一種琥珀酰-β-環(huán)糊精修飾的萊姆病檢測用蛋白質(zhì)芯片及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種琥珀酰-β-環(huán)糊精修飾的萊姆病檢 測用蛋白質(zhì)芯片及其制備與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 萊姆病(Lyme Diseas，LD)是一種由蜱蟲傳播的旋體感染引起的累及皮膚、神經(jīng)、 關(guān)節(jié)、心臟等多組織器官損傷的疾病，又稱萊姆疏螺旋體病(Lymeborre liosis)。萊姆病的 主要病原體為伯氏疏螺旋體，主要分為三個(gè)亞型：狹義伯氏疏螺旋體（B 〇 r r e 1 i a burgdorferi sensue stricto)，嘎氏伯氏疏螺旋體(Borrelia afzelii)和伽氏伯氏疏螺 旋體（Borrelia garinii )。萊姆病菌株在我國也分為三種基因型，其中B. burgdorferi 86118116 81：1'；[(31:0、13.&€261;[;[、13.8&1'；[11；[;[基因種比率分別為5.81%、23.26%、66.28%。萊姆 病在美國以及歐洲，尤其是斯堪的納維亞半島以及中歐地區(qū)為其高發(fā)地區(qū)；在中國，萊姆病 的發(fā)病主要分布在山區(qū)以及林區(qū)，兒童發(fā)病率高于成人。
[0003] 環(huán)形游走性紅斑(Erythema migrans，EM)是萊姆病早期典型癥狀，未經(jīng)治療的萊 姆病病人在病情發(fā)展的數(shù)月到數(shù)年之間會(huì)發(fā)生神經(jīng)性病變，外周神經(jīng)以及中樞神經(jīng)都將受 累，導(dǎo)致神經(jīng)性萊姆病(116111'〇1301^61；[0818，他）。但是由于萊姆病感染初期的臨床表現(xiàn)的非 特異性，即其環(huán)形游走性紅斑的表現(xiàn)與諸多皮膚性疾病有類似及重疊的表現(xiàn)，以及臨床醫(yī) 生對(duì)萊姆病的危害認(rèn)識(shí)不足等原因，導(dǎo)致萊姆病易在臨床上誤診或漏診。實(shí)驗(yàn)研究表明宿 主動(dòng)物對(duì)三種基因型伯氏疏螺旋體感染引起的臨床癥狀有所不同，狹義伯氏疏螺旋體主要 引起與關(guān)節(jié)有關(guān)的疾病，嘎氏伯氏疏螺旋體主要引起皮膚疾病，伽氏伯氏疏螺旋體主要引 起與神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)的疾病等。目前用于實(shí)驗(yàn)室診斷伯氏疏螺旋體感染的方法包括細(xì)胞培養(yǎng) 技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)以及用全細(xì)胞裂解液、重組蛋白和多肽進(jìn)行的酶聯(lián) 免疫檢測或者蛋白質(zhì)印跡的血清抗體檢測等技術(shù)。盡管如此，常規(guī)血清免疫方法在萊姆病 診斷上的價(jià)值仍然存在著諸多問題。美國國家疾控中心推薦萊姆病檢測的首選方法是用 ELISA或者直接免疫熒光法對(duì)血清中疏螺旋體產(chǎn)生的抗體的檢測，但是結(jié)果仍需要免疫印 跡方法的確證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種琥珀酰-β_環(huán)糊 精修飾的萊姆病檢測用蛋白質(zhì)芯片及其制備與應(yīng)用。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的以及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于萊姆病檢測的蛋白質(zhì)芯片，包括固相載體和 固定于所述固相載體上的捕獲分子，所述捕獲分子含有伯氏疏螺旋體變量主要蛋白樣序列 表達(dá)Ε蛋白（VlsE)。
[0007] 優(yōu)選地，所述固定為點(diǎn)陣固定。
[0008] 優(yōu)選地，所述固相載體為金箱芯片。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中所采用的金箱芯片的基底為玻璃片，其上覆蓋一層lOnm厚 度的純金（純度99.9%)，金箱之上為一區(qū)域化的50μπι的TEFLON膜的陣列（96孔*2,8行*12 列），陣列孔徑為1.25mm。
[0010] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述固相載體為表面依次修飾有16-氨基-1-十六烷硫醇和琥珀 酰-β-環(huán)糊精的金箱芯片。
[0011] 優(yōu)選地，琥珀酰-β-環(huán)糊精上由羧基活化而成的琥珀酰亞胺基與金箱芯片上所修 飾的16-氨基-1-十六烷硫醇中的氨基結(jié)合。
[0012] 優(yōu)選地，伯氏疏螺旋體變量主要蛋白樣序列表達(dá)Ε蛋白（VlsE)與琥珀酰-β-環(huán)糊精 結(jié)合。
[0013] 優(yōu)選地，所述固相載體上伯氏疏螺旋體變量主要蛋白樣序列表達(dá)Ε蛋白（VIsE)的 密度范圍是:3 · 9x 10-4ng/mm2 ~0 · 41ng/mm2。
[0014] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述固相載體上伯氏疏螺旋體表面蛋白VlsE的密度范圍是：1.3x 10-2ng/mm2 ~0 · 41ng/mm2〇
[0015] 本發(fā)明的第二方面，提供了上述用于萊姆病檢測的蛋白質(zhì)芯片中固相載體的制備 方法，包括步驟：
[0016] (1)將琥珀酰-β-環(huán)糊精上的羧基活化為琥珀酰亞胺基，獲得活化后的琥珀酰-β-環(huán)糊精；
[0017] (2)在金箱芯片上修飾16-氨基-1-十六烷硫醇，獲得16-氨基-1-十六烷硫醇修飾 的金箱芯片；
[0018] (3)在步驟(2)中所得16-氨基-1-十六烷硫醇修飾的金箱芯片上修飾步驟(1)所得 活化后的琥珀酰-β_環(huán)糊精，獲得固相載體。
[0019] 優(yōu)選地，步驟（1)中，采用EDC和NHS對(duì)琥珀酰-β-環(huán)糊精上的羧基進(jìn)行活化。
[0020] 本發(fā)明的第三方面，提供了上述用于萊姆病檢測的蛋白質(zhì)芯片的構(gòu)建方法，包括 步驟：
[0021] 將捕獲分子進(jìn)行稀釋，獲得捕獲分子溶液;采用常規(guī)方法將捕獲分子溶液分別點(diǎn) 陣于固相載體表面的不同位置，并固定。
[0022] 本發(fā)明的第四方面還提供了前述用于萊姆病檢測的蛋白質(zhì)芯片在制備伯氏疏螺 旋體檢測試劑盒中的用途。
[0023] 本發(fā)明的第五方面提供了一種伯氏疏螺旋體檢測試劑盒，所述試劑盒包括前述用 于萊姆病檢測的蛋白質(zhì)芯片。
[0024] 優(yōu)選地，所述伯氏疏螺旋體檢測試劑盒中還含有陰性對(duì)照。
[0025] 所述陰性對(duì)照是PBST-BSA溶液或陰性血清。
[0026] 所述PBST-BSA溶液是由濃度0 · 01Μ的磷酸鹽緩沖液PBS(PH 7 · 2-7 ·4);0 · 1 % (v/v) Tween 20;0· l%(w/v)胎牛血清BSA混合構(gòu)成。
[0027] 所述陰性血清為臨床確診未感染伯氏疏螺旋體的健康人的血清。
[0028] 優(yōu)選地，所述伯氏疏螺旋體檢測試劑盒中還含有陽性對(duì)照。
[0029] 所述的陽性對(duì)照選用人免疫球蛋白IgG、IgM或陽性血清。
[0030]所述的陽性血清是臨床確診的伯氏疏螺旋體感染患者的血清。
[0031] 特殊抗原和金箱芯片的選用是本發(fā)明蛋白質(zhì)芯片的關(guān)鍵創(chuàng)新點(diǎn)?；诒景l(fā)明的所 述試劑盒采用的是熒光方法來進(jìn)行檢測，所以試劑盒中還可以包括其他一些試劑。例如:標(biāo) 準(zhǔn)品，稀釋液，清洗液中的一種或多種。具體需要將哪些試劑裝配入試劑盒，可以根據(jù)實(shí)際 需要配置。
[0032] 所述標(biāo)準(zhǔn)品包括伯氏疏螺旋體變量主要蛋白樣序列表達(dá)E蛋白（VIsE)的IgG或IgM 抗體。
[0033]優(yōu)選地，所述的試劑盒還包括熒光素標(biāo)記的IgG二抗、熒光素標(biāo)記的IgM二抗。
[0034]優(yōu)選地，所述熒光素標(biāo)記為Cy 3標(biāo)記或Cy5標(biāo)記。
[0035] 優(yōu)選地，所述試劑盒中還含有稀釋液PBST-BSA溶液。所述稀釋液可用于稀釋抗原、 抗體、血清等。所述roST-BSA溶液是由濃度0.01M的磷酸鹽緩沖液roS(PH 7.2-7.4); 0.1 % (v/v)Tween 20;0· l%(w/v)胎牛血清BSA混合構(gòu)成。
[0036] 本發(fā)明的第六方面還提供了所述試劑盒的使用方法，包括如下步驟：
[0037] 將血清樣本點(diǎn)于前述蛋白質(zhì)芯片上，孵育，清洗，再點(diǎn)加熒光素標(biāo)記的IgG二抗和 熒光素標(biāo)記的IgM二抗混合溶液。
[0038] 清洗用于將未完全反應(yīng)的血清從芯片上除去，可選用本領(lǐng)域常規(guī)的用于抗原抗體 反應(yīng)的洗液。優(yōu)選地，可選用PBST (pH7.4)作為洗液。
[0039]優(yōu)選地，清洗時(shí)，PBST清洗3次，每次2分鐘，氮?dú)獯蹈伞?br>[0040] 優(yōu)選地，所述熒光素標(biāo)記的IgG二抗為Cy3標(biāo)記的IgG抗體。更優(yōu)選為Cy3標(biāo)記驢抗 人IgG抗體。
[0041] 優(yōu)選地，所述熒光素標(biāo)記的IgM二抗為Cy5標(biāo)記的IgM抗體。更優(yōu)選為Cy5標(biāo)記山羊 抗人IgM抗體。
[0042] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0043] (1)-方面本發(fā)明利用金箱作為基質(zhì)。其與傳統(tǒng)玻璃片、硅片以及高分子材料基質(zhì) 的優(yōu)勢在于，金箱本身為惰性金屬，但其與化學(xué)物質(zhì)的結(jié)合與傳統(tǒng)玻璃片和硅片相比來說 更加牢固。并且金箱的生物親和度較低，不易與基因或者蛋白質(zhì)等物質(zhì)產(chǎn)生非特異性吸附， 大大降低了非特異性，避免了檢測結(jié)果假陽性的產(chǎn)生。
[0044] (2)在用于實(shí)際檢測臨床萊姆病患者血清中抗伯氏疏螺旋體變量主要蛋白樣序列 表達(dá)E蛋白（VlsE)抗原時(shí)，每張芯片可同時(shí)檢測多例血清樣本，靈敏度、特異性均較高，減少 組間檢測假陽性和假陰性的發(fā)生幾率。在與傳統(tǒng)方法相比時(shí)，運(yùn)用其在對(duì)萊姆病高危地區(qū) 的人群進(jìn)行大規(guī)模篩查，可提供更為簡便和可靠的檢測方法，提高了篩查效率以及陽性檢 測率和準(zhǔn)確度。
【附圖說明】
[0045] 圖1:為金箱芯片點(diǎn)樣布陣示意圖。
[0046] 圖2:利用原子力顯微鏡(AFM)觀察金箱芯片修飾前表征情況。
[0047]圖3:利用原子力顯微鏡(AFM)觀察金箱芯片修飾后表征情況。
[0048] 圖4:為傅里葉紅外光譜儀掃描化學(xué)修飾后金箱芯片平面表征圖。
[0049] 圖5A:使用芯片掃描儀對(duì)實(shí)施例2中琥珀酰-β-環(huán)糊精修飾的金箱芯片對(duì)不同蛋白 質(zhì)兼容性的質(zhì)控實(shí)驗(yàn)所得蛋白質(zhì)芯片分別進(jìn)行掃描所得結(jié)果圖。
[0050] 圖5B:實(shí)施例2中琥珀酰-β-環(huán)糊精修飾的金箱芯片對(duì)不同蛋白質(zhì)兼容性的質(zhì)控實(shí) 驗(yàn)所得蛋白質(zhì)芯片的熒光曲線圖。
[0051] 圖6:實(shí)施例2中抗原孵育溫度-時(shí)間質(zhì)控實(shí)驗(yàn)所得蛋白質(zhì)芯片的熒光曲線圖。
[0052]圖7Α:使用芯片掃描儀對(duì)實(shí)施例2中兔抗VI sE抗原IgG抗體濃度梯度孵育質(zhì)控實(shí)驗(yàn) 所得蛋白質(zhì)芯片分別進(jìn)行掃描所得結(jié)果圖。
[0053]圖7B:實(shí)施例2中兔抗VI sE抗原I gG抗體濃度梯度孵育質(zhì)控實(shí)驗(yàn)所得蛋白質(zhì)芯片的 熒光曲線圖。
[0054]圖8A:實(shí)施例3組內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中三組熒光結(jié)果，不受不同的點(diǎn)樣孔和不同時(shí)間的 限制，重復(fù)性較好，