蒽鉻紅a(acra)及其衍生物在磷酸化蛋白質(zhì)熒光檢測(cè)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及磷酸化蛋白質(zhì)熒光檢測(cè)技術(shù)，具體地說(shuō)涉及磷酸化蛋白質(zhì)的一種新的 熒光染料。
【背景技術(shù)】
[0002] 在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，離不開(kāi)對(duì)生命的基本物質(zhì)蛋白質(zhì)的研究，也就離不開(kāi)對(duì)蛋 白質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)。尤其是最近幾年，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的飛速發(fā)展，使我們對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)技 術(shù)有了更高的要求。
[0003] 蛋白質(zhì)磷酸化修飾是最常見(jiàn)也是最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式之一，也是目前 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，對(duì)于目前的研究尚且存在專屬性檢測(cè)方法的不足，磷酸化過(guò) 程基本上發(fā)生在酪氨酸、蘇氨酸、絲氨酸等氨基酸殘基上。蛋白質(zhì)的這一修飾與細(xì)胞的增 殖、分化、發(fā)育、凋亡等許多生命活動(dòng)息息相關(guān)，據(jù)多年的研究證明，蛋白磷酸化與許多的臨 床疾病有著復(fù)雜的關(guān)系。因此開(kāi)發(fā)一種專屬性強(qiáng)的檢測(cè)方法成為了研究的突破點(diǎn)。
[0004] 現(xiàn)存的凝膠上磷酸化蛋白質(zhì)檢測(cè)方法包括經(jīng)典的Pro-Q Diamond檢測(cè)技術(shù)及 Stains-all檢測(cè)技術(shù)等。其中Pro-Q Diamond是目前特異性最強(qiáng)、應(yīng)用最廣、操作較為簡(jiǎn)便、 靈敏度較高的檢測(cè)方法。
[0005] 本發(fā)明首次將ACRA及其衍生物應(yīng)用于磷酸化蛋白質(zhì)熒光檢測(cè)，相比于其他檢測(cè)技 術(shù)，具有檢測(cè)限低，專屬性強(qiáng)等眾多優(yōu)點(diǎn)，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中將具有廣泛的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于建立一種蒽絡(luò)紅A(Anthracene Chrome Red A，ACRA)及其衍生 物在磷酸化蛋白質(zhì)熒光檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所述的ACRA相關(guān)化合物是指以ACRA為母核的鈉鹽、鉀鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、 硫酸氫鹽、硝酸鹽、鞣酸鹽、氫碘酸鹽等。
[0008] ACRA 母核為：
[0009]
[0010] 下面是本發(fā)明一個(gè)可用的凝膠檢測(cè)方法，其包括步驟：
[0011 ] 1)將經(jīng)SD S-PAGE電泳后的蛋白質(zhì)樣品凝膠置于固定液中固定2次，每次10~ 30min;棄固定液，然后用去離子水沖洗5~30min;優(yōu)選的固定時(shí)間為15min，去離子水沖洗 時(shí)間為15min，固定液可以是含有50%甲醇和10%乙酸的水溶液；
[0012] 2)加入熒光染色液染色40~90min，其中所述染色液為含按摩爾濃度比1~ΙΟμΜ的 ACRA及按溶液體積比0.1~0.5 %的乙酸；優(yōu)選的ACRA濃度為3μΜ，優(yōu)選的乙酸濃度為 0.25%，優(yōu)選的染色時(shí)間為60min;
[0013] 3)將染色完畢的凝膠置于脫色液中脫色10~30min，其中所述脫色液為含按摩爾 濃度比30~100mM的乙酸鈉，按摩爾濃度比5~20μΜ的鋁離子以及按溶液體積比5~20%的 丙二醇和20~40 %的乙醇;優(yōu)選的乙酸鈉濃度為50mM，優(yōu)選的鋁離子濃度為9μΜ，優(yōu)選的丙 二醇濃度為10%，優(yōu)選的乙醇濃度為30%，優(yōu)選的脫色時(shí)間為20min;
[0014] 4)將上述經(jīng)過(guò)脫色的凝膠進(jìn)行第二次脫色，脫色時(shí)間為0.5~5min，其中所述的脫 色液為含按溶液體積比5~20 %的丙二醇和20~40 %的乙醇;其中優(yōu)選的脫色時(shí)間為lmin， 優(yōu)選的丙二醇濃度為1 〇 %，優(yōu)選的乙醇濃度為30 %。
[0015] 5)檢測(cè)，運(yùn)用Typhoon 9400?掃描儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。
[0016]本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0017] 1)高靈敏度:可媲美經(jīng)典磷酸化蛋白檢測(cè)試劑盒Pro-Q Diamond;
[0018] 2)操作簡(jiǎn)單迅速:操作步驟少，可在130min內(nèi)完成；
[0019] 3)重現(xiàn)性穩(wěn)定:受溫度、搖床擺動(dòng)頻率等外部條件影響較?。?br>[0020] 4)染色背景好；
[0021 ] 5)線性關(guān)系好:精確，能在車(chē)父大范圍內(nèi)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)彳丁半定量測(cè)定；
[0022] 6)可逆性好:容易脫色；
[0023] 7)兼容性好:可與MALDI-T0F等質(zhì)譜儀器以及其他染色方法高度兼容；
[0024] 8)使用安全、環(huán)保、低毒；
[0025] 9)專屬性強(qiáng)；
[0026] 1〇)成本低。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1. ACRA的化學(xué)結(jié)構(gòu)；
[0028] 圖2.ACRA染色法和其他常用染色法靈敏度和特異性的比較。其中（A)為ACRA染色 法，（B)為考馬斯亮藍(lán)(CBBR)染色法，（C)為Pro-Q Diamond染色法，（D)為Stains-all染法。 磷酸化蛋白質(zhì)為商品化標(biāo)準(zhǔn)品，從上至下分別為磷酸化酶b(phosphorylase b，非磷酸化蛋 白），牛血清白蛋白（BSA，非磷酸化蛋白），卵白蛋白（0VA，磷酸化蛋白），α-酪蛋白（α-casein，磷酸化蛋白），β_酪蛋白（β-casein，磷酸化蛋白），κ-酪蛋白（κ-casein，磷酸化蛋 白），卵白素(Avidin，非磷酸化蛋白）和溶解酵素(Lysozyme，非磷酸化蛋白）。蛋白質(zhì)載樣量 (從左至右，每條帶）如下：500,250，125,62,32，16,8,4,2，lng。
[0029] 圖3.ACRA染色法選擇性考察。選用a-casein(含8個(gè)磷酸化位點(diǎn)）作為研究對(duì)象，比 較其去磷酸化后(經(jīng)磷酸酶處理），ACRA染色法對(duì)其的檢測(cè)靈敏度的變化。（A)為ACRA染色 法，（B)為Pro-Q Diamond染色法，（C)為SYPR0 Ruby染色法。
[0030]圖4.ACRA染色法對(duì)磷酸化蛋白檢測(cè)的線性動(dòng)態(tài)范圍考察。（A)為ACRA染色法，（B) 為Pr〇-Q Diamond染色法。
【具體實(shí)施方式】：
[0031]下面結(jié)合具體的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明 本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0032] 實(shí)施例1 ACRA染色
[0033]槲皮素磷酸化蛋白質(zhì)熒光染色實(shí)驗(yàn)采用下述步驟進(jìn)行：
[0034] (1)固定:將電泳結(jié)束后的凝膠放置于50mL 50%乙醇/10%乙酸的固定液中固定2 次，每次30分鐘；
[0035] (2)水洗:將凝膠放入50mL去離子水中水洗15分鐘；
[0036] (3)染色:將凝膠放入50mL 3yMACRA/0.25%乙酸染色液中染色60分鐘；
[0037] (4)脫色:將凝膠放入50mM乙酸鈉/9μΜ Al3+/10%丙二醇/30%乙醇脫色液中脫色 20分鐘；
[0038] (5)脫色:將凝膠放置于50mL10%丙二醇/30%乙醇溶液中脫色1分鐘。
[0039] (6)運(yùn)用Typhoon 9400?掃描儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。
[0040] 按照上述方法分別用ACRA的鈉鹽、鉀鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、硝酸鹽、鞣酸 鹽、氫碘酸鹽進(jìn)行蛋白質(zhì)染色，結(jié)果表明用這些衍生物均能得到類(lèi)似于槲皮素的檢測(cè)結(jié)果。 SDS-PAGE參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版相關(guān)部分進(jìn)行。
[0041] 實(shí)驗(yàn)例1 ACRA與其他常用染色法效果對(duì)比
[0042] 采用不同方法進(jìn)行染色，（A)為ACRA染色法，（B)為考馬斯亮藍(lán)(CBBR)染色法，（C) 為Pro-Q Diamond染色法，（D)為Stains-all染法。磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白為商品化標(biāo) 準(zhǔn)品，從上至下分別為磷酸化酶b(phosphorylase b，非磷酸化蛋白），牛血清白蛋白（BSA， 非磷酸化蛋白），卵白蛋白（0VA，磷酸化蛋白），α-酪蛋白（α-casein，磷酸化蛋白），β-酪蛋白 (β-casein，磷酸化蛋白），κ-酪蛋白（κ-casein，磷酸化蛋白），卵白素(Avidin，非磷酸化蛋 白）和溶解酵素(Lysozyme，非磷酸化蛋白）。蛋白質(zhì)載樣量(從左至右，每條帶）如下：500， 250，125,62,32，16,8,4,2，lng。結(jié)果如圖2所示，ACRA染色法靈敏度比Stains-all染色法高 8-16倍，與Pro-Q Diamond染色法相當(dāng)。其中ACRA染色法采用實(shí)施例1的方法進(jìn)行，Pro-Q Diamond，Stains-al 1，SYPR0 Ruby和CBBR染色法分別按下述方式進(jìn)行：
[0043] Pr〇-Q Diamo