專利名稱：：預測糖尿病腎病危險的遺傳標記和芯片及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及4吏用一個或多個標記來檢測中國血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成或者疑似患有腎病的一種方法和芯片，特別是使用選自基因ACE,AGT，ALR2和TNF-a的一個或多個遺傳多態(tài)性標記檢測中國血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的一種方法和芯片，條件是不單獨使用ALR2的基因型。
背景技術：
：糖尿病腎病是糖尿病患者的主要致病、致死原因。隨著糖尿病在發(fā)達國家與發(fā)展中國家的流行，糖尿病目前已成為晚期腎病(ESRD)的最主要的病因，占所有4吏用腎臟替換治療的新患者的40-50%(RitzE，RychlikI,LocatelliF,HalimiS，End-stagerenalfailureintype2diabetes:amedicalcatastropheofworldwidedimensions,」wJiT油eyi^,1999;34:795-808》中國是擁有最多糖尿病患者的三個國家之一，估計到2025年，糖尿病患者將增加到4000萬人且該增長主要發(fā)生在中年人群中(ChanJ.C.N,NgM.C.Y，CritchleyJ.A.J.H，LeeS.C，CockramC.S，Diabetesmellitus-aspecialmedicalchallengefromaChineseperspective,D/a6e^siese<arc/zC7/m'ca/iVac"ce,2001;54:S19-27)，年輕型糖尿病與幼年肥胖癥以及新陳代謝綜合癥發(fā)病率的增高是導致這種狀況的出現(xiàn)主要原因(ChanJ.C.N，NgM.C.Y,LessonslearnedfromyoungonsetdiabetesinChina,Cwrewf他Z)ete/epoM，2003;3:101-107;ChanJ.C.N，CheungC.K，CheungM.Y.F，SwaminathanR，CritchleyJ.A.J,H，CockramC.S,AbnormalalbuminuriaasapredictorofmortalityandrenalimpairmentinChinesepatientswithNID畫，C，1995;18:1013-1014;ChanJ.C.N,KoG.T.C，LeungD,CheungR.C.K,CheungM，SoW.Y等，ThelongtermeffectsofangiotensinconvertingenzymeinhibitionandmetaboliccontroloncardiovascularandrenaloutcomesinhypertensiveType2diabeticpatients,超，她陋"o"fl/,2000;57:590-600)。在世界衛(wèi)生組織多國糖尿病心血管病(WHO-MSVDD)的研究中發(fā)現(xiàn)，亞洲，特別是中國、日本患者比白人II型糖尿病患者有更高的ESRD發(fā)病率(MorrishN.J,WangS，StevensL.K,FullerJ.H,KeenH,MortalityandcausesofdeathintheWHOMultinationalSurveyofVascularDiseasesinDiabetes,Z)/a6efo/og7'(2，2001;44:S14國21)。與白人糖尿患者群中大多數(shù)患者死于心血管疾病形成對照的是，中國血統(tǒng)糖尿病患者致死的主要原因是晚期腎病(ESRD)(ChanJ.C.N，CheungC.K,CheungMYF，SwaminathanR，CritchleyJ.A.J.H，CockramC.S，AbnormalalbuminuriaasapredictorofmortalityandrenalimpairmentinChinesepatientswithNIDDM，飾6由C歸，1995;18:1013-1014)。這些發(fā)現(xiàn)最近已被WHO-MSVDD證實(MorrishN.J,WangS,StevensL.K,FullerJ.H,KeenH，MortalityandcausesofdeathintheWHOMultinationalSurveyofVascularDiseasesinDiabetes,Z)/a6加/og/a，2001;44:S14-21)。與這些發(fā)現(xiàn)一致，現(xiàn)已經(jīng)證實疾病相關基因的等位基因頻率和單元型具有種族間差別，這可能導致了疾病形成敏感性方面出現(xiàn)種族差異(NgM,WangY，SoW,ChengS，VisvikisS，ZeeR等，Ethnicdifferencesinthelinkagedisequilibriumanddistributionofsinglenucleotidepolymorphismsin35candidategenesforcardiovasculardiseases,Gewow/cs,2003:inpress;YoungRP，ThomasG.N,CritchleyJ.A.J.H，TomlisnonB，WooK.S,SandersonJ.E,Interethnicdifferencesincoronaryheartdiseaesmortalityin25populations:associationswiththeangiotensinconvertingenzymeDDgenotypefrequency,/owma/o/CaWomycw/ar7M，1998;5:303-7)?？紤]到疾病的持續(xù)時間對并發(fā)疾病的影響、年青與中年糖尿患者人群發(fā)病率的升高和發(fā)生糖尿病腎病的種族偏好，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，腎功能衰竭與心血管疾病將在我們越來越多的年青人群中流行(ChanJ.C.N，NgM.C.Y，CritchleyJ.A.J.H,LeeS.C，CockramC.S,Diabetesmellitus-aspecialmedicalchallengefromaChineseperspective,D/a6efesie5^arc/zC7/w/ca/尸nafcf/ce，2001;54:S19-27)。以前我們凈艮道過腎病有30%到50%的高發(fā)病率和中國血統(tǒng)糖尿病患者腎功能死亡與退化的尿標記的預測值(ChanJ.C.N,CheungJ.C.K，LauE.M.C,WooJ,SwaminathanR,CockramC.S，TheMetabolicSyndromeinHongKongChinese-theinter-relationshipsamongstitscomponentsanalysedbystructuralequationmodeling，Dfa6eto;,1996;19:953-9》我們已報道了在排除高血壓與高血脂的情況下中國血統(tǒng)患者胰島素抗性與糖尿病腎病之間的獨立關系(ChanJ.C.N，TomlinsonB，NichollsM.G,SwaminathanR,CheungC.K，CockramCS,Albuminuria,insulinresistanceanddyslipidaemiainChinesepatientswithnon-insulin-dependentdiabetes(NIDDM),D&6WcM^/zW"e,1996;13:150-55)以及其分別與肥胖癥、白蛋白尿癥、血糖代謝異常之間的密切關系(LeeZ,CritchleyJ,KoG.T,AndersonP，ThomasN，YoungR，etal，ObesityandcardiovascularriskfactorsinHongKongChinese,O&wXyievz'ews，2002;3:178-182)。以家族為基礎的研究與隔離分析(TheDiabetesControlandComplicationsTrialResearchGroup,Clusteringoflongtermcomplicationsinfamilieswithdiabetesinthediabetescontrolandcomplicationtrial,D/a6efes，1997;46:1829-1839)和基因組掃描已經(jīng)證實了遺傳因素在糖尿病腎病形成過程中起到了4艮強的作用(ImperatoreG，HansonRL，PettittD,KobesS,BennettP,KnowlerW,SibpairlinkageanalysisforsusceptibilitygenesformicrovascularcomplicationsamongPimaIndianswithtype2diabetes.PimaDiabetesGeneGroup,D/a6eto，1998;47:821-30;ImperatoreG,KnowlerW，PettittD,KobesS，BennettP，HansonR,SegregationanalysisofdiabeticnephropathyinPimaIndians,飾6由，2000;49:1049-56)。血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在調(diào)節(jié)系統(tǒng)與腎臟血流動力學和細胞組織生長方面起關鍵作用(CooperM,Pathogenesis，preventionandtreatmentofdiabeticnephropathy,La"ce"1998;352:213-9)。AGTM235T多態(tài)性TT基因型、ACEI/D多態(tài)性D等位基因與白種人血統(tǒng)、日本人血統(tǒng)和中國人血統(tǒng)糖尿病患者患腎病有關系(FujisawaT，IkegamiH,KawaguchhiY，HamadaY，UedaH,ShintaniM,etal,Metaanalysisofassociationofinsertion/deletionpolymorphismofangiotensinIconvertingenzymegene7withdiabeticnephropathyandretinopathy,D/a6"o/og/a,1998;41:47-53;YoungR.P，ChanJ.C.N,PoonE，CritchleyJ.A.J.H，CockramC.S,AssociationsbetweenalbuminuriaandangiotensinogenT235andangiotensinconvertingenzymeinsertion/deletionpolymorphimsinChineseNIDDMpatients,他6"asC，1997;21:431-7;RingelJ，BeigeJ，K籠R,DistlerA,SharmaA,Geneticvariantsofthereninangiotensinsystem,diabeticnephropathyandhypertension,Dz'aZ^o/ogzVa,1997;40:193-9》由脂肪細胞分泌的細胞因子，即腫瘤壞死因子a(TNF-a)是肥胖癥與胰島素4元'f生的關耳關因子(HotamisligilGS,SpiegelmanBM，Tumornecrosisfactor:akeycomponentoftheobesity-diabeteslink,DWeto,1994;43:1271-8)，而胰島素抗性是包括中國糖尿病患者在內(nèi)的腎病患者的一個重要特征(ChanJ.C.N,TomlinsonB,NichollsM.G，SwaminathanR，CheungC.K，CockramC.S，Albuminuria,insulinresistanceanddyslipidaemiainChinesepatientswithnon-insulin-dependentdiabetes(NIDDM),D!'"6e"cMe(^c/"e，1996;13:150-55)。最近日本的研究表明血清TNF-a水平的升高與II型糖尿病患者的腎病有確定的關系(MoriwakiY,YamamotoT，ShibutaniY,AokiE,TsutsumiZ，TakahashiS，etal,Elevatedlevelsofinterleukin18andtumornecrosisfactoralphainserumofpatientswithtype2diabetesmellitus:relationshipwithdiabeticnephropathy,Meto6o/z'>S7W..C7/m'ca/Expen>ewto/，2003;52:605-8)。關于這一點，已有報道TNF-a基因啟動子區(qū)域的G-308A多態(tài)性與肥胖癥、胰島素抗性(DalzielB，GoskbyA,RichmanR,BrysonJ,CatersonI,AssociationofTNFalpha-308G/Apromoterpolymorphismwithinsulinresistanceinobesity,C^ew々及esem"c/2,2002;10:401畫7)及TNF-a基因轉(zhuǎn)錄活性增強有關(KroegerK,CarvilleK,AbrahamL，The-308tumornecrosisfactoralphapromoterpolymorphismeffectstranscription,Mo/eci//"r7/wmwo/gF,1997;34:391-99)。醛糖還原酶(ALR2)是多醇路徑最關鍵的酶，多醇路徑可以導致氧化壓力增加和細胞內(nèi)環(huán)境改變，從而引起糖尿病微血管病(HodgkinsonA,SondergaardK，YangB，CrossD,MillwardB，DemaineA,Aldosereductaseexpressionisinducedbyhyperglycemiaindiabeticnephropathy，/w^77a"0脂/,2001;60:211-8)。已經(jīng)表明ALR2基因5'-(CA)的z-2等位基因、C-106T多態(tài)性T等位基因使包括中國血統(tǒng)患者在內(nèi)的I,II型糖尿病患者患腎病的危險性增加(WangY，NgM,LeeS,SoW，TongC,CockramC，etal,PhenotypicheterogeneityassociationsoftwoaldosereductasegenepolymorphismswithnephropathyandretinopathyinType2diabetes,Z)勵etoCare,2003;26:2410-5)。上述公開的遺傳因子進一步地與代謝的、血液動力學的和生長因子作用，致使腎功能蛋白尿和逐漸衰竭(ParvingH.H,TarnowL,RossingP，Geneticsofdiabeticnephropathy，Jowwa/o/^4膨n'cawSoc/外o/辟W，，1996;7:2509-17)。盡管已經(jīng)有關于這5個遺傳標記與白種人和日本人糖尿病并發(fā)癥的關系的報道，但對于中國血統(tǒng)糖尿病患者群還沒有相一致的報道。到目前為止，還沒有報道表明這些遺傳因子對糖尿病并發(fā)癥，包括糖尿病腎病的形成產(chǎn)生交互作用效應。應用基因組學的前景在于它的潛在用途，它可以用來鑒別危險性患者以期較早地和有目地干預，從而確保身體健康和減少諸如糖尿病之類至丈死'l"生疾病的#》響(CollinsF，GreenE,GuttmacherA,GuyerMobotuNHGRI，Avisionforthefutureofgenomicsresearch.Ablueprintforthegenomicem,iVa^re,2003;422:835-47)。在鑒定中國糖尿病患者并發(fā)癥高危患者的遺傳因子的研究中，我們第一個報道AGTTT基因型與糖尿病有關以及其與ACED等位基因一起對糖尿病的形成產(chǎn)生協(xié)同作用(YoungRP，ChanJ.C.N,PoonE,CritchleyJ.A.J.H,CockramC.S,AssociationsbetweenalbuminuriaandangiotensinogenT235andangiotensinconvertingenzymeinsertion/deletionpolymorphimsinChineseNIDDMpatients,C，1997;21:431-7)。同樣，我們第一個報道了ALR2TT基因型與中國血統(tǒng)患者患糖尿病患腎病的危險性有關(WangY，NgM，LeeS,SoW，TongC，CockramC，etal,PhenotypicheterogeneityassociationsoftwoaldosereductasegenepolymorphismswithnephropathyandretinopathyinType2diabetes,D/"6etoCare,2003;26:2410-5)。發(fā)明概要因此，本發(fā)明涉及到一種檢測中國血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的方法，該方法包括如下步驟檢測來自糖尿病患者的樣品中是否含有下列多態(tài)性序列中的至少一種ACE基因的1/D基因型，AGT基因的M235T基因型，ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型，ALR2基因啟動子區(qū)的C106T基因型，TNF-a基因的G-308A基因型，以及其互補序列，條件是不單獨使用ALR2的基因型，其中多態(tài)性序列的存在表明該糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病。在本發(fā)明的一個實施方案中，上述方法還包括從患者中取樣的步驟。該患者優(yōu)選患有II型糖尿病，取得的樣品優(yōu)選為血液。本發(fā)明還涉及到用來檢測中國血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的芯片，該芯片包括下列多態(tài)性序列中的至少一種ACE基因的1/D基因型，AGT基因的M235T基因型，ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型，ALR2基因啟動子區(qū)的C106T基因型，TNF-a基因的G-308A基因型，以及其互補序列，條件是不單獨使用ALR2的基因型。在本發(fā)明中，I/D多態(tài)性優(yōu)選含有DD基因型，G-308A多態(tài)性優(yōu)選含有GG基因型。本發(fā)明還涉及到用于檢測中國血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的試劑盒。試劑盒一般包括本發(fā)明所定義的芯片和指導用此芯片處理樣品的指導性材料。優(yōu)選地，該試劑盒含有從患者中采取樣品的裝置。附圖的簡要說明圖1顯示了711例具有不同數(shù)目危險基因型的中國血統(tǒng)II型糖尿病患者患腎病的幾率，這些基因型包括AGT基因的TT基因型，ACE基因的DD/DI基因型，TNF-a基因的GG基因型，AGT基因的TT基因型，ALR2基因的x/z-2o或z-2/z-2基因型，ALR2基因的CT/TT基因型。圖2顯示了947例中國血統(tǒng)II型糖尿患者中ACE基因1/D基因型攜帶者發(fā)生腎病終點事件的Kaplan-Meier曲線圖。圖3顯示了患者初級復合終點事件(PanelA)或晚期腎病終點事件(PanelB)和全致死(PanelC)的Kaplan-Meier曲線圖。依托多學科團隊，按照注重對目標實施定期監(jiān)控、治療和增強患者依從性的方案(干擾組)與基于通常的臨床護理的方案(對照組)處理上述患者，其中干擾組的患者一直在醫(yī)生的指導下治療，而對照組的患者依從性不穩(wěn)定。發(fā)明的詳細描述遺傳學、流行病學與試驗研究支持了這樣一種主張?zhí)悄虿∧I病涉及到多種生物化學途徑(CooperM，Pathogenesis,preventionandtreatmentofdiabeticnephropathy,Z薩"，1998;352:213-9)?；趪H和地區(qū)的、臨床與實驗的證據(jù)，我們認為AGT基因M235T的TT基因型，ACE基因I/D的DD/ID基因型，TNF-ot基因G-308A的GG基因型，ALR2基因x/z-2或z-2/z-2(z=z-2之外的任何等位基因)和CT/TT基因型都是中國血統(tǒng)糖尿病患者患腎病的潛在危險基因型。定義除非在發(fā)明中特別指出，術語"AGT基因M235T"或"AGTM235T"是指"AGT基因的M235T基因型"；術語"ACE基因1/D"或者"ACEI/D多態(tài)性"與"ACE基因的I/D基因"含意相同；術語"TNF-ot基因GG"等同于"TNF-a基因G-308A的GG基因型"；術語"TNF-a基因G-308A"或"TNF-oc基因啟動子區(qū)域的G-308A多態(tài)性"或"TNF-aG-308A"或"TNFaG308A多態(tài)性"是指"TNF-a基因的G-308A遺傳型"；術語"醛醣還原酶5，-(CA)n的z-2等位基因"或者"ALR2(CA)n-5，(z-2)"等同于"ALR2基因5'-(CA)重復序列的(z-2)基因型"；術語"醛醣還原酶(ALR2)的C-106T多態(tài)性的T等位基因"等同于"ALR2TT基因型，ALR2基因TT"或者"ALR2基因CT/TT基因型"；術語"一個ALR2的C-106T多態(tài)性"是指"啟動子區(qū)域的ALR2基因的一個C-106基因型"。本發(fā)明用來檢測中國血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的方法包括如下步驟檢測來自糖尿病患者的樣品中是否含有下列多態(tài)性序列中的至少一種ACE基因的1/D基因型，AGT基ii基因的(CA)n-5，(z-2)基因型，ALR2基因啟動子區(qū)的C106T基因型，TNF-a基因的G-308A基因型，以及其互補序列，條件是不單獨使用ALR2的基因型，其中多態(tài)性序列的存在表明該糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病。在上述方法中用作遺傳標記的多態(tài)性可以通過以下步驟予以鑒別(a)從患者中提取基因組DNA(b)以基因組DNA為模板用PCR方法擴增基因組DNA中的ACE基因，AGT，TNF-aG-308A多態(tài)性基因，醛醣還原酶(ALR2)CA重復序列，ALR2基因的C106T啟動子；和(c)應用凝膠分離或測序鑒別(b)步驟中的產(chǎn)物。在本發(fā)明中，基因組DNA可以從患者的體液中抽提，如血液和尿液，優(yōu)選為血液。盡管本發(fā)明的4全測方法可以應用于任何一糖尿病患者，但是該方法優(yōu)選用于II型糖尿病患者。中國血統(tǒng)糖尿病患者特別適合于本發(fā)明。本研究的四個候選基因均可通過可能的代謝途徑51起糖尿病腎病的形成。AGT與ACE是導致高血壓和組織異常生長的RAS的重要組成元件(CooperM,Pathogenesis,preventionandtreatmentofdiabeticnephropathy,丄a"cef，1998;352:213-9;RingelJ，BeigeJ,KunzR，DistlerA,SharmaA,Geneticvariantsofthereninangiotensinsystem,diabeticnephropathyandhypertension,D/a6"o/og7'a，1997;40:193-9)。細胞因子TNF-ot使肥胖癥與胰島素抗性間產(chǎn)生關聯(lián)(HotamisligilGS，SpiegelmanBM，Tumornecrosisfactor:akeycomponentoftheobesity-diabeteslink,D/a^^s,1994;43:1271-8),有才艮道表明其血清水平確定地與沖唐尿病腎病相關(MoriwakiY，YamamotoT，ShibutaniY，AokiE,TsutsumiZ,TakahashiS，etal,Elevatedlevelsofinterleukin18andtumornecrosisfactoralphainserumofpatientswithtype2diabetesmellitus:relationshipwithdiabeticnephropathy,Meto6o/z'sm..C7/m,ca/朋d￡x/7en'wewto/,2003;52:605-8)。通過山梨醇酯的細月包間積累和高血糖條件下的氧化壓力增加，ALR2引起微血管疾病的發(fā)生(ChungS，HoE，LamK,ChungS，Contributionofpolyolpathwaytodiabetes-inducedoxidativestress,Jbwwa/o/^wen'caw5"oc/e/y0/iVie//2ro/ogy，2003;14:S233-6).在中國血統(tǒng)人群中這些基因型的發(fā)現(xiàn)是基于一系列橫向的、預期的和病例對照研究，結果與糖尿病腎病患者的表型特征一致，其中的糖尿病腎病患者比未患糖尿病腎病的患者更肥胖、血壓更高，具有更多不良的脂和血糖調(diào)控。大規(guī)模隨機臨床研究已經(jīng)證實抑制RASD,加強血糖和血壓調(diào)控對治療糖尿病蛋白尿病和ESRD形成具有有益效果(BrennerB.M,CooperM.E,DeZeeuwD,KeaneW.F,MitchW.E，ParvingH.H等,EffectsofLosartanonrenalandcardiovascularoutcomesinpatientswithtype2diabetesandnephropathy,iVew￡>2g7aw<i0/MW"'we,2001;345:861-9;UKPDS，Intensivebloodglucosecontrolwithsulphonylureasorinsulincomparedwithconventionaltreatmentandriskofcomplicationsinpatientswithtype2diabetes(UKPDS33),丄禱W，1998;352:837-53;AdlerA.I，StrattonI.M,NeilH.A,YudkinJ.S,MatthewsD.R，CullC.A等,Associationofsystolicbloodpressurewithmacrovascularandmicrovascularcomplicationsoftype2diabetes(UKPDS36):prospectiveobservationalstudy,5r他/zMed/ca/Jowr"a/，2000;321:412-9)。最近的研究表明，組合使用ACE、ALR2抑制劑治療能產(chǎn)生協(xié)同作用從而改善糖尿病大鼠的神經(jīng)功能(CotterM,MirrleesD，CameronN,Neurovascularinteractionsbetweenaldosereductaseandangiotensinconvertingenzymeinhibitionindiabeticrats,Jtww"/0/7Va，"co/ogy，2001;417:223-30)。總之，對這些遺傳因子及其交互作用的鑒定(和提高對同一患者危險基因型的同時篩選效率的相關微芯片技術)可篩選出高危個體以對其進行強化與有目的治療從而減少并發(fā)癥危險。關于這一點，依賴多學科團隊，我們已經(jīng)證實注重對目標實施定期監(jiān)控、治療和增強患者的依從性的多重方法可以使中國血統(tǒng)糖尿患者死亡和患晚期腎病(ESRD)的危險減少40-70%。(圖3)。由于攜帶這些基因型的患者的危險性不斷地增加，該疾病調(diào)控方案及其花費有效性的優(yōu)點應該還會得到進一步的提南。在對年齡與性別進行調(diào)整后，我們發(fā)現(xiàn)患腎病的危險性隨著危險基因型數(shù)目的增加而漸進式地顯著增加。攜帶有3種或者更多危險基因型的患者占總患者的66%，與攜帶有O種或者l種危險基因型的那些患者相比，這些患者患糖尿病腎病的危險性增加了1.8-2.0倍。我們提供了原始數(shù)據(jù)證實了DD基因型對ESRD形成、TNF-a對糖尿病腎病，特別是對肥胖性糖尿患者的糖尿病腎病的前兆性作用。更重要的是這些數(shù)據(jù)證實了這5種基因型間的交互作用對糖尿病腎病形成具有前兆性作用。能夠理解以上所提到的一種或者多種基因型可以用于制備芯片，該芯片可以與其它已知的臨床的、生物化學的與遺傳學的芯片一起用來預測中國血統(tǒng)糖尿病患者中糖尿病并發(fā)癥，包括腎病發(fā)生的危險性。這些基因型或其等效芯片可以用于檢測患者患糖尿病和/或糖尿病腎病的危險性，從而使用包括強度監(jiān)測、藥理學與非藥理學療法在內(nèi)的多重方法來改變危險性。為了實施本發(fā)明，使用本發(fā)明定義的芯片作為試劑盒來檢測中國血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展或疑似患有腎病是方便的。該試劑盒包括上述芯片和擴增基因ACE、AGT、ALR2或TNF-a的一對引物。在本發(fā)明試劑盒的一個實施方案中，該引物選自從SEQIDNO:l到SEQIDNO:10。此發(fā)明還提供了含有一種芯片的試劑盒，該芯片含有下列多態(tài)性序列中的至少一種和根據(jù)該序列設計的作為對照的任意探針ACE基因的1/D基因型，AGT基因的M235T基因型，ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型，ALR2基因啟動子區(qū)的C106T基因型，TNF-a基因的G-308A基因型，以及其互補序列。本發(fā)明將通過以下實施例作進行進一步的描述。實施例1五個多態(tài)性序列基因型的鑒定人類基因組的制備從每個患者中收集大約10mlEDTA血樣，用SDS和蛋白酶K過夜裂解細胞后，用苯和氯仿抽提得到基因組DNA。然后將DNA顆粒溶解到IXTE緩沖液中。通過檢測260nm和280nm處的光密度測定抽提的DNA數(shù)量和質(zhì)量。將抽提的DNA在4。C下貯藏以備下次基因型分析。ACE基因的PCR條件反應依據(jù)改進的Rigat的方法進4亍(RigatB，HubertC，Alhenc-GelasF,CambienF,CorvolP,SoubrierF,AninsertiondeletionpolymorphisminangiotensinIconvertingenzymegeneaccountingforhalfthevarianceofserumenzymelevels,c/owrwa/C7/m'c"http://"ve幼'g加'o",1990;86:1343-1346)。使用GeneAmpPCRSystem9700(ABI)在標準PCR緩沖液(50mMKCl，lOmMTris國HCl，pH8.3,3mMMgCl2,dNTP各0.2mM)(ABI)中擴增150ngDNA模板，引物濃度為各5pmo1,Taq聚合酶為0.6U(Amersham)，總體積為20(il。循環(huán)條件如下開始在94°C下變性2min，94°Clmin，58。Clmin，72。C2min，共30個循環(huán)，最后在72。C下延伸5min。引物的序列如下5'CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT3'SEQIDNO.15，GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT3'SEQIDNO.2PCR產(chǎn)物是190bp和490bp的片斷，前者不含有插入等位(insertionallele)基因，后者含有插入等位基因。血管緊張素基因的PCR條件反應依照Russ的方法進4亍(RussA,MaerzW，RuzickaV，SteinU，GrossW,RapiddetectionofthehypertensionassociatedMet235—Thralleleofthehumanangiotensinogengene,T/畫awMo/ecw/wGWe"cs,1994;2:609-10)。使用GeneAmpPCRSystem9700(ABI)在標準PCR緩沖液(50mMKCl，10mMTris-HCl,pH8.3,，1.5mMMgCl2,dNTP各50uM)(ABI)中擴增200ngDNA才莫板，引物濃度為各0.3uM,Taq聚合酶為0.75U(Amersham)。引物的序歹'J如下5,-CAGGGTGCTGTCCACACTGGACCCC-3'SEQIDNO.35，-CCGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTCT-3,SEQIDNO.4循環(huán)條件如下卯。C變性3min;94°C1min68。Clmin.,72。Clmin.,IO個循環(huán)；之后為90°C30sec，68。Clmin.，72。C30sec.,30個循環(huán)，最后72。C延伸10min。PCR產(chǎn)物用5UTth111I(P匪ega)酶在65。C消化過夜。消化片段在3%的瓊脂糖凝膠中通過電泳進行分離。純的蛋氨酸等位基因表現(xiàn)為未消化的165bp單帶帶型，蘇氨酸呈現(xiàn)為141bp與24bp帶型。TNF-aG-308A多態(tài)性的PCR條件依據(jù)Wilson等描述的方法進行反應(WilsonA,diGiovineF,BlakemoreA,DuffG，SinglebasepolymorphisminthehumantumornecrosisfactoralphagenedetectablebyNcolrestrictionofPCRproduct,//wwwMo/ecw/arG^"e""，1992;1:535)。使用GeneAmpPCRSystem9700(ABI)進行反應，終體積為20|il,包含100ngDNA模板，50mMKCl，10mMTris-HCl，pH8.3，2.5mMMgCl2，0.2mM每種dNTP(Boehringer-Mannheim，Germany)。引物濃度為各0.5mM，Taq聚合酶為0.05U(Boehringer-Mannheim，Germany)。引物的序歹'J如下5，-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT國3'SEQIDNO.55，-TCCTCCCTGCTGCTCCGATTCCG-3'SEQIDNO.6循環(huán)條件如下開始在95。C變性3min，95。Clmin,58。C1min,72°Clmin，共35個循環(huán)。最后在72°C延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物用10UNcol酶(Promega)在37°C消化過夜。消化片段在3%的瓊脂糖凝膠中通過電泳進行分離。A等位基因表現(xiàn)為未消化的165bp帶型，G等位基因呈現(xiàn)為87bp與20bp帶型。醛醣還原酶(ALR2)CA重復序列PCR條件含有二核芬酸CA重復序列的區(qū)域通過用Ko等所描述的PCR方法(KoB.C.B,LamK.S.L,WatN.M.S，ChungS.S.M，An(A畫C)ndinucleotiderepeatpolymorphicmarkeratthe5'endofthealdosereductasegeneisassociatedwithearlyonsetdiabeticretinopathyinNIDDMpatients,Z)/a6w^，1995;44:727-32)進行擴增，所使用的引物側(cè)翼與138bp的區(qū)域連接。反應所用的有義鏈的序列是5,-GAATCTTAACATGCTCTGAACC國3'SEQIDNO.7反義鏈序列是Arpr25，-GCCCAGCCCTATACCTAGT-3'.SEQIDNO.8將1個M13尾(5，-CACGACGTTGTAAAACGAC-3，)加到有意義鏈引物5'末端用來標記紅外熒光PCR在按照提供的配方制備的緩沖液中進行，總體積為4pl，包含lngDNA模板，2.5mMMgCl2,dNTP各0.2mM,引物各0.1pmol/|al,0.15pmol4UIRD800標記的M13正向(-29)引物，0.15UTaq聚合酶(Amplitaq,Perkin-Elmer/Cetus,Norwalk,CT)。循環(huán)條件為初始94°C變性3min，94°Clmin.，57。Clmin，72。Clmin，共35個循環(huán)，最后72。C延伸lOmin。擴增出的PCR產(chǎn)物在95。C加熱5min，然后上樣到5.5°/。的聚丙烯酰胺凝膠上，在0.8XTBE電泳液中用Li-CORDNAAnalyser(Li-COR，Lincoln,NE)電泳分離，功率恒定為75W，溫度為55°C。通過與攜帶有ALR2基因的23(CA)重復序列比較的得到等位基因的大小，其中的ALR2基因的23(CA)重復序列由ShigaUniversityofMedicalScienceofJapan的Dr.ShiroMaeda贈送。ALR2基因C106T啟動子的PCR條件反應依據(jù)KaoYL等描述的方法進行(KaoY，DonaghueK，ChanA，KnightJ，SilinkM,Anovelpolymorphisminthealdosereductasegenepromoterregionisstronglyassociatedwithdiabeticretinopathyinadolescentswithtype1diabetes,1999;48:1338-40)。使用GeneAmpPCRSystem9700(ABI)進行反應，最終體積為20fil，包含100ngDNA模板，50mMKCl，1OmMTris-HCl,pH8.3,2mMMgCl2,dNTP各0.2mM)(Boehringer-Mannheim,Germany)。引物濃度為各0,5pmol/|il，Taq聚合酶為0.5U(Boehringer-Mannheim，Germany)。引物的序歹'J如下5，-CCTTTCTGCCACGCGGGGCGCGGG-3'SEQIDNO.95'-CATGGCTGCTGCGCTCCCCAG-3'SEQIDNO.10循環(huán)條4牛如下初始94°C變性3min.,94°Clmin.,57°Clmin.,72°Clmin，共35個循環(huán)，最后72。C延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物用5UBfaI(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)酶在37。C消化過夜。消化片段在3.5%的瓊脂糖凝膠中通過電泳進行分離。C等位基因表現(xiàn)為206bp與57bp的片斷，206bp片段進一步切割成147bp與59bp片段而得到T等位基因。實施例2腎病與基因間交互作用的關系我們才企測了711例(303男，408女，年齡63.1±11.1歲)中國血統(tǒng)II型糖尿病患者的AGT基因M235T，ACE(I/D),TNF-a基因G-308A，ALR2基因5，-(CA)n和啟動子C-106T多態(tài)性的交互作用情況。選擇有超過十年糖尿病病史，血漿肌氨酸酐小于lOOjimol/1以及即時尿清蛋白肌氨酸酐比率(spoturinealbumicreatinineratio)(ACR)小于3.5mg/mmol的患者作為對照(11=388)。血漿月幾氨酸酐大于150|iimol/l或者ACR不小于25mg/mmol的患者認為患有腎病(11=323)。將包括甘油三酸酯、ACR在內(nèi)的不規(guī)則凝據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，用社會學統(tǒng)計包(Version10.0，SPSSInc,Chicago)進行統(tǒng)計學分析。如果合適，連續(xù)變量用平均值士SD或者幾何學平均值(x/+反對數(shù))SD表示。應用IndependenceSampleT-測試與共變異數(shù)分析進4亍群體間的比較分析。用卡方測定來分析等位基因與基因型頻率以及不同類型糖尿病患者相關的代謝異常與并發(fā)癥的百分率。計算置信區(qū)間(CI)為95%的具有不同數(shù)目危險基因型的患者可能患糖尿病腎病的幾率(OR),P值小于0.05(2-尾)可認為幾率很大?；加心I病的患者與未患腎病的患者相比，年紀大的男性居多。校正年齡和性別后，患有腎病的患者比未患腎病的患者更肥胖和有更高的體重指數(shù)(BMI)、腰-臀比(WHR)和更高的血壓。他們還具有更不良的脂肪分布，更高的血清總膽固醇(TC)、甘油三酸酯(TG),更低的HDL-C和更容易患感官神經(jīng)疾病、視網(wǎng)膜病，周邊血管病變、心血管疾病。表1顯示了711例中國血統(tǒng)II型糖尿病患者中患腎病者與未患腎病的臨床與生物化學參數(shù)比較。數(shù)據(jù)表示為平均值士SD或者幾何平均值(x—反對數(shù))SD，患腎病的患者和未患腎病的患者的數(shù)據(jù)用IndependentSampleT-測試值進行比4交，兩研究組的糖尿病并發(fā)癥的百分率用卡方測定值比較。表1研究組校正后未患腎病(N=323)患腎病(N=388)P值的p值*性別(％男性)30.053.1<0.001-年齡(年)60.6±10.165.1±11.6<0.001-糖尿病發(fā)病時間(年)16.0±1.68.2±5.4<0.001-體重指數(shù)(kg/m2)23.9±3.225.5±4.0<0.001<0.001腰高比0.87±0.060.91±0.07<0.001<0.001收縮壓(mmHg)131±18153±23<0.001<0.001舒張壓(mmHg)72±1083±12<0.001<0.001糖化血紅蛋白(％)7.6±1.38.1±2.1<0.001<0.001禁食血漿葡萄糖(mmo1/1)8.3±2.89.5±4.4<0.001<0.001總膽固醇(mmo1/1)5.2±1.05.9±1.5<0.001<0.001甘油三酸酉旨(mmol/l)a1.W+1.71.9x/+1.9<0.001<0.001高密度脂蛋白-C(mmo1/1)1.4±0.41.2±0.3<0.001<0.001低密度脂蛋白-C(mmo1/1)3.20±0.843.73±1.21<0.001<0.001血漿肌氨酸酐(pmo1/1)72.4±14.3152.6±105.4<0.001<0.001清蛋白肌氨酸酐比率(mg/mmol)al.lx/+2.0128.8x/+2.9<0.001<0.001肥胖(％)34.547.9<0.001<0.001高血壓(％)46.781.2<0.001<0.001血脂異常(％)52.083.0<0.001<0.001視網(wǎng)膜病(％)25.154.6<0.001<0.001神經(jīng)病(％)18.643.8<0.001<0.001周邊血管病變(％)2.813.4<0.001<0.001缺血性心臟病(％)5.912.40.0030.019腦血管疾病(％)3.78.50.0090.098RAS抑止劑的應用(0/0)26.979.9<0.001-*校正年齡與性別后，應用共變異數(shù)分析得到的p值表2總結了這5種類型基因型在患有或未患有腎病的患者中的分布情況。通過卡方測定對患有或未患有腎病的患者的基因型或者等位基因頻率進行比較，患腎病的患者比未患腎病的患者具有更高頻率的ALR2基因5'-(CA)n的z-2(24.1%vs.18.6%,P-0.01)和ALR2基因C-106T的T等位基因(25.8%vs.21.4%，P=0.05)。ALR25，-(CA)nz-2等位基因攜帶者比非z-2等位基因攜帶者具有更高的ACR水平(17.8xZ+12.3vs.12.6x/+12.9mg/mmol,P-0.062)和視網(wǎng)膜病百分率(47.4%vs.37.4%，P=0.009)。ACEI/D的DD/DI基因型攜帶者比II基因型攜帶者具有更高水平的TC水平(5.7土1.4vs5.5士1.3mmo1/1,P=0.047)。在對年齡與性別進行校正后，TNF-a基因G-308A的肥胖性GG基因型攜帶者比非肥胖性患者具有更高水平的ACR(22.9x/+11.5vs10.7x/+13.2mg/mmol，PO.OOl)和血漿月幾氨酸酐水平(125士95vs.108±75|amol/l，P=0.005)表2基因多態(tài)性基因型頻率(％)基因多態(tài)性等位基因頻率(％)的基因型未患腎病患腎病的等位基因未患腎病患腎病(N=323)(N=388)(N=646)(N=776)AGT基因AGT基因M235TM235TTT70.972.9T84.485.7TM26.925.5MM2.21.5M15.614.3ACE基因I/DACE基因I/DII45.846.4I66.667.3DI41.541.8DD12.711.9D33.432.7TNF-a基因TNF-oc基G-308AG-308AGG80.884.0G89.991.8GA18.315.5AA0.90.5A10.18.2ALR2基因ALR2基因5，-(CA)n5，-(CA)nx/x67.257.7X81.475.9x/z-228.536.3z-2/z-24.35.9*z-218.624.1+ALR2基因ALR2基因5，-(CA)n5，-(CA)ny/y89.993.3y94.496.6y/z+69.36.7z+6/z+60.9o承承z+65.63.4++ALR2基因ALR2基因C-106TC-106TCC63.556.7C78.674.2CT30.335.1TT6.28.2*"T21.425.8+++p除了z-2等位基因以外的任何(CA)n等位基因；y-除了z+6等位基因以外的任何(CA)n等位基因；*P=0.01,**P=0.09，***P=0.07,當分別比較腎病患者與非腎病患者ALR2基因x/z-2o或z-2/z-2,y/z+6or或z+6/z+6與CT/TT的組合基因型頻率時；+P=0.01,++P=0.04,+++P=0.05,,當當分別比較腎病患者與非腎病患者ALR2基因z-2,z+6與T等位基因頻率時。表3總結了患者群中基因型數(shù)目的分布。在7u個中國血統(tǒng)n型糖尿病患者中，64(9.0%)有0或1個危險基因型，176(24.8%)有2個危險基因型，290(40.8%)有3個危險基因型，181(25.5%)有4或5個危險基因型。與不多于1個危險基因型的患者相比，有2、3和大于4個危險基因型腎病的幾率分別/人1.4(95%CI0.8-2.4,P=0.3)增加到1.8(95%CI1.1-1.3，P-0.03)和2.0(95%CI1.1-3.6，P=0.02)(圖2)。表3危險基因型的數(shù)目未患腎病患腎病總?cè)篘(%)0危險基因型628(1.1)1危險基因型312556(7.9)2危險基因型8888176(24.8)3危險基因型1251652卯(40,8)4危險基因型5887145(20.4)5危險基因型152136(5.1)總計323388711實施例3TNF-aGG基因型與腎病的關系表4顯示了在中國血統(tǒng)II型糖尿病患者中TNF-a基因的G-308A多態(tài)性與肥胖間的交互作用對腎病形成的影響，其中"Ref，代表參考組，該組是非肥胖GA/AA攜帶者。擁有GG基因型的肥胖患者患腎病的危險性升高了1.9倍(95。/oCI:1.1-3.2，P=0.012)。表4頻率數(shù).(％)糖尿病腎病的危險性組未患腎病患腎病OR95%CIP值GG-/非肥胖40(12.4)38(9.8)1(Ref.)GGV肥胖22(6.8)24(6.2)1.20.55-2.380.710GG十/非肥胖172(53.1)164(42.3)1.00.62-1.650.970GG十/肥胖89(27.6)162(41.8)1.91.15-3.200.012表5顯示了在校正干擾因素如年齡、性別、微血管血糖、高血壓、高血脂、視網(wǎng)膜病、神經(jīng)病與周邊血管病變后用來沖全測TNF-a基因G-308A與肥胖間的交互作用對腎病的影響的多元邏輯斯蒂回歸分析。在表5中，校正的總百分率為75.2%,依變量腎病的code=l;自變量包括年齡、性別(男性的code-l)、HbAlc、FPG和存在的高血糖、高血壓及視網(wǎng)膜病、神經(jīng)病與周邊血管病變、缺血性心臟病與腦血管疾病(code=l)。肥胖與TNF-a基因G-308A多態(tài)性間的交互作用為GG-/肥胖-(code=0)，GG畫/月巴胖十(code=l),GG十/月巴胖畫(code=2),。0+/月巴胖+(code=3)。_患糖尿病腎病的危險性獨立預測因子幾率95%CIP值年齡(年)1.021.002-1.040.033雄性2.61.78-3.71<0細禁食血漿葡萄糖(mmo1/1)1.11.03-1.160.002高血脂2.81.86-4.18<0細高血壓3.22.19-4.81<0細視網(wǎng)膜病2.41.62-3.51<0.001神經(jīng)病2.11.36-3.220細周邊血管病變2.81.21-6.590.017GG-/肥胖十vsGG國/肥胖-1.40.57-3.260.482GG十Z肥胖-vsGG-Z肥胖-1.20.64-2.150.614實施例4ACEII/DD基因型與糖尿病腎病的關系在病史平均為4.0土1.4年的947名中國血統(tǒng)糖尿病患者的擴增組中，我們檢測了ACE11/DD基因型對定義為腎臟死亡的ESRD或腎臟事件(需要透析或血漿肌氨酸酐〉50(^mo1/1或血漿肌氨酸酐基準值的兩倍>150nmol/l)形成的影響。在947名患者中，62名患者發(fā)生了腎臟終點事件。表6顯示了在947名中國糖尿病患者中的ACEI/D多態(tài)性基因型和等位基因的頻率，這些患者有或沒有發(fā)生腎臟終點事件，此終點事件定義為血漿肌氨酸酐基準值的兩倍或者在4.0年的平均期限后仍需要腎透析。我們應用卡方對發(fā)生和未發(fā)生腎病終點事件的基因型和等位基因頻率進行了比較。從表6可以看出，前一組患者比沒有發(fā)生腎病終點事件的患者具有更高的DD基因型(19.40/。vs.9.8%,P-0.031)和D等位基因頻率(41.2%vs.30.2%,P-O.Oll)。Kaplan-Meier分析表明了在攜帶II(460中23個患者發(fā)生腎臟終點事件)，DI(388中27個患者演化出腎臟終點事件)，DD(99中12個患者發(fā)生腎臟終點事件)基因型的患者中累積性腎臟存活率(cumulativerenalsurvivalrate)有明顯的不同。(log-rankP=0.019)(圖2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>卞P=0.031,JPvalue=0.011當分別在發(fā)生和沒有發(fā)生腎病終點事件的患者間進行基因型和等位基因頻率比較時。表7顯示了用來檢測947名中國血統(tǒng)II型糖尿病患者中的腎臟終點事件的前兆因子的多元Cox-回歸分析，在其中，"a"代表在初始時出現(xiàn)微量或巨量蛋白尿的患者；"b"代表與II基因型攜帶者相應的DI基因型攜帶者，"c"代表與II基因型攜帶者相應的DD基因型攜帶者。依變量包括:腎臟死亡或腎臟事件(code^);自變量包括年齡，性別(對男性，code=l)，糖尿病發(fā)病時間，SBP,DBP，TC，TG、HDL-C、LDL-C的對數(shù)值，并發(fā)癥的出現(xiàn)(code-l)，如在基線處出現(xiàn)的腎病、視網(wǎng)膜病、神經(jīng)病與周邊血管病變，以及ACE基因1/D多態(tài)性(對于DI，code=lvs.II,對于DD，code=2vs.11)。在多元Cox-回歸分析中，腎病終點事件的出現(xiàn)一直顯著地受到I/D多態(tài)性的影響，該I/D基因型含有一個具有明顯有害效果的DD基因型(DDvs.II，校正的危險比率為3.4，95%CI1.6-7.3,P=0.002)。其它獨立的前兆因子包括長期患糖尿病、高收縮血壓、甘油三酸酯、在初始時發(fā)生腎病和視網(wǎng)膜病。表7獨立變量(基線值)|3相關系危險比率*95%CIP值數(shù)糖尿病發(fā)病時間(年)0.0501.051.01-1.090.013血收縮壓(mmHg)0.0141.011.00-1.030.012甘油三酸酯對數(shù)值(mmo1/1)2.0637.872.24-27.70.001糖尿病腎病的出現(xiàn)a3.57935.84.84-265.2<0.001視網(wǎng)膜病的出現(xiàn)0.8502.341.27-4.30O馬ACE基因I/DbDI基因型攜帶0.5951.810.99-3.310.053者基因I/DeDD基因型攜帶者基1.2233.401.59-7.270.002因I/Dc實施例5ALR2的基因型與糖尿病腎病的關系在有738個中國血統(tǒng)II型糖尿病患者的另一組中[年齡55.5士13歲，確診病史為5.7±5.7年，平均值土SD],僅有21.5。/?；寄I病(DN)，僅有8%患有視網(wǎng)膜病(DR)，53.1。/o未患并發(fā)癥(UC)。CT/TT基因型攜帶者(N-267)25的尿AER比CC基因型攜帶者高。(N=471)(30.2x/+7.2vs.21.9x/+6.9(ig/min，P=0.03)。在校正干擾變量，如年齡、糖尿病持續(xù)時間、血壓和血紅蛋白Alc后，該差異還是很明顯(P:0.04)。因為疾病的持續(xù)期是糖尿病微血管并發(fā)癥的主要決定因素(RogusJ.J,WarramJ.H，KrolewskiA.S，Geneticstudiesoflatediabeticcomplications.Theoverlookedimportanceofdiabetesdurationbeforecomplicationonset,Z)/"Z^es，2002;51:1655-1662)，因此患糖尿病時間不足5年的患者(n-300)在接下來的分析中被排除，將剩余的患者(11=438)分成四個亞組159名患者(36.3%)僅具有DN,66名患者(15.1%)僅具有DR,121名患者(27.6%)具有DN和DR,92名患者(21%)沒有并發(fā)癥。單變量分析表明相對于UC組，DN和DR組的z-2等位基因(25.7%vs.16.9%，OR1.7，95%CI1.0-2.8，P=0.03)、T等位基因(26.4%vs.18.5%，OR1.6，95%CI1.0-2.7，P=0.04)的頻率較高。采用年齡、性別、疾病發(fā)病時間、BP、代謝指數(shù)和三個ALR2的基因型(攜帶的z+6,攜帶的z-2和攜帶的CT/TT)作為自變量，UC組作為對照(code-0)，攜帶的z-2(OR2.64,95%CI1.02-5.83)和CT/TT基因型(OR2.48，95%CI1.19-5.19)以及年齡(OR1.06，95%CI1.02-1.10),BP(OR1.04，95%CI1.02-1.06)，HbAlc(OR1.23,95%CI雄性(OR2.25,95%CI1.10-4.61)都是預測DN、DR的獨立的危險因子，該預測正確率達76.9%。權利要求1.檢測中國血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的芯片，該芯片包括多態(tài)性序列AGT基因的M235T基因型，ALR2基因的(CA)n-5’(z-2)基因型和ALR2基因啟動子區(qū)的C106T基因型，或其互補序列。2.根據(jù)權利要求1所述的芯片，其還包括至少一種選自ACE基因的1/D基因型，TNF-a基因的G-308A基因型，以及其互補序列的多態(tài)性序列。3.根據(jù)權利要求2所述的芯片，其中所述的1/D基因型含有DD基因型。4.根據(jù)權利要求2或3所述的芯片，其中所述的G-308A基因型含有GG基因型。5.根據(jù)權利要求1-4中任一項所述的芯片，其中所述的患者是已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有II型糖尿病的患者。6.檢測中國血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的芯片，該芯片包括多態(tài)性序列TNF-a基因的G-308A基因型，ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型和ALR2基因啟動子區(qū)的C106T基因型，或其互補序列。7.根據(jù)權利要求6所述的芯片，其還包括至少一種選自ACE基因的1/D基因型，AGT基因的M235T基因型，以及其互補序列的多態(tài)性序列。8.檢測中國血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的芯片，該芯片包括多態(tài)性序列ACE基因的I/D基因型，AGT基因的M235T基因型和TNF-a基因的G-308A基因型，或其互補序列。9.根據(jù)權利要求8所述的芯片，其還包括至少一種選自ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型，ALR2基因啟動子區(qū)的C106T基因型，以及其互補序列的多態(tài)性序列。10.檢測中國血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的試劑盒，包括擴增基因AGT的M235T基因型、ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型和ALR2基因啟動子區(qū)的C106T基因型的引物；以及指導如何檢測確定糖尿病患者正已患有、或有可能危險發(fā)展成或疑似患有腎病的指導性材料。11.根據(jù)權利要求10所述的試劑盒，其還包括擴增基因ACE的I/D基因型或TNF-a基因的G-308A基因型的引物。12.根據(jù)權利要求11所述的試劑盒，其中擴增所用的引物為擴增ACE基因的I/D基因型使用的SEQIDNO.1與SEQIDNO.2;擴增AGT基因的M235T基因型使用的SEQIDNO.3與SEQIDNO.4;擴增TNF-a基因的G-308A基因型使用的SEQIDNO.5與SEQIDNO.6;擴增ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型使用的SEQIDNO.7與SEQIDNO.8;或擴增ALR2基因啟動子區(qū)的C106T基因型使用的SEQIDNO.9與SEQIDNO.10。13.檢測中國血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的試劑盒，包括擴增基因TNF-a基因的G-308A基因型、ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型和ALR2基因啟動子區(qū)的C106T基因型的引物；以及指導如何檢測確定糖尿病患者正已患有、或有可能危險發(fā)展成或疑似患有腎病的指導性材料。14.根據(jù)權利要求13所述的試劑盒，其還包括擴增基因ACE的I/D基因型或AGT的M235T基因型的引物。15.根據(jù)權利要求14所述的試劑盒，其中擴增所用的引物為擴增ACE基因的I/D基因型l吏用的SEQIDNO.1與SEQIDNO.2;擴增AGT基因的M235T基因型使用的SEQIDNO.3與SEQIDNO.4;擴增TNF-a基因的G-308A基因型使用的SEQIDNO.5與SEQIDNO.6;擴增ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型使用的SEQIDNO.7與SEQIDNO.8;或擴增ALR2基因啟動子區(qū)的C106T基因型使用的SEQIDNO.9與SEQIDNO.10。16.檢測中國血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的試劑盒，包括擴增基因ACE的1/D基因型、AGT的M235T基因型和TNF-a基因的G-308A基因型的引物；以及指導如何檢測確定糖尿病患者正已患有、或有可能危險發(fā)展成或疑似患有腎病的指導性材料。17.根據(jù)權利要求16所述的試劑盒，其還包括擴增基因ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型和ALR2基因啟動子區(qū)的C106T基因型。18.根據(jù)權利要求17所述的試劑盒，其中擴增所用的引物為擴增ACE基因的I/D基因型使用的SEQIDNO.1與SEQIDNO.2;擴增AGT基因的M235T基因型使用的SEQIDNO.3與SEQIDNO.4;擴增TNF-a基因的G-308A基因型使用的SEQIDNO.5與SEQIDNO.6;擴增ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型使用的SEQIDNO.7與SEQIDNO.8;或擴增ALR2基因啟動子區(qū)的C106T基因型使用的SEQIDNO.9與SEQIDNO.10。全文摘要公開了檢測中國血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成或疑似患有腎病的方法。該方法包括檢測來自糖尿病患者的樣品中是否含有選自ACE基因的I/D基因型，AGT基因的M235T基因型，ALR2基因的(CA)n-5’(z-2)基因型，ALR2基因啟動子區(qū)的C106T基因型，TNF-a基因的G-308A基因型，以及其互補序列多態(tài)性序列的至少一個多態(tài)性序列，條件是ALR2的基因型不單獨使用，其中多態(tài)性序列的存在表明該糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病。本發(fā)明還提供了可用來檢測中國糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的芯片。文檔編號C12Q1/68GK101624630SQ20091016009公開日2010年1月13日申請日期2004年4月15日優(yōu)先權日2004年4月15日發(fā)明者伍楚賢,蘇詠儀,陳重娥申請人:香港中文大學