基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)硫氰酸根離子進(jìn)行檢測(cè)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)牛奶中硫氰酸根離子進(jìn)行檢測(cè)的方法，步驟為：金納米溶液膠的制備、熒光素-金納米復(fù)合物的合成、硫氰酸根離子的檢測(cè)、實(shí)際樣品的檢測(cè)等步驟。本發(fā)明根據(jù)硫氰酸根與金納米表面的熒光素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合導(dǎo)致金納米-熒光素體系熒光恢復(fù)定量檢測(cè)硫氰酸根離子，提供的檢測(cè)方法所用的檢測(cè)總時(shí)間低于30min，可簡(jiǎn)單、快速、靈敏的檢測(cè)牛奶中的硫氰酸根離子，并且有很高的靈敏度，檢測(cè)限為0.09nM，為以后的研究、生產(chǎn)、監(jiān)管等提供了方便。
【專利說(shuō)明】基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)硫氰酸根離子進(jìn)行檢測(cè)的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)硫氰酸根離子進(jìn)行檢測(cè)的方法，屬于分 析【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 硫氰酸鹽是一種用于醫(yī)療、印染等多種行業(yè)的化工原料，存在于污水、工業(yè)廢水以 及農(nóng)藥殘?jiān)袝r(shí)，對(duì)環(huán)境、人體都有較大的影響。硫氰酸鹽是乳過(guò)氧化物酶抗體系重要成分 之一，常被用作生鮮乳保鮮劑使用，但硫氰酸鹽具有毒性，過(guò)量攝入可引起急性中毒；少量 攝入可抑制體內(nèi)碘的轉(zhuǎn)移而造成甲狀腺腫。2008年12月12日，衛(wèi)生部發(fā)布的食品中可能 違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第1批)中明確規(guī)定乳及乳制品中 硫氰酸鈉屬于違法添加物質(zhì)。
[0003] 目前，硫氰酸根的檢測(cè)方法主要有分光光度法（Spectrophotometry)、氣相色譜法 (GC)、離子色譜法（Ion Chromatography)、毛細(xì)管電泳法（Capillary Electrophoresis)、 表面共振能量轉(zhuǎn)移（Surface Resonance Energy Transfer)和突光法（Fluorometry)等，其 中離子色譜法較為常用。盡管這些方法靈敏度高，但樣品的前處理步驟較多，相對(duì)費(fèi)時(shí)，檢 測(cè)費(fèi)用較高，而且需要專業(yè)人員操作，使得不能廣泛應(yīng)用。目前，我國(guó)尚未發(fā)布牛奶中硫氰 酸根的檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)，因此，需要建立一種快速、簡(jiǎn)單、靈敏的方法檢測(cè)牛奶樣品中硫氰酸 根的檢測(cè)方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移以快速、簡(jiǎn)單、靈敏的檢測(cè)牛奶 中的硫氰酸根。將熒光素加入到檸檬酸三鈉還原法制備的金納米（AuNPs)溶液中，熒光素 通過(guò)共價(jià)鍵作用吸附到金納米表面，由于熒光素和金納米之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致 熒光素的熒光發(fā)生猝滅。當(dāng)加入硫氰酸根后，硫氰酸根與熒光素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到金納米表面，熒 光素離開(kāi)金納米表面熒光恢復(fù)。通過(guò)檢測(cè)金納米-熒光素體系的熒光恢復(fù)率對(duì)硫氰酸根進(jìn) 行定量檢測(cè)。
[0005] -種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)硫氰酸根離子進(jìn)行檢測(cè)的方法，具體步驟如下： (1) 金納米溶液膠的制備： 將所有玻璃器皿洗凈，用新制王水浸泡，再用超純水洗滌后烘干，通過(guò)檸檬酸三鈉還原 法制備金納米溶液膠：向250 mL三口燒瓶中加入I mmol/L氯金酸水溶液100 mL充分?jǐn)?拌下加熱至沸騰，攪動(dòng)下快速加入38. 8 mmol/L檸檬酸三鈉水溶液，使得金黃色的氯金酸水 溶液在2分鐘內(nèi)變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)冷凝回流15 min，自然冷卻至室溫，即制得金納米溶膠， 4° C下保存?zhèn)溆茫?(2) 熒光素-金納米復(fù)合物的合成： 把30 μ L濃度為I. OX 10_5mol的熒光素加入到上述制備好的200 μ L金納米溶膠中孵 化5-20min，熒光素與金納米表面的檸檬酸根通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)作用吸附到金納米表面，得到熒 光素-金納米復(fù)合物，備用； (3)硫氰酸根離子的檢測(cè)： 分別把770 yL、0. Ol mol/L、pH6. 0-8. O的PBS緩沖溶液配制的不同質(zhì)量的硫氰酸 鈉添加到上述制備的熒光素-金納米復(fù)合物中，使得溶液中硫氰酸根的最終濃度依次分 別為：0、1· 0、3· 0、5· 0、10· 0、15· 0、20· 0、25· 0、30· 0、35· 0、40· 0、50· 0、100· 0、200· 0 nmol/ L，即為硫氰酸根標(biāo)樣，室溫下孵化反應(yīng)IOmin后對(duì)其進(jìn)行熒光測(cè)定，硫氰酸根存在時(shí)熒光 素-金納米溶液在531nm處的熒光強(qiáng)度為I f,硫氰酸根濃度為0時(shí)熒光素-金納米的熒光 強(qiáng)度為1〇,根據(jù)熒光恢復(fù)率=(If-Ic 1VIc)與硫氰酸根的濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，硫氰酸根的檢測(cè) 限為0. 09nM，線性范圍為1-40 nmol/L。
[0006] (4)實(shí)際樣品檢測(cè)： 液態(tài)奶的檢測(cè)：向2g待測(cè)液態(tài)奶中加入不同濃度的硫氰酸根標(biāo)樣，再加入到I. 5mL質(zhì) 量濃度為10%的三氯乙酸水溶液和5. OmL乙腈的混合溶液中，超聲震蕩15min后轉(zhuǎn)移到離 心管中，12000 rpm/min轉(zhuǎn)速下離心15min，取上清液，并通過(guò)0. 22 μ m膜過(guò)濾器移去脂肪， 再將濾液的PH調(diào)制6. 8離心后再次通過(guò)0. 22 μ m膜過(guò)濾器過(guò)濾，將濾液用二次超純水稀釋 至10mL，取100 μ L樣品溶液加入到2mL上述制備的熒光素金-納米復(fù)合物中，對(duì)其進(jìn)行熒 光測(cè)定，硫氰酸根存在時(shí)樣品在531nm處的熒光強(qiáng)度為I f，硫氰酸根濃度為0時(shí)樣品的熒光 強(qiáng)度為1〇,算出熒光恢復(fù)率=(if-i〇)/i。后代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)的值即為液態(tài)奶中 硫氰酸根的量，測(cè)定樣品回收率=液態(tài)奶中硫氰酸根測(cè)定值/ SCNl示樣加入量X 100% ; 奶粉的檢測(cè)：將〇. 6g待測(cè)奶粉用超純2. OmL水溶解后加入不同濃度的硫氰酸根標(biāo)樣， 再加入到質(zhì)量濃度為10%的三氯乙酸水溶液和5. OmL乙腈的混合溶液中，超聲震蕩15min 后轉(zhuǎn)移到離心管中，12000 rpm/min轉(zhuǎn)速下離心15min，取上清液，并通過(guò)0. 22 μ m膜過(guò)濾 器移去脂肪，再將濾液的PH調(diào)制6. 8離心后再次通過(guò)0. 22 μ m膜過(guò)濾器過(guò)濾，將濾液用二 次超純水稀釋至10mL，取100 μ L樣品溶液加入到2mL上述制備的熒光素金-納米復(fù)合物 中，對(duì)其進(jìn)行熒光測(cè)定，硫氰酸根存在時(shí)樣品在531nm處的熒光強(qiáng)度為I f，硫氰酸根濃度為 〇時(shí)樣品的熒光強(qiáng)度為1〇,算出熒光恢復(fù)率=(If-IciVIc)后代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)的 值即為液態(tài)奶中硫氰酸根的量，測(cè)定樣品回收率=奶粉中硫氰酸根的測(cè)定值/ SCNl示樣加 入量X 100%。
[0007] 0· 01mol/L、ρΗ6· 0-8. 0的PBS緩沖溶液配置方法如下： 0. 2mol/L、pH6. 0-8. 0的PBS緩沖溶液的配方如下表所示：

【權(quán)利要求】
1. 一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)硫氰酸根離子進(jìn)行檢測(cè)的方法，其特征在于：利用被 分析物硫氰酸根的競(jìng)爭(zhēng)性取代金納米表面的熒光素，熒光素與金納米微粒之間的距離發(fā)生 變化，從而實(shí)現(xiàn)熒光恢復(fù)，包括以下步驟：金納米粒子（AuNPs)的制備、金納米-熒光素探針 的合成、硫氰酸根離子的檢測(cè)；實(shí)際樣品的檢測(cè)。
2. -種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)硫氰酸根離子進(jìn)行檢測(cè)的方法，其特征在于： 具體步驟如下： (1) 金納米溶液膠的制備： 將所有玻璃器皿洗凈，用新制王水浸泡，再用超純水洗滌后烘干，通過(guò)檸檬酸三鈉還原 法制備金納米溶液膠：向250 mL三口燒瓶中加入I mmol/L氯金酸水溶液100 mL充分?jǐn)?拌下加熱至沸騰，攪動(dòng)下快速加入38. 8 mmol/L檸檬酸三鈉水溶液，使得金黃色的氯金酸水 溶液在2分鐘內(nèi)變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)冷凝回流15 min，自然冷卻至室溫，即制得金納米溶膠， 4° C下保存?zhèn)溆茫? (2) 熒光素-金納米復(fù)合物的合成： 把30 ii L濃度為I. OX KT5moI的熒光素加入到上述制備好的200 ii L金納米溶膠中孵 化5-20min，熒光素與金納米表面的檸檬酸根通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)作用吸附到金納米表面，得到熒 光素-金納米復(fù)合物，備用； (3) 硫氰酸根離子的檢測(cè)： 分別把770 iiL、0. 01 mol/L、pH6. 0-8. 0的PBS緩沖溶液配制的不同濃度的硫氰酸 鈉添加到上述制備的熒光素-金納米復(fù)合物中，使得溶液中硫氰酸根的最終濃度依次分 別為：0、1. 0、3. 0、5. 0、10. 0、15. 0、20. 0、25. 0、30. 0、35. 0、40. 0、50. 0、100. 0、200. 0 nmol/ L，即為硫氰酸根標(biāo)樣，室溫下孵化反應(yīng)IOmin后對(duì)其進(jìn)行熒光測(cè)定，硫氰酸根存在時(shí)熒光 素-金納米溶液在531nm處的熒光強(qiáng)度為If,硫氰酸根濃度為0時(shí)熒光素-金納米的熒光 強(qiáng)度為1〇,根據(jù)熒光恢復(fù)率=(If-Ic1VIc)與硫氰酸根的濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，硫氰酸根的檢測(cè) 限為0. 09nM，線性范圍為1-40 nmol/L ; (4) 實(shí)際樣品檢測(cè)： 液態(tài)奶的檢測(cè)：向2g待測(cè)液態(tài)奶中加入不同濃度的硫氰酸根標(biāo)樣，再加入到I. 5mL質(zhì) 量濃度為10%的三氯乙酸水溶液和5. OmL乙腈的混合溶液中，超聲震蕩15min后轉(zhuǎn)移到離 心管中，12000 rpm/min轉(zhuǎn)速下離心15min，取上清液，并通過(guò)0. 22 ii m膜過(guò)濾器移去脂肪， 再將濾液的PH調(diào)制6. 8離心后再次通過(guò)0. 22 y m膜過(guò)濾器過(guò)濾，將濾液用二次超純水稀釋 至10mL，取100 ii L樣品溶液加入到2mL上述制備的熒光素金-納米復(fù)合物中，對(duì)其進(jìn)行熒 光測(cè)定，硫氰酸根存在時(shí)樣品在531nm處的熒光強(qiáng)度為If，硫氰酸根濃度為0時(shí)樣品的熒光 強(qiáng)度為1〇,算出熒光恢復(fù)率=仏-1〇)/1〇后代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)的值即為液態(tài)奶中 硫氰酸根的量，測(cè)定樣品回收率=液態(tài)奶中硫氰酸根的測(cè)定值/ SCNl示樣加入量X 100% ; 奶粉的檢測(cè)：將〇. 6g待測(cè)奶粉用超純2. OmL水溶解后加入不同濃度的硫氰酸根標(biāo)樣， 再加入到質(zhì)量濃度為10%的三氯乙酸水溶液和5. OmL乙腈的混合溶液中，超聲震蕩15min 后轉(zhuǎn)移到離心管中，12000 rpm/min轉(zhuǎn)速下離心15min，取上清液，并通過(guò)0. 22 ii m膜過(guò)濾 器移去脂肪，再將濾液的PH調(diào)制6. 8離心后再次通過(guò)0. 22 y m膜過(guò)濾器過(guò)濾，將濾液用二 次超純水稀釋至10mL，取100 ii L樣品溶液加入到2mL上述制備的熒光素金-納米復(fù)合物 中，對(duì)其進(jìn)行熒光測(cè)定，硫氰酸根存在時(shí)樣品在531nm處的熒光強(qiáng)度為I f，硫氰酸根濃度為
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104316501SQ201410555876
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月20日
【發(fā)明者】吳芳英, 宋娟, 萬(wàn)益群 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)