、對(duì)獲得的多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行進(jìn)一步分析
根據(jù)所得到的電泳圖，用genemapperv4.0軟件對(duì)微衛(wèi)星基因型進(jìn)行判定，然后用cervus2.0軟件對(duì)上述30個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)的期望雜合度(he)、等位基因數(shù)(k)、等位基因頻率(p)、和多態(tài)信息含量(pic)等指標(biāo)進(jìn)行分析。其結(jié)果整理見(jiàn)表5和表6.
表格5等位基因數(shù)雜合度多態(tài)信息含量
locus：位點(diǎn)；k:等位基因數(shù)；n：檢測(cè)的數(shù)量；hets:異型合子；homs:同源基因；h(0):觀測(cè)雜合度；h(e):期望雜合度；pic:多態(tài)信息含量；excl(1)：父母一方已知時(shí)的父權(quán)排除率；excl(2)：父母雙方已知時(shí)的父權(quán)排除率；nullfreq：無(wú)效基因頻率。
表格6微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因及其等位基因頻率
盡管已用具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。
sequencelisting
<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所
<120>用于鹿的多態(tài)性微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記及其用途
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aatctcatttcatttataacaatccaagattattttcacaaagcttccaggctctatttt240
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