專利名稱：大容量疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大容量的疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)及其制備方法，屬于生化工程領(lǐng)域中 的蛋白質(zhì)色譜分離技術(shù)。
背景技術(shù)：
近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，那些與人類健康密切相關(guān)的蛋白質(zhì)得以通過基因重組 技術(shù)而批量生產(chǎn)。這種借助基因工程菌規(guī)模化批量生產(chǎn)蛋白質(zhì)所獲得的產(chǎn)物中不僅含有目 標(biāo)產(chǎn)品，也包括大量宿主細(xì)胞自身發(fā)育生長中產(chǎn)生的雜蛋白。同時(shí)，廣泛采用的高密度發(fā) 酵技術(shù)以提供更為豐富的碳、氮及無機(jī)鹽離子為前提實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高收率。與此同時(shí)， 那些殘留在發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)也使得目標(biāo)產(chǎn)物處于更加復(fù)雜的環(huán)境中，從而加劇了生物 下游加工過程的難度。因此，高效而經(jīng)濟(jì)地從發(fā)酵液中收獲蛋白質(zhì)，便成為大規(guī)模分離純 化設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。
色譜技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離純化過程中。蛋白質(zhì)純化過程中常用的色譜技術(shù) 包括凝膠過濾色譜、離子交換色譜、疏水性相互作用色譜、親和色譜等。這些色譜在操作 中對于料液的離子強(qiáng)度有一定的要求。以離子交換色譜為例，色譜介質(zhì)對蛋白質(zhì)的吸附通
常在較低的離子強(qiáng)度(20 50 mmol/L)下進(jìn)行；與之相反，蛋白質(zhì)在疏水性相互作用色 譜中的吸附則主要發(fā)生在高離子強(qiáng)度(>500mmol/L)下。這樣的色譜過程往往需要增 加預(yù)處理及后處理步驟，完成對料液離子強(qiáng)度的調(diào)節(jié)。這不僅增加生產(chǎn)成本p且造成蛋白 質(zhì)的穩(wěn)定性下降。因此，降低色譜過程對離子強(qiáng)度的依賴性就能減少相關(guān)的輔助步驟，簡 化生物下游加工過程工藝，縮短蛋白質(zhì)提取的周期，提高工藝流程的經(jīng)濟(jì)性。
1996年，Burton和Harding公開了一種以可離子化基團(tuán)為配基的疏水性相互作用色 譜分離技術(shù)(CA2193867)。該色譜與通常疏水性相互作用色譜最大的區(qū)別在于蛋白質(zhì) 的吸附容量與離子強(qiáng)度無關(guān)；吸附蛋白質(zhì)的洗脫通過調(diào)節(jié)液相pH值實(shí)現(xiàn)。當(dāng)液相pH降低 時(shí)，離子化的配基與被吸附的蛋白質(zhì)由于帶同種電荷而產(chǎn)生靜電排斥作用，蛋白質(zhì)從色譜 介質(zhì)上解吸。據(jù)此，該色譜又被稱為疏水電荷誘導(dǎo)色譜或者混合模式色譜。Kasche等人 利用偶合苯基丁胺配基的色譜介質(zhì)實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的快速分離(J Chromatogr, 510: 149, 1990),但其對親水性蛋白的吸附作用十分有限，通常需要在高離子強(qiáng)度下進(jìn)行。1998年，
Biosepra公司公開了一種同樣基于疏水電荷誘導(dǎo)色譜原理的擬親和色譜，該色譜介質(zhì)以 含巰基的雜環(huán)化合物為配基(US Patent 5719269)。但該色譜介質(zhì)的應(yīng)用范圍僅限于抗 體的提純。近來，其它針對抗體分離而特定設(shè)計(jì)的色譜介質(zhì)專利還有US Patent 6498236 及US Patent 2007112178。 2007年，孫彥等人公開了一種含有吲哚基團(tuán)的疏水電荷 誘導(dǎo)色譜介質(zhì)(申請?zhí)?00710056591.4)。該色譜介質(zhì)采用了非鹽依賴性配基，可直 接從料液中捕獲蛋白質(zhì)且洗脫條件相對溫和。目前，疏水電荷誘導(dǎo)色譜已引起了廣泛地關(guān) 注，但配基的選擇仍然是當(dāng)前急待解決的問題。與傳統(tǒng)蛋白質(zhì)色譜方法相比，疏水電荷誘 導(dǎo)色譜仍然存在吸附容量低且洗脫條件也較傳統(tǒng)色譜方法更為苛刻等缺陷。因此，開發(fā)適 合于HCIC方法的配基對于HCIC的商業(yè)化進(jìn)程具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于開發(fā)一種大吸附容量的疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)及其制備方法。所述 的色譜介質(zhì)在擁有較高吸附容量的同時(shí)，可以通過更加溫和的、接近生理的洗脫條件加以 回收。所述的制備方法簡單、易于放大。
本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的。 一種大吸附容量的疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)， 其特征在于，該色譜介質(zhì)是在平均粒徑為30-300 |jm的瓊脂糖凝膠顆粒的介質(zhì)表面偶聯(lián) 環(huán)氧基，環(huán)氧基間隔臂末端偶聯(lián)咪唑化合物X為介質(zhì)的配基,色譜介質(zhì)結(jié)構(gòu)形式表達(dá)如下，
咪唑化合物X結(jié)構(gòu)式如I式所示，
<formula>formula see original document page 5</formula>
其中Rl-R4中的一個(gè)基團(tuán)必為氨基或含有l(wèi)-4個(gè)碳原子的短鏈垸基氨，其余的基 團(tuán)為氫原子或?yàn)楹?-4個(gè)碳原子的短鏈烷烴。
上述的咪唑化合物選自2-氨基咪唑、(R)-a-甲基咪唑、組胺、4-甲基組胺、3-甲基 組胺、4-氨甲基咪唑和5-甲基-4-氨甲基咪唑。
上述的色譜介質(zhì)的制備方法，其特征在于包括以下過程
1. 介質(zhì)的活化
將平均粒徑為30-300 |jm的瓊脂糖凝膠顆粒的介質(zhì)抽干后，倒入二甲基亞砜溶液中， 二甲基亞砜的體積用量為介質(zhì)體積量的0.5-10倍，制得介質(zhì)懸浮液，繼而向介質(zhì)懸浮液 中加入體積用量為介質(zhì)體積量的0.2-6倍的環(huán)氧氯丙烷，制得介質(zhì)混合懸浮液，向介質(zhì)混 合懸浮液中加入濃度為0.1-2.0 mol/L、體積用量為介質(zhì)懸浮液體積量的0.1-5倍的氫 氧化鈉溶液，之后于15-60 。C的水浴中活化0.3-10小時(shí)，濾出介質(zhì)用去離子水沖洗至 無游離的環(huán)氧基團(tuán)檢出后抽干水分，得到活化介質(zhì)。
2. 活化介質(zhì)的偶聯(lián)配基
將活化介質(zhì)再懸浮于含有咪唑化合物的磷酸氫二鈉溶液中，磷酸氫二鈉溶液中的咪唑 化合物的濃度按每克活化介質(zhì)用量0.02-10 mmol計(jì)，再將該活化介質(zhì)的磷酸氫二鈉懸 浮液于25-70 °C下反應(yīng)2-20小時(shí)完成配基的偶聯(lián)，收集偶聯(lián)配基介質(zhì)經(jīng)去離子水清洗 后，將偶聯(lián)配基介質(zhì)懸浮于0.2-1.0 g/L硼氫化鈉中反應(yīng)10-18小時(shí)還原介質(zhì)表面殘留 的環(huán)氧基團(tuán)，從而得到大吸附容量的疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)。
上述的介質(zhì)活化過程中，二甲基亞砜的體積用量為凝膠介質(zhì)體積量的1-5倍，環(huán)氧氯 丙垸的體積用量為凝膠介質(zhì)體積量的0.4-4倍，氫氧化鈉濃度為0.4-1.4 mol/L，體積 用量為介質(zhì)懸浮液體積量的0.4-2倍，活化反應(yīng)溫度為30-50 。C和反應(yīng)時(shí)間為1-4小 時(shí)；上述的活化介質(zhì)的偶聯(lián)配基過程中，磷酸氫二鈉溶液中的咪唑化合物的濃度按每克活 化介質(zhì)需0.2-5 mmol計(jì)，偶聯(lián)反應(yīng)溫度為35-60 。C和反應(yīng)時(shí)間為4-12小時(shí)；偶聯(lián) 配基介質(zhì)在0.3-0.8 g/L硼氫化鈉中反應(yīng)還原介質(zhì)表面殘留的環(huán)氧基團(tuán)。
本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)有五點(diǎn)首先是配基的選擇方式，通過計(jì)算機(jī)虛擬篩選從近20萬 的化合物分子庫中篩選獲得疏水性適中、可在接近中性環(huán)境中弱解離的咪唑化合物為配 基，并通過對配基與蛋白質(zhì)分子的對接獲得候選的配基；其次是環(huán)氧氯丙烷活化條件的選 擇，在水溶液中環(huán)氧氯丙烷的活化作用受到其在水中溶解度的限制而難以獲得提高，本發(fā) 明通過引入親水性有機(jī)溶劑二甲基亞砜，促進(jìn)了環(huán)氧氯丙烷的溶解度和均相反應(yīng)體系的形 成，同時(shí)偶聯(lián)介質(zhì)中殘留的環(huán)氧基團(tuán)經(jīng)還原處理后生成羥基，不會(huì)產(chǎn)生非特異性吸附；關(guān) 鍵之三配基偶聯(lián)過程中配基的加入量，配基加入量的增加有利于提高配基的修飾密度，但
過量配基的加入會(huì)徒贈(zèng)合成的成本；關(guān)鍵之四配基偶聯(lián)條件的選擇，適當(dāng)?shù)呐悸?lián)溫度及反 應(yīng)時(shí)間可有效地提高配基在介質(zhì)表面的偶聯(lián)效率，而偶聯(lián)步驟中液相的體積的控制也可獲 得高配基修飾密度的介質(zhì)；最后是采用適當(dāng)?shù)倪€原步驟處理殘留的環(huán)氧基團(tuán)，避免色譜介 質(zhì)的非特異吸附及其對后續(xù)其它操作的影響。
本發(fā)明提供的大容量的疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)材料，該色譜介質(zhì)具有如下顯著特點(diǎn)-偶聯(lián)配基的色譜介質(zhì)對主要的模型蛋白質(zhì)均有較高的吸附容量且吸附容量在較寬的離子
強(qiáng)度范圍(0.1-1.0 mol/L)內(nèi)維持相對恒定；由此，料液的離子強(qiáng)度無需進(jìn)行調(diào)節(jié)，從 而為實(shí)現(xiàn)直接從發(fā)酵過程的原料液中捕獲蛋白質(zhì)奠定了基礎(chǔ)；相對于常規(guī)的疏水相互作用 以及離子交換色譜介質(zhì)而言，本發(fā)明涉及的色譜介質(zhì)主要依靠pH在4.0-6.0間的調(diào)節(jié)完 成蛋白質(zhì)的洗脫，不涉及高鹽或低鹽等極端條件的應(yīng)用，具有更溫和的洗脫條件，進(jìn)而避 免了蛋白質(zhì)的解聚、凝聚及變性等現(xiàn)象，確保了蛋白的活性；第三，經(jīng)由環(huán)氧氯丙烷偶聯(lián) 的配基穩(wěn)定性好、清洗、再生方便，環(huán)氧基團(tuán)經(jīng)還原處理后不會(huì)產(chǎn)生非特異性吸附，由此 在蛋白等生物大分子分離純化中將有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為實(shí)施例1中所制備的色譜介質(zhì)在不同氯化鈉濃度下溶菌酶的吸附等溫線，其中 (令)表示液相中氯化鈉的濃度為50 mmol/L; (A)表示液相中氯化鈉的濃度為100
mmol/L;(參)表示液相中氯化鈉的濃度為200 mmol/L; (B)表示液相中氯化鈉的濃度 為500 mmol/L 。
圖2為實(shí)施例1中所制備的色譜介質(zhì)在不同pH下溶菌酶的吸附等溫線，其中(*) 表示液相pH值為4.5;(誦)表示液相pH值為7.0;
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)例將對本發(fā)明提供的方法予以進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例1
將浸泡在體積濃度20 0/o乙醇中的、平均粒徑為87 pm的S印harose CL-6B用去 離子水沖洗干凈后，于砂漏中用水泵抽干5min;稱取lg抽干的S印harose CL-6B置 入50 ml三角瓶中，加入1.5mL氫氧化鈉(0.8 mol/L)、 0.5mL環(huán)氧氯丙烷、2mL 二
甲基亞砜，在40 °C， 170 rpm下振蕩反應(yīng)3h。即可得到環(huán)氧基活化的S印harose CL-6B瓊脂糖凝膠介質(zhì)。活化介質(zhì)在砂漏中經(jīng)反復(fù)沖洗除去游離的環(huán)氧氯丙烷后，測定 凝膠介質(zhì)的環(huán)氧基修飾密度為120 [jmol/mL活化介質(zhì)。
稱取1.0 g活化介質(zhì)置于5 mL磷酸氫二鈉中，溶液中含0.6 mmol組胺;置于60°C 恒溫水浴中反應(yīng)IO小時(shí)；得到的介質(zhì)依次用O.l mol/L氫氧化鈉、體積濃度20 %乙 醇和蒸餾水徹底沖洗干凈后，加入0.5 g/L硼氫化鈉溶液在室溫下還原凝膠介質(zhì)表面的 環(huán)氧基團(tuán)，即可得到產(chǎn)物，色譜介質(zhì)中組胺的偶聯(lián)密度為90 |jmol/mL。
實(shí)施例2
實(shí)施例1中環(huán)氧氯丙垸的體積用量為1.5 mL， 1.4 mol/L氫氧化鈉的體積用量為5.0 mL，其它條件不變，所得到活化介質(zhì)中環(huán)氧基修飾密度為158.6p mol/mL活化介質(zhì)。 偶聯(lián)反應(yīng)加入3-甲基組胺的濃度為2.0 mmol/L，色譜介質(zhì)中配基的偶聯(lián)密度為114 ,ol/mL。
實(shí)施例3
將浸泡在體積濃度20 %乙醇中的、平均粒徑為87 |jm的Sepharose CL-6B用去 離子水沖洗干凈后，于砂漏中用水泵抽干5min;稱取lg抽干的S印harose CL-6B置 入50 mL三角瓶中，加入1.5mL氫氧化鈉(0.5 mol/L)、 0.3mL環(huán)氧氯丙烷、2mL 二甲基亞砜，在25。C， 170rpm下振蕩反應(yīng)3h。即可得到環(huán)氧基活化的Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠介質(zhì)。活化介質(zhì)在砂漏中經(jīng)反復(fù)沖洗除去游離的環(huán)氧氯丙烷后，測定 凝膠介質(zhì)的環(huán)氧基修飾密度為70 n mol/mL活化介質(zhì)。
稱取1.0 g活化介質(zhì)置于5 mL磷酸氫二鈉中，溶液中含0.5 mmol 4-氨甲基咪唑； 置于60°(:恒溫水浴中反應(yīng)10小時(shí)；得到的介質(zhì)依次用O.l mol/L氫氧化鈉、體積濃 度20%乙醇和蒸餾水徹底沖洗干凈后，加入0.5g/L硼氫化鈉溶液在室溫下還原凝膠 介質(zhì)表面的環(huán)氧基團(tuán)，即可得到色譜介質(zhì)，色譜介質(zhì)中配基的偶聯(lián)密度為36 |jmol/mL。
實(shí)施例4
實(shí)施例1中組胺加入量3.0 mmol,其他條件不變,所得色譜介質(zhì)中配基的偶聯(lián)密度為 102 |jmol/mL。
實(shí)施例5
實(shí)施例1所制備的介質(zhì)在含有不同濃度氯化鈉(50、 100、 200和500 mmol/L)的 0.01 mol/L Tris-HCI緩沖液(pH 7.0)中平衡12小時(shí)后，經(jīng)砂濾漏斗抽干去除多余 的溶液；分別稱取上述色譜介質(zhì)0.1 g加入到10 mL含有不同溶菌酶濃度(0.0-2.0 mg/mL)的平衡緩沖液中；上述懸浮液在25°C恒溫空氣浴中反應(yīng)12h后，離心后收集 的上清液在280 nm下測定吸光值，確定色譜介質(zhì)的吸附量；在0.05-0.5 mol/L氯化 鈉濃度下，色譜介質(zhì)的靜態(tài)飽和吸附溶菌酶量為54-62 mg/mL色譜介質(zhì)(如圖1所示)。
實(shí)施例6
實(shí)施例1所制備的色譜介質(zhì)在氫化鈉濃度為50mmol/L， pH 4.5和pH 7.0緩沖液 中平衡后，經(jīng)砂濾漏斗抽干去除多余的溶液；分別稱取上述色譜介質(zhì)0.1 g加入到10 mL 含有不同溶菌酶濃度(0.0-2.0 mg/mL)的平衡緩沖液中；上述懸浮液在25°C恒溫空氣 浴中反應(yīng)12h后，離心后收集的上清液在280 nm下測定吸光值，確定色譜介質(zhì)的吸附 量；在pH 4.5和7.0條件下，色譜介質(zhì)的靜態(tài)飽和吸附溶菌酶量分別為6.6和53.9 mg/mL色譜介質(zhì)(如圖2所示)。
權(quán)利要求
1.一種大吸附容量的疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)，其特征在于，該色譜介質(zhì)是在平均粒徑為30-300μm的瓊脂糖凝膠顆粒的介質(zhì)表面偶聯(lián)環(huán)氧基，環(huán)氧基間隔臂末端偶聯(lián)咪唑化合物X為介質(zhì)的配基，色譜介質(zhì)結(jié)構(gòu)形式表達(dá)如下，id="icf0001" file="S200710059577XC00011.gif" wi="32" he="36" top="5" left = "5" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>咪唑化合物X結(jié)構(gòu)式如I式所示，id="icf0002" file="S200710059577XC00012.gif" wi="28" he="36" top="5" left = "5" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>其中R1-R4中的一個(gè)基團(tuán)必為氨基或含有1-4個(gè)碳原子的短鏈烷基氨，其余的基團(tuán)為氫原子或?yàn)楹?-4個(gè)碳原子的短鏈烷烴。
2. 按權(quán)利要求1所述的大吸附容量的疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)，其特征在于，咪唑化 合物選自2-氨基咪唑、(R)-a-甲基咪唑、組胺、4-甲基組胺、3-甲基組胺、4-氨甲基咪 唑和5-甲基-4-氨甲基咪唑。
3. —種制備權(quán)利要求l所述的大吸附容量的疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)方法，其特征在 于包括以下過程1) .介質(zhì)的活化將平均粒徑為30-300 |jm的瓊脂糖凝膠顆粒的介質(zhì)抽干后，倒入二甲基亞砜溶液中， 二甲基亞砜的體積用量為介質(zhì)體積量的0.5-10倍，制得介質(zhì)懸浮液，繼而向介質(zhì)懸浮液 中加入體積用量為介質(zhì)體積量的0.2-6倍的環(huán)氧氯丙烷，制得介質(zhì)混合懸浮液，向介質(zhì)混 合懸浮液中加入濃度為0.1-2.0 mol/L、體積用量為介質(zhì)懸浮液體積量的0.1-5倍的氫 氧化鈉溶液，之后于15-60 °C的水浴中活化0.3-10小時(shí)，濾出介質(zhì)用去離子水沖洗至 無游離的環(huán)氧基團(tuán)檢出后抽干水分，得到活化介質(zhì)；2) .活化介質(zhì)的偶聯(lián)配基將活化介質(zhì)再懸浮于含有咪唑化合物的磷酸氫二鈉溶液中，磷酸氫二鈉溶液中的咪唑咪唑化合物X結(jié)構(gòu)式如I式所示， 化合物的濃度按每克活化介質(zhì)用量0.02-10 mmol計(jì)，再將該活化介質(zhì)的磷酸氫二鈉懸 浮液于25-70 QC下反應(yīng)2-20小時(shí)完成配基的偶聯(lián)，收集偶聯(lián)配基介質(zhì)經(jīng)去離子水清洗 后，將偶聯(lián)配基介質(zhì)懸浮于0.2-1.0 g/L硼氫化鈉中反應(yīng)10-18小時(shí)還原介質(zhì)表面殘留 的環(huán)氧基團(tuán)，從而得到大吸附容量的疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)。
4.按權(quán)利要求3所述的大吸附容量的疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)的制備方法，其特征在 于，介質(zhì)活化過程中，二甲基亞砜的體積用量為凝膠介質(zhì)體積量的1-5倍，環(huán)氧氯丙垸的 體積用量為凝膠介質(zhì)體積量的0.4-4倍，氫氧化鈉濃度為0.4-1.4 mol/L，體積用量為 介質(zhì)懸浮液體積量的0.4-2倍，活化反應(yīng)溫度為30-50 。C和反應(yīng)時(shí)間為1-4小時(shí)；活 化介質(zhì)的偶聯(lián)配基過程中，磷酸氫二鈉溶液中的咪唑化合物的濃度按每克活化介質(zhì)需 0.2-5 mmol計(jì)，偶聯(lián)反應(yīng)溫度為35-60 。C和反應(yīng)時(shí)間為4-12小時(shí)；偶聯(lián)配基介質(zhì) 在0.3-0.8 g/L硼氫化鈉中反應(yīng)還原介質(zhì)表面殘留的環(huán)氧基團(tuán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大容量的疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)的制備方法，屬于生化工程領(lǐng)域中的蛋白質(zhì)色譜分離技術(shù)。該色譜介質(zhì)為間隔臂末端偶聯(lián)咪唑化合物作為色譜配基。其制備方法為將瓊脂糖凝膠介質(zhì)中依次加入二甲基亞砜、環(huán)氧氯丙烷和氫氧化鈉溶液后活化介質(zhì)；活化后的介質(zhì)在堿性的二甲基亞砜溶液中與咪唑化合物配基偶聯(lián)；最后介質(zhì)表面殘余的環(huán)氧基經(jīng)還原后得到所需的色譜介質(zhì)。該色譜介質(zhì)對蛋白質(zhì)的吸附容量達(dá)到80mg/ml濕介質(zhì)且在較寬的離子強(qiáng)度范圍(0.1-1.0mol/L)內(nèi)維持相對恒定；同時(shí)，依靠pH在4.0-6.0間的調(diào)節(jié)完成蛋白質(zhì)洗脫的模式更加溫和，由此在蛋白等生物大分子分離純化中將有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)B01J20/281GK101185882SQ20071005957
公開日2008年5月28日 申請日期2007年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月12日
發(fā)明者史清洪, 彥 孫, 沈芳芳, 姝 白, 董曉燕 申請人:天津大學(xué)