一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的前列腺素受體4篩選模型的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥理學(xué)領(lǐng)域，利用熒光檢測技術(shù)，構(gòu)建了前列腺素受體4拮抗劑的高通量篩選模型，用于待測樣品對前列腺素受體4拮抗劑活性的高通量檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]前列腺素受體4(EP4)是一種G蛋白偶聯(lián)受體，與激活性G蛋白(Gs)偶聯(lián)，激活后可使細胞內(nèi)下游cAMP含量上升，廣泛參與了細胞代謝的過程。EP4在前列腺素類物質(zhì)介導(dǎo)的過敏性炎癥和免疫性炎癥疾病進程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。所以建立EP4拮抗劑篩選模型對治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病具有重要意義。
[0003]cAMP是一種重要的第二信使，介導(dǎo)神經(jīng)傳導(dǎo)遞質(zhì)，荷爾蒙及藥物的不同生理應(yīng)答。胞內(nèi)cAMP濃度受到兩種膜聯(lián)酶AC和TOE調(diào)控，AC活性促進ATP合成cAMP，PDE可將cAMP降解為八10^(:活性受到多種6?0^的調(diào)控，6?0^可與兩種作用相反的6了?結(jié)合蛋白6(^和6的相互作用而產(chǎn)生不同的效應(yīng)。這些G蛋白是由Ga，Gi3和Gy三種亞基組成的異三聚體分子。激動劑介導(dǎo)的GPCRs激活可導(dǎo)致GTP結(jié)合上Ga亞基，引起構(gòu)象改變，導(dǎo)致三聚體解離成Ga和⑶丫。解離后，Gas主要參與AC的激活，而Gai和《3 γ對AC有抑制作用。測量胞內(nèi)cAMP是檢測待測化合物對于GPCR介導(dǎo)的AC激活或抑制作用的方法。
[0004]cAMP dynamic 2 assay是一種均相時間分辨焚光共振能量轉(zhuǎn)移免疫分析方法，以檢測在GPCRs調(diào)控下AC活性變化后產(chǎn)生的cAMP。該方法基于d2標記的cAMP示蹤劑與樣本cAMP競爭結(jié)合Eu3+-穴狀物標記的cAMP特異性抗體的結(jié)合位點。
[0005]當抗體結(jié)合了d2-cAMP示蹤劑，337nm處的激光可激發(fā)Eu3+-穴狀物分子，其發(fā)出的能量被轉(zhuǎn)移到示蹤劑的d2分子上，而發(fā)出665nm的熒光，在665nm處的熒光強度隨著待測樣品中的cAMP含量的增多而減弱，因此信號強度與樣品中cAMP濃度成反比。
[0006]對于Ga s耦聯(lián)的受體，細胞受到激動劑作用而激活會導(dǎo)致c A Μ P水平增加，同時665nm處的熒光強度減弱。加入拮抗劑后該反應(yīng)逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致信號增強。對于Gai耦聯(lián)的受體，細胞在AC激動劑Forskol in和激動劑的共同作用下被激活。激動劑可抑制Forskol in誘導(dǎo)的cAMP的產(chǎn)生，因此cAMP-d2信號相對于由Forskolin單獨處理的細胞會增加。而拮抗劑會阻滯激動劑的作用，導(dǎo)致cAMP-d2信號的增加。
[0007]時間分辨焚光技術(shù)(time-resolved fluorescence，TRF)是基于鑭系元素如銪(Eu)、釤(Sm)、鏑(Dy)等具有較長熒光壽命的特點發(fā)展而來的。當銪螯合物供體與受體之間距離小于10nm，且供體發(fā)射光譜與受體激發(fā)光譜有重疊時，則發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，均相時間分辨焚光(homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF)技術(shù)是法國Cisb1公司利用這一原理進行深入開發(fā)的產(chǎn)品。大多數(shù)熒光物質(zhì)的熒光壽命非常短(一般為幾毫秒)，為了避免短暫的熒光干擾，Cisb1公司利用較長熒光壽命的鑭系螯合物作為熒光能量供體，受體經(jīng)過別藻藍蛋白(allophycocyanin)或焚光素修飾，供體在能量轉(zhuǎn)移時就可以使受體也具有較長的熒光壽命。因此，能量轉(zhuǎn)移時受體發(fā)射光消失時間與供體發(fā)射光消失時間成正比，而與供受體間的距離成反比，這種方法延長了熒光檢測時間，降低了短暫熒光引起的背景干擾。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于建立一種基于熒光的前列腺素受體4拮抗劑高通量篩選模型，具有信噪比高，使用安全，樣品消耗量小的特點。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案:首先用含有zeocin的培養(yǎng)基培293cl8/EP4穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，培養(yǎng)一段時間后，加入激動劑，反應(yīng)45min。最后加入d2標記的cAMP示蹤劑與樣本cAMP競爭結(jié)合Eu3+穴狀物標記的cAMP特異性抗體的結(jié)合位點，反應(yīng)1小時。最后在Paradigm? Detect1nPlatform檢測信號強度評價樣品中cAMP濃度，信號與樣品中cAMP濃度成濃度依賴。最終實現(xiàn)待測樣品對芳香化酶抑制活性的高通量篩選
[0010]本發(fā)明利用熒光的方法建立了前列腺素受體4拮抗劑高通量篩選模型。
[0011 ]步驟一:前列腺素受體4拮抗劑篩選模型的建立與優(yōu)化。
[0012]步驟二:陽性藥驗證模型可靠性。
[0013]步驟三:高通量篩選模型驗證。
【附圖說明】
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[0014]圖hForskolin作用不同細胞數(shù)所產(chǎn)生的信號與標準曲線的對比，結(jié)果表示為Mean土SD。
[0015]圖2: PGD2可刺激EP4減少cAMP生成且成量效依賴性，結(jié)果表示為Mean 土 SD
[0016]圖3:L-161982可拮抗PGD2刺激EP4減少cAMP生成且成量效依賴性，結(jié)果表示為Mean土SD。
【具體實施方式】
[0017]以下結(jié)合【附圖說明】本發(fā)明的【具體實施方式】:
[0018]—、前列腺素受體4拮抗劑篩選方法建立
[0019]1、實驗材料
[0020](1)細胞株:293cl8/EP4
[0021](2)完全培養(yǎng):DMEM;10%FBS
[0022](3)選擇培養(yǎng):2yL/mL zeocin
[0023](4)Stimulat1n Buffer(SB):含ImM IBMX的DMEM。
[0024](5)主要儀器:CO2培養(yǎng)箱；384孔板；Paradigm? Detect1n Platform
[0025]2、實驗步驟
[0026](1)細胞培養(yǎng)
[0027]1)T25中培養(yǎng)的細胞貼壁度要達到80%，達到對數(shù)生長期。
[0028]2)棄去培養(yǎng)基后用lmL PBS沖洗細胞一次。
[0029]3)用3mL 0.5mM EDTA消化細胞5min后用3mL培養(yǎng)基終止消化。
[0030]4) lOOOrpm 離心 5min。
[0031 ]5)棄去上清液后用適量培養(yǎng)基重懸細胞，對細胞計數(shù)。
[0032]6)用培養(yǎng)基稀釋細胞懸液至6mL，使細胞密度達到5 X 105cells/mL，將此細胞懸液移入T25培養(yǎng)瓶中，在37°C/5 % C02環(huán)境下培養(yǎng)細胞。
[0033]7)用于確定細胞數(shù)、驗證陽性藥及篩選EP4拮抗劑試驗的293cl8/EP4細胞應(yīng)是復(fù)蘇后至少傳代3次且達到穩(wěn)定生長狀態(tài)的細胞。于實驗前將其用PBS潤洗細胞一次，接著用
0.5mM EDTA消化，離心，去除上層液體，最后將細胞用適量SB重懸至所需細胞密度。
[0034](2)標準曲線的測定及最佳細胞數(shù)確定
[0035]1)配制cAMP標準稀釋液:cAMP標準溶液(試劑盒自帶)逐級稀釋為最終濃度的2倍。
[0036]2)配制Forskol in梯度稀釋液:需要用Forskol in對細胞進行刺激，所以應(yīng)將Forskol in儲備液逐級稀釋為最終濃度的2倍。
[0037]3)配制不同濃度的細胞稀釋液:用SB將1.(7)中重懸好的細胞分別稀釋為200cells/yL、500cells/yUS800cell