基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的雙酚a痕量檢測(cè)法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移的雙酚A痕量檢測(cè)法。
【背景技術(shù)】
[0002]雙酚A，也稱BPA，在工業(yè)上被廣泛用于聚碳酸酯(PC)和環(huán)氧樹脂等材料的合成。60年代以來(lái)就被用于制造塑料(奶)瓶、食品和飲料(奶粉)罐內(nèi)側(cè)涂層等。雙酚A無(wú)處不在，從礦泉水瓶、醫(yī)療器械及食品包裝的內(nèi)里，都有它的身影。然而研究表明PC材質(zhì)的塑料在高溫下易水解，并且溫度越高水解越快，水解生成的雙酚A會(huì)污染被包裝的食品，如果雙酚A在體內(nèi)長(zhǎng)期積累則會(huì)導(dǎo)致免疫力下降等不良反應(yīng)，尤其對(duì)嬰幼兒的傷害更大。除此以外，國(guó)內(nèi)外很多試驗(yàn)都證明雙酚A是一種內(nèi)分泌干擾素，低濃度長(zhǎng)時(shí)間暴露的情況下，雙酚A就可以對(duì)生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等有不良影響。
[0003]目前，雙酚A的檢測(cè)方法主要包括氣相色譜法、高效液相色譜法、熒光光度法、催化動(dòng)力學(xué)分光光度法等，然而以上種種方法有著一些缺點(diǎn)，如檢測(cè)儀器昂貴、穩(wěn)定性不足、靈敏度不夠高等，所以建立一套成熟的雙酚A檢測(cè)體系十分重要。
[0004]核酸適配子(Aptamer,簡(jiǎn)稱適配子)是一段體外通過(guò)SELEX技術(shù)(配體指數(shù)富集的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù))篩選獲得的寡核苷酸片段，可以是RNA或單鏈DNA。單鏈寡核苷酸的一些二級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾、莖環(huán)等，可使核酸分子形成多種三維結(jié)構(gòu)，成為與靶標(biāo)物質(zhì)特定區(qū)域結(jié)合的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，凡是涉及抗體的應(yīng)用領(lǐng)域，幾乎都可以用寡核苷酸核酸適配體代替。與傳統(tǒng)的抗體相比，適配體具有以下顯著優(yōu)點(diǎn):親和力高、特異性強(qiáng)、容易制備及修飾、穩(wěn)定性好等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明就是針對(duì)上述問(wèn)題，彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種雙酚A的優(yōu)良性能，將雙酚A適配子及其互補(bǔ)的短鏈DNA分別與熒光納米材料和納米金進(jìn)行連接，通過(guò)兩條單鏈DNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)，兩種材料結(jié)合在一起并發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，納米材料的熒光被納米金所淬滅。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的檢測(cè)方法概述如下。
[0007]一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移的雙酚A痕量檢測(cè)法，包括如下步驟:
(1)稱取 2.0 mmol KC1、1.0 mmol GdC13.χΗ20、0.1 mmol TbC13.6H20、1 mL 30% 聚丙烯亞胺(w/v)以及20 mL乙二醇,加入至100 mL圓底燒瓶中。充分?jǐn)嚢柚了泄腆w溶解。另取8 mmol NH4F加入至燒杯中，并加入20 mL乙二醇，放入40 V水浴鍋中恒溫?cái)嚢柚凉腆w全部溶解。
[0008](2)將溶解的NH4F逐滴加入至圓底燒瓶中，充分?jǐn)嚢?小時(shí)，形成懸浮80液。將懸浮液轉(zhuǎn)入至高溫反應(yīng)釜中，放入電熱鼓風(fēng)干燥箱195 V恒溫加熱4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束之后將產(chǎn)物分裝入離心管中，10000 rpm離心15 min。棄去上清液，沉淀用乙醇以及超純水超聲清洗三次。最后成品烘干，研成粉末保存，即制得KGdF4:Tb3+納米材料。
[0009](3)在三口圓底燒瓶中加入95.8 mL的超純水(彡18.2 Μ Ω.cm)，再加入4.2 mL1% (w/v)氯金酸溶液，120 V攪拌加熱，煮沸95回流10 min,然后迅速加入10 mL 1% (w/v)朽1檬酸三納溶液，煮沸回流10 min。關(guān)閉熱源，繼續(xù)攪拌15 min,冷卻至室溫，即得納米金膠體。產(chǎn)品至于棕色試劑瓶，置于4 V冰箱避光保存。
[0010](4)稱取15 mg KGdF4:Tb3+熒光納米材料加入至7 mL離心管中，加入5 mL PBS超聲85分散20 min。之后加入1.25 mL 25% (w/v)戊二醛，放入至氣浴恒溫振蕩器中，37 V恒溫振蕩2 h。取出后，用PBS超聲清洗三次(9000 rpmUO min)。所得沉淀用0.9mL PBS重懸，加入0.1 mL (1 mg/mL)親和素。37 V恒溫振蕩6 h。取出后用BB (25 mMTris-HClUOO mM NaCl、25 mM KC1、10 mM MgC12 和 5% DMSO、pH 8.0)清洗三次，加入 10UL (10 nM)生物素化的雙酚A適配子，37 V恒溫振蕩2 h。取出后用BB清洗三次(9000rpm、90 10 min),再用BB配制成1 mg/mL的體系，構(gòu)成基團(tuán)A。放入4 V冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0011](5)稱取1 mL納米金溶液加入至離心管中，10000 rpm離心15 min,棄去500yL上100清液。加入10 yL (50 nM)雙酚A適配子互補(bǔ)鏈。放入氣浴恒溫振蕩器中37V恒溫振蕩過(guò)夜。取出后加入5% (w/w)十二烷基硫酸鈉(SDS)，充分混勻。配制不同濃度的NaCl(0.1 M、0.5 M、1 M、2 M)，每次10 μ L從低濃度至高濃度逐滴滴入至納米金中，每滴之間間隔1 h，至NaCl終濃度為0.31 M。37 V陳化過(guò)夜，構(gòu)成基團(tuán)B，放入4 V冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0012](6)將上述制備的基團(tuán)A (1 mL，lmg/mL)與基團(tuán)B (用量為1.3.4所訴)混合在一起，充分振蕩，放置于氣浴恒溫振蕩器中37 V恒溫孵育2 h。使用熒光光譜儀FLU0RMAX-4測(cè)定熒光光譜。激發(fā)波長(zhǎng)250 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍520至720 nm，主要發(fā)射峰位于543 nm處。
[0013](7)配制不同濃度的雙酚A，在濃度范圍0.1至150 ng/mL內(nèi)取若干濃度值，分別為 0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL>1 ng/mL>2 ng/mL>5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50ng/mL、150 ng/mL。將配制好的雙酸A、基團(tuán)A (1 mL, lmg/mL)與基團(tuán)B (用量為1.3.4所訴)充分混合，37 V孵育2 h，雙酚A與基團(tuán)B競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合基團(tuán)A，不同濃度的雙酚A將影響基團(tuán)A與基團(tuán)B的結(jié)合量，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的變化。
[0014]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明將雙酚A適配子及其互補(bǔ)的短鏈DNA分別與熒光納米材料和納米金進(jìn)行連接，通過(guò)兩條單鏈DNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)，兩種材料結(jié)合在一起并發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，納米材料的熒光被納米金所淬滅。當(dāng)體系中加入雙酚A時(shí)，雙酚A將與互補(bǔ)DNA鏈競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合雙酚A適配子，從而導(dǎo)致兩種納米材料結(jié)合量的不同，進(jìn)而影響體系的熒光強(qiáng)度。
[0015]通過(guò)測(cè)定雙酚A的濃度與體系熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)雙酚A的檢測(cè)。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，本法在雙酚A濃度0.5~100 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=430.0Χ+75095 (R2=0.993)，檢出限為0.16 ng/mL。并通過(guò)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，證明本法可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1是實(shí)施例1的KGdF4:Tb3+納米材料熒光發(fā)射圖譜與納米金紫外-可見吸收?qǐng)D譜的重疊(A)及KGdF4:Tb3+納米材料的熒光淬滅(B)。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1
一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移的雙酚A痕量檢測(cè)法，包括如下步驟:
(1)稱取 2.0 mmol KC1、1.0 mmol GdC13.χΗ20、0.1 mmol TbC13.6H20、1 mL 30% 聚丙烯亞胺(w/v)以及20 mL乙二醇,加入至100 mL圓底燒瓶中。充分?jǐn)嚢柚了泄腆w溶解。另取8 mmol NH4F加入至燒杯中，并加入20 mL乙二醇，放入40 V水浴鍋中恒溫?cái)嚢柚凉腆w全部溶解。
[0018](2)將溶解的NH4F逐滴加入至圓底燒瓶中，充分?jǐn)嚢?小時(shí)，形成懸浮80液。將懸浮液轉(zhuǎn)入至高溫反應(yīng)釜中，放入電熱鼓風(fēng)干燥箱195 V恒溫加熱4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束之后將產(chǎn)物分裝入離心管中，10000 rpm離心15 min。棄去上清液，沉淀用乙醇以及超純水超聲清洗三次。最后成品烘干，研