專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)血磷的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)血磷的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
磷是人體遺傳物質(zhì)核酸以及人體能量轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵物質(zhì)三磷酸腺苷(ATP)的重要組分，也是多種酶和生物膜磷脂的組分，還是構(gòu)成骨骼、牙齒的重要成分，對(duì)人體生命活動(dòng)有十分重要的作用。血液中的磷主要有兩種存在形式，即有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷。其中，血液無(wú)機(jī)磷稱(chēng)為血磷，以無(wú)機(jī)磷酸鹽的形式存在，如Na2HP04、NaH2P04、CaHPO4、MgHPO4等。血磷的高低對(duì)人體生命活動(dòng)有直接的影響。血磷含量異常通常都是繼發(fā)性的，如血磷降低常見(jiàn)于維生素D缺乏、 高胰島素血癥、長(zhǎng)期腹瀉、吸收不良、甲旁亢、腎功能衰竭和輸注大量葡萄糖液后等，血磷升高常見(jiàn)于維生素D中毒、甲狀旁腺機(jī)能減退和腎濾過(guò)磷障礙等。無(wú)論血磷濃度升高或是降低，對(duì)人體生命活動(dòng)都有極大的影響，嚴(yán)重時(shí)可加重病情，同時(shí)引發(fā)其他疾病。因此，檢測(cè)血液中無(wú)機(jī)磷濃度對(duì)于疾病的防治具有重要意義。目前，現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)血磷的方法以酶法較為精確，酶法利用的原理是，在340nm 波長(zhǎng)下每分鐘NADH的吸光度下降的速度與血磷濃度成正比，由此測(cè)算出血磷的濃度大小。 但是，酶法中的試劑要在340nm波長(zhǎng)下測(cè)定，但是絕大多數(shù)可見(jiàn)光分析儀不具備340nm波長(zhǎng)，這極大地限制了酶法的應(yīng)用范圍，況且酶法的試劑價(jià)格昂貴，同樣不利于其推廣應(yīng)用。鑒于上述原因，現(xiàn)有方法中有利用孔雀綠法使血磷直接與酸性孔雀綠鉬酸顯色劑作用，生成綠色復(fù)合物，然后在630nm波長(zhǎng)下進(jìn)行吸光度檢測(cè)，從而檢測(cè)出血磷的濃度。但是，在該方法中標(biāo)準(zhǔn)溶液通常單純采用磷酸鹽溶液，而待測(cè)血液樣品中，除了含有磷酸鹽溶液外，還含有蛋白等物質(zhì)，是一個(gè)復(fù)雜的體系，這使得標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣品用孔雀綠法形成的復(fù)合物的顏色不屬于同一個(gè)色系，導(dǎo)致通過(guò)比色法計(jì)算出的血磷濃度出現(xiàn)較大誤差，影響檢測(cè)的準(zhǔn)確度。此外，單純采用磷酸鹽溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，用孔雀綠法反應(yīng)生成的綠色復(fù)合物的顏色會(huì)隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸變淺，顯色的穩(wěn)定性較差，這也造成現(xiàn)有孔雀綠法準(zhǔn)確性不高的原因之一。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)血磷的方法和試劑盒，使得該試劑盒和方法能夠提高檢測(cè)無(wú)機(jī)磷的準(zhǔn)確度。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案一種檢測(cè)血磷的方法，將標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)血樣分別與由鉬酸銨、吐溫-20和孔雀綠組成的混合液在強(qiáng)酸下反應(yīng)，然后再分別將各自反應(yīng)得到的綠色復(fù)合物在630nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度，最后通過(guò)比色法得到待測(cè)血樣的血磷濃度，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液由磷酸二氫鉀、吐溫-20和牛血白蛋白組成。其中，樣品血磷濃度(mmol/L)=標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度XA#/Afe，所述待測(cè)血樣與混合液的體積比為1 100，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液與混合液的體積比為1 100，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液中磷酸二氫鉀的濃度為1. 6mmol/L，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液中吐溫-20的濃度為0. 5-1. Omol/L，優(yōu)選為 0. 75mol/L，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液中牛血白蛋白的濃度為0. 5-1. Og/L。其中，所述混合液中鉬酸銨的濃度為0. 3-0. 6mol/L，優(yōu)選為0. 5mol/L，所述混合液中孔雀綠的濃度為0. 5-0. 8mol/L，優(yōu)選為0. 7mol/L，所述混合液中吐溫-20的濃度為 0. 5-1. Omol/L，優(yōu)選為0. 75mol/L，強(qiáng)酸優(yōu)選為l-2mol/L的鹽酸。在強(qiáng)酸中，血磷與鉬酸銨反應(yīng)生成磷鉬酸銨，而磷鉬酸銨與孔雀綠很快生成綠色離子締合物孔雀綠-磷鉬酸銨，利用此原理可將標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)血樣通過(guò)比色法檢測(cè)樣品中血磷的濃度。但是，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)溶液與待測(cè)血樣組成體系不同，在檢測(cè)時(shí)會(huì)出現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)， 使得兩者反應(yīng)所得的離子締合物分屬不同色系，這樣再通過(guò)比色法檢測(cè)就會(huì)出現(xiàn)很大誤差，因此，本發(fā)明在標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入牛血白蛋白和吐溫-20，模擬待測(cè)血樣的體系環(huán)境，使標(biāo)準(zhǔn)溶液與待測(cè)血樣形成的離子締合物的顏色在同一個(gè)色系中，避免誤差的產(chǎn)生。在不同的非離子表面活性劑體系中，離子締合物的最大吸收峰不同，本發(fā)明使用的吐溫-20為非離子表面活性劑，最大吸收峰為620-650nm，具有乳化、擴(kuò)散、增溶、穩(wěn)定顯色作用，三苯甲烷類(lèi)染料-孔雀綠在水溶液中生成質(zhì)子化孔雀綠陽(yáng)離子MGH2+，具有D3螺旋槳三維結(jié)構(gòu)，當(dāng)離子締合物形成后，若不加吐溫-20，隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)，水中離子締合物三維結(jié)構(gòu)中苯環(huán)的弛豫會(huì)導(dǎo)致其顏色逐漸退去，若有吐溫-20，處于高黏度溶劑中苯環(huán)的弛豫過(guò)程會(huì)受阻，溶液顯色穩(wěn)定性增強(qiáng)。此外，吐溫-20還增加了孔雀綠-磷鉬酸銨離子締合物的溶解度，增加反應(yīng)液的吸光度。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)血磷的試劑盒，包括由1. 6mmol/L的磷酸二氫鉀、0. 5-1. 0mol/L吐溫-20和0. 5-1. 0g/L的牛血白蛋白組成的標(biāo)準(zhǔn)溶液。其中，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液中吐溫-20的濃度優(yōu)選為0. 75mol/L。本發(fā)明所述試劑盒還包括由l-2mol/L 的鹽酸、0. 3-0. 6mol/L 的鉬酸銨、0. 5-1. 0mol/L 吐溫-20 和 0. 5-0. 8mol/L的孔雀綠組成的反應(yīng)試劑。其中，所述反應(yīng)試劑中鉬酸銨的濃度優(yōu)選為0. 5mol/L,吐溫-20的濃度優(yōu)選為 0. 75mol/L，孔雀綠濃度優(yōu)選為0. 7mol/L。本發(fā)明試劑盒可以配制成單試劑，即由l-2mol/L的鹽酸、0. 3-0. 6mol/L的鉬酸銨、0. 5-1. 0mol/L吐溫-20和0. 5-0. 8mol/L的孔雀綠組成的反應(yīng)試劑；由1. 6mmol/L的磷酸二氫鉀、0. 5-1. 0mol/L吐溫-20和0. 5-1. 0g/L的牛血白蛋白組成的標(biāo)準(zhǔn)溶液。本發(fā)明所述方法檢測(cè)血磷濃度具有較高準(zhǔn)確度和精密度，試驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明所述方法檢測(cè)的結(jié)果在質(zhì)控品的士2SD范圍內(nèi)。此外，本發(fā)明對(duì)同一樣品進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)， 各結(jié)果之間的標(biāo)準(zhǔn)差率(變異系數(shù))為1.30%，小于標(biāo)準(zhǔn)的3%。上述試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明具有很高的準(zhǔn)確度和精密度。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明所述方法能夠消除因標(biāo)準(zhǔn)溶液體系環(huán)境與待測(cè)血樣體系環(huán)境不同而出現(xiàn)的基質(zhì)效應(yīng)，避免兩者用孔雀綠法檢測(cè)時(shí)所得離子締合物分屬不同色系，同時(shí)增強(qiáng)顯色的穩(wěn)定性，提高了檢測(cè)血磷的準(zhǔn)確性，可以廣泛應(yīng)用于血磷的檢測(cè)中。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)血磷的方法和試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述方法及試劑盒已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。以下就本發(fā)明所提供的一種檢測(cè)血磷的試劑盒和方法做進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1 本發(fā)明所述方法將由1. 6mmol/L的磷酸二氫鉀、0. 75mol/L的吐溫-20和1. Og/L的牛血白蛋白組成的標(biāo)準(zhǔn)溶液與由0. 5mol/L的鉬酸銨、0. 75mol/L的吐溫-20和0. 7mol/L的孔雀綠組成的混合液在鹽酸(1.5mol/L)中反應(yīng)，將得到綠色復(fù)合物在630nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度Afe，待測(cè)血樣與混合液反應(yīng)后也在630nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度A# (待測(cè)血樣和標(biāo)準(zhǔn)溶液與混合液的體積比均為1 100)，與所述綠色復(fù)合物在630nm波長(zhǎng)下的吸光度Afe比色，通過(guò)公式樣品血磷濃度(mmol/L)=標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度XA#/Afe (1. 6mmol/L)計(jì)算得到樣品血磷濃度值。實(shí)施例2 本發(fā)明所述方法將由1. 6mmol/L的磷酸二氫鉀、0. 5mol/L的吐溫-20和0. 75g/L的牛血白蛋白組成的標(biāo)準(zhǔn)溶液與由0. 6mol/L的鉬酸銨、0. 5mol/L的吐溫-20和0. 5mol/L的孔雀綠組成的混合液在鹽酸介質(zhì)(1. Omol/L)中反應(yīng)，將得到綠色復(fù)合物在630nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度Afe， 待測(cè)血樣與混合液反應(yīng)后也在630nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度A# (待測(cè)血樣和標(biāo)準(zhǔn)溶液與混合液的體積比均為1 100)，與所述綠色復(fù)合物在630nm波長(zhǎng)下的吸光度Afe比色，通過(guò)公式 樣品血磷濃度(mmol/L)=標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度XA#/Afe (1. 6mmol/L)計(jì)算得到樣品血磷濃度值。實(shí)施例3 本發(fā)明所述方法將由1.6mmol/L的磷酸二氫鉀、1.0mol/L的吐溫-20和0. 5g/L的牛血白蛋白組成的標(biāo)準(zhǔn)溶液與由0. 3mol/L的鉬酸銨、1. 0mol/L的吐溫-20和0. 8mol/L的孔雀綠組成的混合液在鹽酸介質(zhì)中Omol/L)反應(yīng)，將得到綠色復(fù)合物在630nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度Afe，待測(cè)血樣與混合液反應(yīng)后也在630nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度A# (待測(cè)血樣和標(biāo)準(zhǔn)溶液與混合液的體積比均為1 100)，與所述綠色復(fù)合物在630nm波長(zhǎng)下的吸光度Afe比色，通過(guò)公式樣品血磷濃度(mmol/L)=標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度XA#/Afe (1. 6mmol/L)計(jì)算得到樣品血磷濃度值。實(shí)施例4 本發(fā)明所述方法的準(zhǔn)確度分析試驗(yàn)儀器CB171半自動(dòng)生化分析儀；檢測(cè)樣品中生北控質(zhì)控血清(血磷靶值為1. 56mmol/L, X±2SO為 1. 32-1. 80mmol/L)；CB171半自動(dòng)生化分析儀設(shè)定溫度為37°C，反應(yīng)方法為終點(diǎn)法，測(cè)定波長(zhǎng)為 630nm，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間為2s，測(cè)量時(shí)間為2s。采用實(shí)施例1至實(shí)施例3的檢測(cè)方法對(duì)上述質(zhì)控血清分別進(jìn)行檢測(cè)。具體結(jié)果為 實(shí)施例1檢測(cè)結(jié)果為1. 57mmol/L ；實(shí)施例2檢測(cè)結(jié)果為1. 59mmol/L ；實(shí)施例3檢測(cè)結(jié)果為 1. 58mmol/L。3次檢測(cè)結(jié)果表明，本發(fā)明所述方法的檢測(cè)結(jié)果位于質(zhì)控血清的士2SD范圍內(nèi)，具有較高準(zhǔn)確性。實(shí)施例5 本發(fā)明所述方法的精密度分析
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試驗(yàn)儀器CB171半自動(dòng)生化分析儀；檢測(cè)樣品任意一血清樣品；CB171半自動(dòng)生化分析儀設(shè)定溫度為37°C，反應(yīng)方法為終點(diǎn)法，測(cè)定波長(zhǎng)為 630nm，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間為2s，測(cè)量時(shí)間為2s。采用實(shí)施例1至實(shí)施例3的檢測(cè)方法分別對(duì)同一待測(cè)樣品重復(fù)檢測(cè)10次，其中， 實(shí)施例1檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。表1檢測(cè)樣品血磷濃度(10次)及標(biāo)準(zhǔn)差率(變異系數(shù))
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)血磷的方法，其特征在于，將標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)血樣分別與由鉬酸銨、吐溫-20和孔雀綠組成的混合液在強(qiáng)酸下反應(yīng)，然后再分別將各自反應(yīng)得到的綠色復(fù)合物在 630nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度，最后通過(guò)比色法得到待測(cè)血樣的血磷濃度，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液由磷酸二氫鉀、吐溫-20和牛血白蛋白組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液中磷酸二氫鉀的濃度為 1. 6mmol/L0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合液中吐溫-20的濃度均為 0. 5-1. Omol/Lο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液中牛血白蛋白的濃度為 0. 5-1. Og/Lo
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述強(qiáng)酸為l_2mol/L的鹽酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述混合液中鉬酸銨的濃度為0.3-0. 6mol/L0
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述混合液中孔雀綠的濃度為0.5-0. Smol/L0
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述待測(cè)血樣與混合液的體積比為 1 100。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液與混合液的體積比為 1 100。
10.一種檢測(cè)血磷的試劑盒，其特征在于，包括由1. 6mmol/L的磷酸二氫鉀、0. 5-1. Omol/L吐溫-20和0. 5-1. Og/L的牛血白蛋白組成的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述試劑盒，其特征在于，還包括由 l-2mol/L 的鹽酸、0. 3-0. 6mol/L 的鉬酸銨、0. 5-1. 0mol/L 吐溫-20 和 0. 5-0. 8mol/ L的孔雀綠組成的反應(yīng)試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種檢測(cè)血磷的方法和試劑盒。該方法將標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)血樣分別與由鉬酸銨、吐溫-20和孔雀綠組成的混合液在強(qiáng)酸下反應(yīng)，然后再分別將各自反應(yīng)得到的綠色復(fù)合物在630nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度，最后通過(guò)比色法得到待測(cè)血樣的血磷濃度，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液由磷酸二氫鉀、吐溫-20和牛血白蛋白組成。本發(fā)明試劑盒包括由1.6mmol/L的磷酸二氫鉀、0.5-1.0mol/L吐溫-20和0.5-1.0g/L的牛血白蛋白組成的標(biāo)準(zhǔn)溶液。本發(fā)明所述方法能夠避免標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)血樣用孔雀綠法檢測(cè)時(shí)所得離子締合物顯色不一致的問(wèn)題，同時(shí)增強(qiáng)顯色的穩(wěn)定性，提高了檢測(cè)血磷的準(zhǔn)確性，能廣泛應(yīng)用于血磷的檢測(cè)中。
文檔編號(hào)G01N21/78GK102353671SQ20111017523
公開(kāi)日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月27日
發(fā)明者董理 申請(qǐng)人:董理