專利名稱：一種自動快速鑒定蛋白磷酸化位點的數(shù)據(jù)處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白磷酸化位點的檢測和鑒定，特別涉及生物生命活動中 的調(diào)控環(huán)節(jié)以及疾病發(fā)病機(jī)理研究中，運用液相色譜一多級串聯(lián)質(zhì)譜自動 快速的鑒定高可信度磷酸化位點的方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)磷酸化是生物界最普遍,也是最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾。
在哺乳動物細(xì)胞生命周期中,大約有1/3的蛋白質(zhì)發(fā)生過磷酸化修飾，在人 類基因組中,大約有2%的基因編碼了 500種激酶和100種磷酸酶。蛋白質(zhì)磷 酸化和去磷酸化是原核和真核生物細(xì)胞表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié),對許多生物的 細(xì)胞功能起開關(guān)調(diào)控作用，是一種普遍的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。蛋白質(zhì)的磷酸化和 去磷酸化這一可逆過程幾乎調(diào)節(jié)著包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)活動、肌肉收縮及腫瘤發(fā)生等過程在內(nèi)的所有生命活 動,目前已經(jīng)知道有許多人類疾病是由于異常的磷酸化修飾所引起,而有些 磷酸化修飾卻是某種疾病所導(dǎo)致的后果。鑒于磷酸化修飾在生命活動中所 具有的重要意義,探索磷酸化修飾過程的奧秘及其對功能的影響已成為眾多 生物化學(xué)家及蛋白組學(xué)家所關(guān)心的內(nèi)容。
在質(zhì)譜技術(shù)產(chǎn)生前,蛋白磷酸化位點的鑒定一般應(yīng)用Edman降解法,通 過磷酸絲氨酸向S2乙基半胱氨酸或磷酸蘇氨酸向|32甲基S2乙基半胱氨酸 的轉(zhuǎn)化,獲得磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸存在的證據(jù)。隨著質(zhì)譜技術(shù)的產(chǎn)生和 蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展,串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)逐漸被廣泛的應(yīng)用于蛋白質(zhì)磷酸化位點的 分析。在串聯(lián)質(zhì)譜儀的前體離子掃描、中性丟失掃描等陰、陽離子模式下, 磷酸肽經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離(CID)產(chǎn)生的特異性片段,分別丟失80Da(HPO3)和 98Da (H3P04)的子離子，檢測所產(chǎn)生的全部碎片離子,根據(jù)碎片離子質(zhì)量數(shù) 通過數(shù)據(jù)庫檢索來推斷肽段序列和磷酸化位點。運用質(zhì)譜進(jìn)行磷酸化位點 鑒定的優(yōu)點是高選擇性、高靈敏度。
但是，由于磷酸化肽段在串聯(lián)質(zhì)譜分析過程中容易丟失磷酸(98Da) 形成很強(qiáng)的中性丟失碎片離子峰，因而難以進(jìn)一步碎裂形成可以運用于數(shù) 據(jù)庫匹配的碎片信息，齒此所獲得的二級譜圖的質(zhì)量比較差，不利于磷酸 化肽段的鑒定。而且由于數(shù)據(jù)庫匹配過程時理論肽段中磷酸化肽段的數(shù)目 要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非磷酸化肽段(可變修飾造成了理論磷酸化肽段數(shù)目的劇增)， 由于隨機(jī)匹配造成的錯誤鑒定的肽段中磷酸化肽段的數(shù)目要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非磷 酸化肽段，因此，相同的篩選條件下鑒定得到的磷酸肽的假陽性率也要遠(yuǎn) 遠(yuǎn)高于非磷酸化肽段。針對這種情況，目前常用手工校正的方法來確定最 終的磷酸化肽段，以控制假陽性結(jié)果的產(chǎn)生,蛋白磷酸化位點鑒定的準(zhǔn)確性和通量都受到了很大的限制。最近，Beausoleil等人運用高質(zhì)量精度的傅立 葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀通過精確的母離子質(zhì)量數(shù)的測定直接利用假陽 性率的限定分別對二級譜和三級譜進(jìn)行了單獨的大規(guī)模鑒定Beausoleil, S.A,A^/.所ofec/z"o/.， 2006,24(10), 1285-1292，但是由于高精度質(zhì)譜儀器價 格昂貴，而普通的質(zhì)譜儀器往往難以達(dá)到如此高的質(zhì)量精度，因此該方法 的應(yīng)用范圍得到了很大的限制。而普通的離子阱質(zhì)譜儀相對比較便宜，是 大多數(shù)實驗室進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析的主要儀器。利用離子阱質(zhì)譜儀可以很方 便的將二級譜中的中性丟失峰再破碎形成三級譜圖(MS/MS/MS)。三級譜圖 含有比較豐富的碎片離子峰，三級譜圖所鑒定的磷酸肽結(jié)果是二級譜圖鑒 定結(jié)果的驗證和補(bǔ)充。以往利用二級譜圖和三級譜圖進(jìn)行磷酸化肽鑒定時， 對二級譜圖和三級譜圖的檢索結(jié)果分別篩選，并且僅對各自排名第一的磷 酸肽段進(jìn)行匹配，結(jié)果不盡理想。本發(fā)明提出了一種主動匹配的數(shù)據(jù)處理 方法，將二級譜圖和三級譜圖的檢索結(jié)果中所有符合條件的磷酸肽的鑒定 進(jìn)行匹配，在實現(xiàn)磷酸化肽的高可信鑒定的同時提高了鑒定的靈敏度；并 且本方法與混合數(shù)據(jù)庫檢索相結(jié)合還能給出鑒定磷酸化肽的假陽性率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種自動快速鑒定蛋白磷酸化位點的數(shù)據(jù)處理 方法，其提高了磷酸肽鑒定的準(zhǔn)確性和可信度，克服了目前磷酸肽鑒定時 為了提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性而采用的手工校正的繁雜性。該方法通過主動 匹配二級譜和對應(yīng)的三級譜的鑒定結(jié)果，有效的減少了隨機(jī)匹配的數(shù)目， 提高了鑒定的可信度；不僅僅使用譜圖匹配中排名第一的序列， 一定程度 上克服了由磷酸化肽段特性造成的骨架碎片少而不利于鑒定的問題，提高 了檢測的靈敏度；與混合數(shù)據(jù)庫結(jié)合使用，可以得到最終鑒定結(jié)果的可信 度，方便了鑒定結(jié)果的評估。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過調(diào)節(jié)門檻值主動匹配肽段的二級譜圖 (MS2)和由其丟失磷酸(98Da)所形成的特征中性丟失離子得到的三級 譜圖(MS3)的數(shù)據(jù)庫搜索所產(chǎn)生的磷酸肽的序列，得到高可信度磷酸化 位點鑒定結(jié)果的方法。利用包含蛋白質(zhì)真序列和偽序列的組合數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 檢索獲得磷酸肽鑒定假陽性率的方法。本發(fā)明采用技術(shù)方案為
一種自動快速鑒定蛋白磷酸化位點的數(shù)據(jù)處理方法，
1) 以蛋白酶解液為上樣樣品，上樣樣品為磷酸肽混合物，磷酸肽混合 物經(jīng)毛細(xì)管反相液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用分析，利用納米電噴霧離子源直接進(jìn) 入質(zhì)譜進(jìn)行分析；質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴掃描模式,中性丟失核質(zhì)比設(shè)為 98,49,32.7,質(zhì)譜的掃描范圍為M/z400—2000;獲得色譜和質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)；
2) A.譜圖篩選及磷酸肽的數(shù)據(jù)庫搜索首先利用MS2和MS3的母 離子的m/z的差值，確定離子所帶的電荷數(shù)，進(jìn)而去除價態(tài)不符的譜圖； 然后根據(jù)蛋白樣品的來源選擇對應(yīng)的數(shù)據(jù)庫搜索，對質(zhì)譜的每一個MS2和 MS3譜圖數(shù)據(jù)分別進(jìn)行匹配，得到樣品氨基酸序列信息；或者B.磷酸肽的數(shù)據(jù)庫搜索及氨基酸序列信息篩選首先根據(jù)蛋白
樣品的來源選擇對應(yīng)的數(shù)據(jù)庫搜索，對質(zhì)譜的每一個MS2和MS3譜圖數(shù)據(jù) 分別進(jìn)行匹配，得到樣品氨基酸序列信息；然后利用MS2和MS3的母離子 的m/z的差值，確定離子所帶的電荷數(shù)，進(jìn)而去除價態(tài)不符的氨基酸序列；
3) 將MS3以及其對應(yīng)的MS2匹配得到的樣品氨基酸序列信息進(jìn)行比 較，選擇同時出現(xiàn)的樣品氨基酸序列信息；并且從中選擇一個相互加和打 分最高的MS3以及其對應(yīng)的MS2匹配得到的樣品氨基酸序列信息；獲得一 系列的樣品氨基酸序列信息；
4) 根據(jù)所獲得的一系列樣品氨基酸序列信息中反映的假陽性率依次提 高數(shù)據(jù)篩選的門檻值，得到假陽性率30%的氨基酸序列信息，較好為假陽 性率3%的氨基酸序列信息，最好為假陽性率2%的氨基酸序列信息，假陽 性率采用反向數(shù)據(jù)庫檢索的方式確定，根據(jù)氨基酸序列信息即可確定蛋白 的磷酸化位點。
所述質(zhì)譜可為離子阱質(zhì)譜，磷酸肽混合物中磷酸肽的氨基酸序列長度 通常為6-35個。
具體為蛋白樣品經(jīng)蛋白酶酶解以后的肽段混合物，經(jīng)富集除鹽后，
在毛細(xì)管液相色譜—串連質(zhì)譜聯(lián)用的分析條件下，根據(jù)磷酸肽容易發(fā)生丟
失磷酸(H3P04,98Da),生成特征性的中性丟失碎片的原理，利用二級譜，
與其對應(yīng)的中性丟失碎片離子得到的三級譜的數(shù)據(jù)庫鑒定結(jié)果的匹配，通
過價態(tài)的篩選，門檻值的設(shè)定，進(jìn)而得到高可信度的磷酸化位點的鑒定結(jié)
果。假陽性率按照反向數(shù)據(jù)庫搜索的方法確定Peng JM，J /V她謹(jǐn)ei 仏2(1)
43-50。數(shù)據(jù)搜索過程中的數(shù)據(jù)庫采用混合數(shù)據(jù)庫來代替常規(guī)的只包含正常
序列的數(shù)據(jù)庫，該混合數(shù)據(jù)庫是有正確序列與其反向序列(偽序列)組合
在一起構(gòu)成的。偽序列在最終鑒定結(jié)果中出現(xiàn)的比例(隨機(jī)匹配的幾率)
指示了檢索結(jié)果的可信度。門檻值的設(shè)定根據(jù)具體樣品和可信度的不同而 確定。
參見附圖1所示，具體操作流程如下，
(1) 蛋白樣品經(jīng)毛細(xì)管反相液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜分析，在中性丟失掃 描的條件下，采集二級譜，并對由母離子丟失了98， 49或32.7質(zhì)量形成的 中性碎片進(jìn)行三級譜掃描。
(2) 利用二級譜和三級譜的母離子的M/z的差值對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選。 通常條件下，磷酸化肽段只能丟失一個磷酸(98Da)，因此根據(jù)該M/z的差
與磷酸分子量的比值，可以確定離子所帶的電荷數(shù)，進(jìn)而去除與母離子價 態(tài)不符的導(dǎo)出數(shù)據(jù)結(jié)果。
^ (3)使用數(shù)據(jù)庫^索軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫的檢索，然后對檢索結(jié)果進(jìn)行排名 (Rank)的重排對于連續(xù)的序列相同但是磷酸化位點不同的肽段，將它 們的排名歸為最小的排名值。
(4)選取對應(yīng)的二級譜和三級譜中的所有鑒定序列進(jìn)行匹配。序列，磷
5酸化位點的數(shù)目，位置完全相同的肽段為有效匹配，對于同一二級譜、三 級譜匹配下多于一個有效匹配序列的情況，只選用匹配結(jié)果中打分之和最 大的肽段。
(5)對匹配結(jié)果進(jìn)行門檻值篩選，得到確定可信度下的磷酸化肽段。通 過門檻值的篩選，控制根據(jù)偽序列的比例計算得到的假陽性率，得到最終 鑒定結(jié)果及其可信度。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點
1. 由于絕大部分磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸以及小部分的磷酸酪氨酸在
質(zhì)譜碰撞過程中都會丟失磷酸形成特征的中性丟失碎片DeGnore JP et al. / j附.Maw Spec/ram. 9(11) 1175-1188，并且三種氨基酸在真核生物中的 比例大約為1800: 200: Venter JC et al. 5We"ce 291(5507) 1304-1351,
因此該方法可以適用于大多數(shù)的磷酸化肽段，并且由于采用了結(jié)合匹配的 原則，只有同時能匹配二級譜和三級譜的肽段才能夠被認(rèn)為是有效匹配， 極大的提高了磷酸化肽段鑒定的可信度。
2. 通過門檻值調(diào)節(jié)來控制結(jié)果的可信度，避免了手工校正的繁雜性， 快速，準(zhǔn)確的獲得高可信度的鑒定結(jié)果。
3. 所有二級譜和對應(yīng)的三級譜的鑒定結(jié)果都應(yīng)用于匹配。由于磷酸化 肽段丟失中性碎片后骨架碎片很少，容易造成的其它噪聲匹配排名靠前， 該方法克服了常規(guī)的只考慮排名第一的匹配造成的遺漏問題，提高了鑒定
4. 鑒定結(jié)果的可信度通過假陽性率的評估得到，有效的避免了手工校 正過程中的人為因素。


圖1為本發(fā)明鑒定蛋白磷酸化位點的流程圖。
圖2為實施例1中，利用本發(fā)明對a酪蛋白酶解以后磷酸化肽段的鑒 定時，在門檻值的篩選過程中，篩選條件以及在該條件下得到的磷酸化肽 段的數(shù)目。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明加以進(jìn)一步的說明.但它們不對本發(fā)明 作任何限制。
通用方法
實施例1和實施例2中樣品的制備和數(shù)據(jù)采集相同，具體過程如下 蛋白的酶解條件緩沖液為pH8.5磷酸鹽緩沖液，尿素濃度為8mol/L。 蛋白樣品溶解到緩沖液中以后，首先于37。C下使用二硫蘇糖醇還原其中的 二硫鍵，反應(yīng)時間為2h。再使用碘乙酰胺封閉巰基，反應(yīng)為閉光2h。然后 使用胰蛋白酶按l: 50于37。C下酶解反應(yīng)過夜。
磷酸肽的質(zhì)譜檢測條件磷酸肽混合物經(jīng)毛細(xì)管液相色譜一離子阱質(zhì)
譜聯(lián)用分析，其中毛細(xì)管液相色譜采用內(nèi)徑為75pmC18毛細(xì)管柱，流動相為(A)0.P/。甲酸水溶液(B)0.1。/。甲酸水溶液/乙腈，通過梯度洗脫，梯度為35 分鐘內(nèi)從100%的A溶液逐漸變化為35%的B溶液，利用納米電噴霧 (nano-ESI)離子源直接進(jìn)入離子阱質(zhì)譜進(jìn)行分析。質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴掃描 (Data Dependant Neutral Loss MS3)模式，中性丟失核質(zhì)比(M/z)設(shè)為 98,49,32.7,中性丟失產(chǎn)生的碎片離子必須是二級譜中強(qiáng)度居于前三位的離 子之一。質(zhì)譜的掃描范圍為M/z400—1800。
磷酸肽的數(shù)據(jù)庫搜索和鑒定條件數(shù)據(jù)庫搜索算法采用Sequestv2.7， 母離子的容忍度為士2amu,碎片離子的容忍度為士lamu，均使用單同位素質(zhì) 量。假陽性率采用反向數(shù)據(jù)庫檢索的方式確定。匹配鑒定方法首先利用MS2 和MS3的母離子的m/z的差值，確定離子所帶的電荷數(shù)，進(jìn)而去除價態(tài)不 符的譜圖。對經(jīng)過價態(tài)篩選以后的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫的搜索，然后對檢索結(jié) 果進(jìn)行排名(Rank)的重排對于連續(xù)的序列相同但是磷酸化位點不同的 肽段，將它們的排名歸為最小的排名值，選取對應(yīng)的MS2和MS3中排名為 前5的序列進(jìn)行匹配。序列，磷酸化位點的數(shù)目，位置完全相同的肽段為 有效匹配，對于同一MS2、 MS3匹配下多于一個有效匹配的情況，只選用 匹配結(jié)果中Xcorr之和最大的肽段，然后對匹配結(jié)果進(jìn)行門檻值篩選，得到 確定可信度下的磷酸化肽段。
數(shù)據(jù)篩選的門檻值條件采用多個門檻值條件，首先采用重排以后的 排名(Rank), —般情況下排名小于5。然后利用數(shù)據(jù)庫搜索中MS2和MS3 譜圖匹配該序列的Xcorr值之和，按照Keller的方法計算Xcorr'值Keller A et al. Anal. Chem. 74(20) 5383-5392，消除肽段序列長度對Xcorr值的影響， Rsp最大值為MS2和MS3譜圖匹配時的Rsp的最大值，通過調(diào)節(jié)Xcorr， 和Rsp最大值，得到指定可信度下的磷酸化肽段的鑒定結(jié)果。
實施例l應(yīng)用于單個蛋白的磷酸化位點的鑒定
a酪蛋白(a-Casein)經(jīng)胰蛋白酶于37'C酶解以后，SPE除鹽，凍干， 0.1%甲酸水溶液復(fù)溶，取2pmo1直接進(jìn)行毛細(xì)管液相色譜一 串聯(lián)質(zhì)譜分析。 檢索數(shù)據(jù)庫采用a酪蛋白跟酵母總蛋白的混合數(shù)據(jù)庫。搜索結(jié)果匹配以后， 使用最大排名值為l， Xcorr'值大于0.57進(jìn)行篩選，可以將錯誤匹配的肽段 (來自酵母蛋白的肽段)有效的分開，最終得到鑒定結(jié)果。
如圖2所示，通過匹配得到的肽段中，假陽性結(jié)果(匹配為酵母蛋白 的肽段)僅為30%左右，當(dāng)使用排名篩選，和利用Xcorr'篩選以后，可以 將假陽性結(jié)果完全排除，而來自a酪蛋白的肽段絕大多數(shù)都得到了保留， 可以看出該方法可以有效的分辨磷酸化肽段鑒定中的假陽性結(jié)果，進(jìn)而可 以對假陽性結(jié)果進(jìn)行有效的篩除。并且與常規(guī)的直接設(shè)定門檻值來控制結(jié) 果的可信度的方法相比，本方法得到的鑒定結(jié)果中，磷酸化肽段的數(shù)目得 到了很大的提高。比較結(jié)果見表一。
表1本發(fā)明與常規(guī)篩選方法鑒定得到的a酪蛋白中磷酸化肽段的數(shù)目比較常規(guī)
磷酸化位本發(fā)篩選No.MH+/(Da)點的數(shù)目明方法
PI769.351々
P2954.411々 々
P31979.841々
P41660.791V 々
P51951.951
P61466.611V
P7927.692々
P81847.691々
P92619.044々
P101411.502
Pll3008.014
P122720.915々
實施例2 應(yīng)用于蛋白組樣品中磷酸化位點的鑒定
提取肝癌病人的肝臟癌旁組織蛋白，考馬斯亮蘭定量法檢測提取以后 的蛋白濃度為2pg/pL,取lmg經(jīng)胰蛋白酶酶解37'C酶解16h以后，酶解肽 段直接上樣到SAX色譜柱富集，溶劑A (40 mM NH4C1 / 30%乙腈,pH 4.0) 平衡5min，然后利用梯度洗脫。洗脫溶劑為溶劑A和溶劑B(1M NH4C1 / 30%乙腈，pH 4.0);梯度設(shè)置為0—10min，洗脫液組成由100%溶劑A 線性增加到100%溶劑B，然后使用1000/^溶劑B等度洗脫。每2分鐘收集 一個流分，分成8個流分分別收集，樣品除鹽后，凍干復(fù)溶，取每組分1/4 進(jìn)行毛細(xì)管液相 一 串聯(lián)質(zhì)譜分析。
使用混合數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，該數(shù)據(jù)庫包含人總蛋白數(shù)據(jù)庫(IPI Human v3.17)和其反方向數(shù)據(jù)庫(偽序列)。搜索結(jié)果進(jìn)行匹配以后，使用 最大排名不大于5， Xcorr'大于0.594，進(jìn)行篩選，最終得到可信度>99%的 磷酸肽的鑒定結(jié)果?？偣茶b定了 138條磷酸化肽段，其中103條為單磷酸 化肽段，35條為多磷酸化肽段。總共確定了 125個高可信度的磷酸化位點。
權(quán)利要求
1.一種自動快速鑒定蛋白磷酸化位點的數(shù)據(jù)處理方法，其特征在于1)以蛋白酶解液為上樣樣品，磷酸肽混合物經(jīng)毛細(xì)管反相液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，利用納米電噴霧離子源直接進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行分析；質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴掃描模式，中性丟失核質(zhì)比設(shè)為98，49，32.7，質(zhì)譜的掃描范圍為M/z400-2000；獲得色譜和質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)；2)A.譜圖篩選及磷酸肽的數(shù)據(jù)庫搜索首先利用MS2和MS3的母離子的m/z的差值，確定離子所帶的電荷數(shù)，進(jìn)而去除價態(tài)不符的譜圖；然后根據(jù)蛋白樣品的來源選擇對應(yīng)的數(shù)據(jù)庫搜索，對質(zhì)譜的每一個MS2和MS3譜圖數(shù)據(jù)分別進(jìn)行匹配，得到樣品氨基酸序列信息；或者B.磷酸肽的數(shù)據(jù)庫搜索及氨基酸序列信息篩選首先根據(jù)蛋白樣品的來源選擇對應(yīng)的數(shù)據(jù)庫搜索，對質(zhì)譜的每一個MS2和MS3譜圖數(shù)據(jù)分別進(jìn)行匹配，得到樣品氨基酸序列信息；然后利用MS2和MS3的母離子的m/z的差值，確定離子所帶的電荷數(shù)，進(jìn)而去除價態(tài)不符的氨基酸序列；3)將MS3以及其對應(yīng)的MS2匹配得到的樣品氨基酸序列信息進(jìn)行比較，選擇同時出現(xiàn)的樣品氨基酸序列信息；并且從中選擇一個相互加和打分最高的MS3以及其對應(yīng)的MS2匹配得到的樣品氨基酸序列信息；獲得一系列的樣品氨基酸序列信息；4)根據(jù)所獲得的一系列樣品氨基酸序列信息中反映的假陽性率依次提高數(shù)據(jù)篩選的門檻值，得到假陽性率≤10％的氨基酸序列信息，假陽性率采用反向數(shù)據(jù)庫檢索的方式確定，根據(jù)氨基酸序列信息即可確定蛋白的磷酸化位點。
2. 按照權(quán)利要求1所述的數(shù)據(jù)處理方法，其特征在于所述質(zhì)譜為離 子阱質(zhì)譜。
3. 按照權(quán)利要求1所述的數(shù)據(jù)處理方法，其特征在于所述磷酸肽混 合物中磷酸肽的氨基酸序列長度為6-35個。
4. 按照權(quán)利要求1所述的數(shù)據(jù)處理方法，其特征在于所述步驟4)根 據(jù)所獲得的一系列樣品氨基酸序列信息中反映的假陽性率依次提高數(shù)據(jù)篩 選的門檻值，得到假陽性率3%的氨基酸序列信息。
5. 按照權(quán)利要求1所述的數(shù)據(jù)處理方法，其特征在于所述步驟4)根 據(jù)所獲得的一系列樣品氨基酸序列信息中反映的假陽性率依次提高數(shù)據(jù)篩 選的門檻值，得到假陽性率^1%的氨基酸序列信息。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白磷酸化位點的檢測和鑒定，特別是一種自動快速鑒定蛋白磷酸化位點的數(shù)據(jù)處理方法，其通過納噴毛細(xì)管液相色譜—多級串聯(lián)質(zhì)譜高通量鑒定生物樣品中蛋白磷酸化位點。該方法根據(jù)磷酸化肽段離子在質(zhì)譜中容易丟失磷酸形成特征性的中性丟失碎片離子，進(jìn)而可以利用多級質(zhì)譜對碎片離子進(jìn)行三級譜分析的原理，結(jié)合假陽性率評估，利用MS3與其對應(yīng)的二級譜數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果的匹配，通過門檻值的設(shè)定方便的實現(xiàn)特定可信度下的蛋白磷酸化位點的鑒定。與目前常用的手工校正的方法相比，本發(fā)明的優(yōu)點是無需手工校正，簡單，快速的得到高可信度磷酸化肽段的鑒定結(jié)果，適合于大通量分析和大規(guī)模鑒定。
文檔編號G01N30/00GK101290305SQ200710011040
公開日2008年10月22日 申請日期2007年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月20日
發(fā)明者葉明亮, 江新寧, 鄒漢法, 韓廣輝 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所