專利名稱：轉(zhuǎn)化生長因子－beta基因疫苗預(yù)防糖尿病腎病制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防糖尿病合并腎臟病變的保護(hù)性新型疫苗，本發(fā)明特別涉及新的用于防止糖尿病合并癥的基因疫苗，該疫苗能提供抗糖尿病腎臟病變的保護(hù)作用。
隨著我國改革開放和人民生活水平的提高，糖尿病已成為主要嚴(yán)重危害人民身體健康的疾病，臨床流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，在中國糖尿病的發(fā)病人口近12,000,000，同時發(fā)現(xiàn)糖尿病腎臟病變已經(jīng)成為糖尿病患者致死、致殘的主要原因之一。在許多發(fā)達(dá)國家糖尿病腎臟病變已經(jīng)成為終末期腎病的主要原因，占透析和腎移植病人的1/3。因此，了解糖尿病腎臟病變的發(fā)生機(jī)制和防治糖尿病腎臟病變的發(fā)生是當(dāng)前糖尿病研究的重點課題之一。
目前科研工作者們?nèi)匀晃茨苊鞔_糖尿病引起腎臟病變的機(jī)制。提出糖尿病引起腎臟病變的學(xué)說涉及各個領(lǐng)域。其中主要有以下幾個1、與糖尿病發(fā)病有關(guān) 1)胰島素基因區(qū)胰島素Ⅰ類等位基因純合子患糖尿病腎臟病變的危險性為其它類型胰島素基因類型的2倍。2)人白細(xì)胞相關(guān)抗原(HLA)HLA-DR3是糖尿病腎臟病變的候選基因。2、與血壓調(diào)節(jié)相關(guān) 從目前來看研究的重點集中在腎素-血管緊張素系統(tǒng)Marre等檢測62例糖尿病腎臟病變患者，其中37例為早期糖尿病腎病，25例為臨床糖尿病腎病。早期腎病組與臨床腎病組患者血漿血管緊張素水平無顯著性差異，血漿血管緊張素水平與基因型明顯相關(guān)。3、糖尿病非酶性糖化 糖尿病患者存在糖代謝異常，高血糖可以誘發(fā)機(jī)體組織與葡萄糖發(fā)生非酶性糖化。4、激肽系統(tǒng) Mayfield等發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠尿中激肽釋放酶排量低于對照組。5、腎小球組成成分 如Ⅳ型膠原、硫酸肝素等基因編碼異常與糖尿病腎病的發(fā)病率增高明顯相關(guān)。盡管對糖尿病腎臟病變的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了廣泛的研究，然而目前關(guān)于糖尿病腎臟病變的所有治療措施均不能阻止其發(fā)生。
現(xiàn)在，臨床上所應(yīng)用于有關(guān)糖尿病腎臟病變的治療主要包括以下幾個方面1、控制血糖 糖尿病血糖水平與糖尿病腎臟病變相關(guān)性仍有爭論，但是抑制糖尿病血糖長期紊亂有助于延緩糖尿病腎臟病變的發(fā)生。2、血壓的控制 現(xiàn)在認(rèn)為糖尿病腎臟病變的發(fā)生與高血壓控制情況明顯相關(guān)。世界高血壓聯(lián)盟提出了較高的血壓控制水平，在24小時尿蛋白小于1克，血壓維持應(yīng)低于130/80mmHg，并指出血壓控制的情況，決定著終末期腎臟病變到達(dá)的時間。3、禁止吸煙 吸煙可導(dǎo)致腎血流改變，加重腎臟的負(fù)擔(dān)。這些治療措施明顯延緩糖尿病腎臟病變發(fā)生的時間，但不能阻止其發(fā)生。因此，預(yù)防和治療糖尿病腎臟病變發(fā)生是一個具有普遍性的難題。
有很多資料報道了轉(zhuǎn)化生長因子-beta在糖尿病腎臟病變發(fā)病機(jī)制中的中心作用。轉(zhuǎn)化生長因子-beta是轉(zhuǎn)化生長因子-beta超家族中的一員，它具有三種同功異構(gòu)體，其作用在靶細(xì)胞的作用位點不同。轉(zhuǎn)化生長因子-beta主要通過自分泌和旁分泌機(jī)制發(fā)揮其生物功能。在糖尿病腎臟病變動物模型中，轉(zhuǎn)化生長因子-beta mRNA高表達(dá)是長期持續(xù)存在的，到糖尿病腎臟病變晚期，轉(zhuǎn)化生長因子-beta的表達(dá)方呈下降的趨勢。Takashi等應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子-beta mRNA的表達(dá)在正常大鼠腎臟各個部位均可以檢測到。轉(zhuǎn)化生長因子-beta對于維持腎臟結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定起重要作用。但是糖尿病合并腎臟病變時，轉(zhuǎn)化生長因子-beta cDNA明顯增高可以導(dǎo)致腎小球硬化，其病理結(jié)構(gòu)表現(xiàn)在腎小球基底膜增厚、腎小球膜基質(zhì)擴(kuò)張和細(xì)胞外基質(zhì)的重構(gòu)。
本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)化生長因子-beta基因疫苗預(yù)防糖尿病腎病制劑，該制劑能有效地預(yù)防糖尿病腎臟病變的發(fā)生。
為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案在于采用了一種轉(zhuǎn)化生長因子-beta基因疫苗預(yù)防糖尿病腎病制劑，其含有轉(zhuǎn)化生長因子-beta、質(zhì)粒DNA。
該轉(zhuǎn)化生長因子-beta基因疫苗預(yù)防糖尿病腎病制劑為可以直接作為基因疫苗的特別優(yōu)選的重組DNA質(zhì)粒以及編碼轉(zhuǎn)化生長因子-beta片段的基因。
轉(zhuǎn)化生長因子-beta基因是研究工作者們認(rèn)識較早的一個功能基因，在本實施例中應(yīng)用轉(zhuǎn)化生長因子的序列信息設(shè)計寡核苷酸引物，用于從機(jī)體中用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增該基因，新設(shè)計的引物兩端含有兩個特異限制性內(nèi)切酶識別位點，使擴(kuò)增的質(zhì)粒可以通過相出的限制性內(nèi)切酶切后直接克隆到一個質(zhì)粒載體上。
在本發(fā)明中所使用的優(yōu)選DNA構(gòu)建物優(yōu)點在于允許該構(gòu)建物在微生物中進(jìn)行繁殖，如大腸桿菌，通過這種方法構(gòu)建成功的DNA構(gòu)建物可進(jìn)行大量結(jié)構(gòu)相同的繁殖。
當(dāng)新克隆出的轉(zhuǎn)化生長因子-beta基因以直接方式插入質(zhì)粒DNA而直接整合出一個完整的表達(dá)基因，即在機(jī)體內(nèi)表達(dá)出轉(zhuǎn)化生長因子-beta，這種肽段可以通過機(jī)體的抗原遞呈細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)揮作用。
本發(fā)明特別有利之處在于，以非常低劑量的抗原，該疫苗組合物也能誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)有效的保護(hù)作用。
該新型疫苗可以根據(jù)動物個體、種屬、免疫特征的不同而不同，但是在對下面的小鼠動物模型進(jìn)行接種時，我們發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用該新型疫苗劑量20～100μg時，按免疫程序能有效地提供保護(hù)作用。
本發(fā)明所提供的新型疫苗為非口服載劑，可用微滴或其它微束體形式進(jìn)行接種，它們可以有效地將免疫反應(yīng)物運(yùn)送到細(xì)胞，從而引發(fā)免疫反應(yīng)，并可以有效地降低或抑制轉(zhuǎn)化生長因子-beta在糖尿病腎臟病變的表達(dá)。
以下具體說明了本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容及其優(yōu)點。
一、轉(zhuǎn)化生長因子-beta基因疫苗的制備本發(fā)明擬采用以下手段構(gòu)建轉(zhuǎn)化生長因子-beta基因疫苗，以防止糖尿病腎臟病變的發(fā)生1、按基因文庫報道的轉(zhuǎn)化生長因子-beta基因序列。應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增轉(zhuǎn)化生長因子-beta mRNA片段，并且進(jìn)行測序以檢驗所得到的多核苷酸片段為轉(zhuǎn)化生長因子-beta片段。特別需要明確的一點是在合成轉(zhuǎn)化生長因子-beta片段時，該片段的兩端帶有特異性限制性內(nèi)切酶，用以保證所克隆出轉(zhuǎn)化生長因子-beta能有效地以合理的序列連接到DNA質(zhì)粒中。
2、在以合成的轉(zhuǎn)化生長因子-beta片段在與適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切后的質(zhì)粒DNA連接，導(dǎo)入到大腸桿菌中擴(kuò)增，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)罔b定。
二、轉(zhuǎn)化生長因子-beta基因疫苗對糖尿病腎臟病變的抑制作用糖尿病腎臟病變發(fā)生時，轉(zhuǎn)化生長因子-beta具有重要地位，對轉(zhuǎn)化生長因子-beta與糖尿病腎臟病變關(guān)系的研究可能為診治糖尿病腎臟病變提供新的途徑。
轉(zhuǎn)化生長因子-beta在糖尿病腎臟病變發(fā)病中的中心作用主要表現(xiàn)在以下幾個方面1、轉(zhuǎn)化生長因子-beta在糖尿病時對腎小球的影響近年來研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病發(fā)病時，高血糖、腎小球囊內(nèi)壓升高和糖化血紅蛋白均有助于轉(zhuǎn)化生長因子-beta在腎臟中的表達(dá)升高，而轉(zhuǎn)化生長因子-beta的升高可以有效地刺激細(xì)胞外基質(zhì)成分，如Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ型膠原、層粘連蛋白mRNA表達(dá)增加，導(dǎo)致硫酸乙酰肝素/Ⅳ型膠原比率相對降低，破壞腎小球濾過膜的電荷屏障以及分子屏障，并且與白蛋白尿的排泄呈正相關(guān)。
除此以外，轉(zhuǎn)化生長因子-beta能提高細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞受體，如細(xì)胞粘附蛋白受體的表達(dá)，增加細(xì)胞外基質(zhì)的聚集性。腎臟肥大可能與轉(zhuǎn)化生長因子-beta表達(dá)增加有關(guān)。
2、轉(zhuǎn)化生長因子-beta在糖尿病時對腎小管及間質(zhì)病變的作用糖尿病腎臟病變中，腎臟間質(zhì)纖維化與腎小球系膜擴(kuò)張、腎小球濾過率下降以及蛋白尿的增加有較強(qiáng)的相關(guān)性。體外實驗顯示，高糖可以刺激腎臟近曲小管細(xì)胞合成膠原和轉(zhuǎn)化生長因子-beta基因轉(zhuǎn)錄。
Gilbert等發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠腎小管內(nèi)皮細(xì)胞以及周圍間質(zhì)細(xì)胞中存在著彌散性的轉(zhuǎn)化生長因子-beta以及Ⅳ型膠原mRNA表達(dá)增強(qiáng)，而且在局部擴(kuò)張性的腎小管表達(dá)尤為顯著。以上基因改變與其相應(yīng)的免疫組織化學(xué)改變是一致的。
綜上所述，研究工作者們推測轉(zhuǎn)化生長因子-beta是糖尿病腎臟病變發(fā)病機(jī)制的最后共同通路。即在高血糖條件下，多種生物化學(xué)異常以及微循環(huán)障礙共同參與糖尿病腎臟病變的發(fā)生，包括蛋白激酶C途徑、蛋白非酶性糖化、氧化應(yīng)激、腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性增加等因素，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-beta，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)積聚、腎小球硬化。
因此，在此基礎(chǔ)上，Sharma表明體外培養(yǎng)腎小球時，給予轉(zhuǎn)化生長因子-beta中和性抗體能明顯抑制腎臟組織轉(zhuǎn)化生長因子-beta mRNA表達(dá)并減輕細(xì)胞外基質(zhì)地進(jìn)行性積聚。Kolm等發(fā)現(xiàn)，在體外高糖條件下，培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)液中加入轉(zhuǎn)化生長因子-beta反義基因可有效地抑制腎小球系膜細(xì)胞的增生以及其產(chǎn)生層粘連蛋白、硫酸肝素多糖和Ⅳ型膠原。Kashihara的研究也得出同樣的結(jié)論。但是反義基因作為基因治療的手段仍有許多缺點，如反義基因難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并較為容易被核酸酶降解。而應(yīng)用基因疫苗則可以有效地克服這些缺點。
1990年，Wolff偶然發(fā)現(xiàn)將裸DNA質(zhì)粒注射到小鼠的骨骼肌中，骨骼肌可以直接攝取質(zhì)粒DNA，并產(chǎn)生小量的基因翻譯產(chǎn)物，由此得出的結(jié)論為編碼抗原DNA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)為疫苗的發(fā)展開辟了一條新的途徑。
本發(fā)明提出的應(yīng)用轉(zhuǎn)化生長因子-beta基因疫苗預(yù)防糖尿病腎臟病變的發(fā)生。其理論基礎(chǔ)在于給機(jī)體注射基因疫苗后，輔助性T淋巴細(xì)胞和相關(guān)的MHC抗原提供編碼疫苗基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的場所。肌肉細(xì)胞合成的由基因疫苗目的基因編碼的多肽和/或蛋白質(zhì)為機(jī)體特異性免疫細(xì)胞提供特異性的抗體，并起到保護(hù)性免疫反應(yīng)的作用。在給機(jī)體注射含轉(zhuǎn)化生長因子-beta的基因疫苗能有效地刺激出針對轉(zhuǎn)化生長因子-beta的免疫反應(yīng)，使轉(zhuǎn)化生長因子-beta在體內(nèi)含量減少，從而中止糖尿病腎臟病變的共同通路。
在上述理論的基礎(chǔ)上，應(yīng)用轉(zhuǎn)化生長因子-beta基因疫苗防止糖尿病腎臟病變的發(fā)生不僅是可能的，而且是可行的。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)化生長因子-beta基因疫苗預(yù)防糖尿病腎病制劑，其特征在于，該制劑含有轉(zhuǎn)化生長因子-beta、質(zhì)粒DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因疫苗預(yù)防糖尿病腎病制劑，其特征在于，該制劑為可以直接作為基因疫苗的特別優(yōu)選的重組DNA質(zhì)粒以及編碼轉(zhuǎn)化生長因子-beta片段的基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)防糖尿病合并腎臟病變的保護(hù)性新型疫苗,本發(fā)明特別涉及新的用于防止糖尿病合并癥的基因疫苗制劑,該疫苗能提供抗糖尿病腎臟病變的保護(hù)作用。該疫苗制劑含有轉(zhuǎn)化生長因子－beta、質(zhì)粒DNA。該制劑為可以直接作為基因疫苗的特別優(yōu)選的重組DNA質(zhì)粒以及編碼轉(zhuǎn)化生長因子－beta片段的基因。
文檔編號A61K38/16GK1322572SQ0110904
公開日2001年11月21日 申請日期2001年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月28日
發(fā)明者錢慶文 申請人:錢慶文