專利名稱：層析介質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及層析法領(lǐng)域。更精確地，本發(fā)明涉及一種新型層析介質(zhì)，即，一種 提供有不同的蓋的疏水性介質(zhì)，由于疏水性介質(zhì)的孔隙率和/或蓋的孔隙率，排除超過 一定尺寸的分子。在生物技術(shù)中，迄今為止提出的層析法基于與目標(biāo)的相互作用的不同的模式。 因此，例如，在離子交換層析法中，官能團(tuán)為與其相反電荷的反荷離子永久結(jié)合的離子 基團(tuán)，而在疏水性相互作用層析法(HIC)中，固定相與待分離的組分之間的相互作用基 于疏水性。基于疏水性相互作用的層析法通常分為命名為HIC和RPC的兩種類型。HIC是指使用非常親水性的基質(zhì)的蛋白質(zhì)的疏水性相互作用層析法，其中疏水 性配體與蛋白質(zhì)的固定化程度非常低，以避免已分離的蛋白質(zhì)變性。為了吸附待分離的 蛋白質(zhì)，需要在水中使用高濃度的無機(jī)鹽。通常通過在洗脫步驟中逐步降低離子強(qiáng)度來 實(shí)現(xiàn)解吸。RPC是指使用與疏水性非極性分子/配體(通常為包含4-18個(gè)碳原子的脂族碳 鏈)官能化程度非常高的基質(zhì)(通?；诙趸?的層析法。通常無需加入鹽可實(shí)現(xiàn) 吸附。最常通過逐步增加在洗脫溶液中有機(jī)溶劑的含量來進(jìn)行解吸或洗脫。含有18個(gè)碳鏈的RPC介質(zhì)與蛋白質(zhì)牢固結(jié)合。在結(jié)合過程中蛋白質(zhì)也有不同 程度的變性。為了洗脫蛋白質(zhì)，需要使用特別的條件。但是，具有較短鏈(4個(gè)碳)的 RPC介質(zhì)可與包含添加劑(例如三氟乙酸)的基于水/乙腈的洗脫液一起使用，用于蛋白 質(zhì)分離。固定相(也稱為分離基質(zhì))包含載體和與載體偶聯(lián)的配體，所述載體通常為許多 基本上為球形的顆粒。在大多數(shù)分離基質(zhì)中，載體具有多孔性，以在每個(gè)顆粒中允許較 大量的配體，因此具有更多結(jié)合的目標(biāo)化合物。載體最通常為天然或合成的聚合物，并 且可采用多種不同的方式來生產(chǎn)球形顆粒。也使用二氧化硅和玻璃珠。常用于該目的的 天然聚合物為多糖葡聚糖和瓊脂糖。對(duì)于通過層析和分批法分離生物分子，基質(zhì)(珠、整料、填充膜，等等)的孔隙 率非常重要。聚合物介質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)在于容易在寬范圍內(nèi)改變孔徑大小及其高化學(xué)穩(wěn)定性， 例如對(duì)高pH值的耐受性。在所有文獻(xiàn)中可接受的總的原則是對(duì)于大分子使用具有大孔徑 的介質(zhì)。在這些孔中的傳質(zhì)是由于擴(kuò)散過程而不是對(duì)流。在共同待審的SE 0800263-6申請(qǐng)中，描述了一種基于旋轉(zhuǎn)式圓盤技術(shù)的方法 (Walter 和 Prewett，Walton, W.H. ； Prewett, W.C. (1949)Proc.Phys.Soc.B.62, 341-350)來 生產(chǎn)具有所選孔隙率的瓊脂糖珠來排除大分子。人源化單克隆抗體(mAb)非常有希望作為生物藥物。在純化mAb中所面臨的 最大的挑戰(zhàn)之一為在細(xì)胞培養(yǎng)基中將其與宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)分離。當(dāng)今可使用多種 mAb分離技術(shù)，包括在蛋白質(zhì)A上的親和層析法、離子交換層析法和疏水性相互作用層 析法(HIC)。所有這些技術(shù)涉及使用流動(dòng)相(吸附緩沖液)，必須調(diào)節(jié)該流動(dòng)相以實(shí)現(xiàn)mAb-分子與配體之間的相互作用。例如，在HIC中，必須向流動(dòng)相中加入大量的鹽，并 且在離子交換層析法的情況下，必須調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH，使得與離子交換配體相比，mAb 帶相反的電荷。此外，當(dāng)mAb被配體吸附時(shí)，必須調(diào)節(jié)流動(dòng)相以實(shí)現(xiàn)mAb的解吸。期望得到一種層析介質(zhì)，該層析介質(zhì)的孔徑分布和表面性能可防止大分子(例 如mAb)進(jìn)入珠，并且在內(nèi)部可吸附蛋白質(zhì)和其他肽或生物分子，而與緩沖液條件無 關(guān)。用于分離生物分子的離子交換劑在低離子強(qiáng)度下能吸附大多數(shù)帶電荷的生物分子， 但是當(dāng)離子強(qiáng)度提高至超過一定水平時(shí)，這些介質(zhì)失去吸附樣品分子的能力。發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種介質(zhì)，該介質(zhì)在核心實(shí)體中具有高疏水性，使得在非常低離 子強(qiáng)度和非常高離子強(qiáng)度下、在寬pH范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)均可相互作用或被吸附。第一方面，本發(fā)明涉及一種分離介質(zhì)，所述分離介質(zhì)包含多孔性疏水性核心實(shí) 體；和覆蓋所述核心實(shí)體的整個(gè)外部的多孔性親水性蓋，其中所述蓋僅允許低于一定尺 寸的分子滲透分離介質(zhì)的核心實(shí)體的內(nèi)部并與之相互作用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，還優(yōu)選所述疏水性核心實(shí)體僅允許低于一定尺寸的 分子滲透分離介質(zhì)的核心實(shí)體的內(nèi)部并與之相互作用。所述多孔性親水性蓋為圍繞所述核心實(shí)體的多孔性外層或夾套/殼。所述分離介質(zhì)優(yōu)選提供有高度疏水性核心，以便結(jié)合蛋白質(zhì)和其他疏水性分 子，而與樣品的特性和運(yùn)行條件無關(guān)，運(yùn)行條件例如在層析法的情況下，為離子強(qiáng)度和 pH,或者在分批法的情況下為上清液。所述分離介質(zhì)優(yōu)選為珠形狀，但是也可為膜。介質(zhì)的尺寸排阻特性由其多孔性成分之一或兩者的孔隙率決定。以上所指的一 定尺寸低于排除以下目標(biāo)分子/有機(jī)體/顆粒的尺寸例如細(xì)胞、細(xì)胞顆粒、病毒、病毒 樣顆粒、質(zhì)粒、任何類型的抗體、脂類、蛋白質(zhì)、肽和核酸。該介質(zhì)將小尺寸分子與上 述類型的較大的分子有效分離。所述疏水性核心實(shí)體本身可為疏水性的，且可基于疏水性聚合物。例如，苯乙 烯/乙基苯乙烯/DVB、包含疏水性取代基的乙烯基醚和丙烯酸酯以及含氟烷烴的聚合 物?；蛘?，所述疏水性核心實(shí)體本身為親水性的，且基于被疏水性相互作用配體官 能化的親水性聚合物。所述疏水性相互作用配體可包含脂族烴(例如Ci-C^烷基，優(yōu)選 C4_C16烷基)和/或芳族烴(例如苯基、蒽(antracene)、萘(naphtalene))。與配體無關(guān)， 配體密度應(yīng)總是優(yōu)化的，以便在低離子強(qiáng)度下吸附并且目的是得到所需的介質(zhì)高度疏水 性性質(zhì)。優(yōu)選，配體密度應(yīng)超過標(biāo)準(zhǔn)HIC-水平，即，> 90iimol/ml核心實(shí)體。疏水性核心實(shí)體允許吸附樣品中的分子(具有最低分子量和/或最小尺寸)，該 分子在低離子強(qiáng)度例如0-1M，優(yōu)選0-0.4M，最優(yōu)選0-0.1M下和在pH間隔2_11下能滲 透蓋o在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核心實(shí)體除了所述疏水性配體以外還包含其他配體， 所述其他配體可位于所述核心實(shí)體上和/或與所述核心實(shí)體相關(guān)和/或位于所述疏水性配 體上。所述其他配體可為疏水性的，且可包含非主要帶電荷的基團(tuán)。優(yōu)選，所述其他配 體為靜電相互作用配體，即，帶正電荷和/或帶負(fù)電荷的配體。例如，這些其他配體可 為帶有正電荷的辛基胺配體，提高了小的帶負(fù)電荷的分子與核心實(shí)體的結(jié)合。應(yīng)調(diào)節(jié)另外加入的帶電荷的配體的量，使得它們對(duì)與主要的疏水性配體的疏水性相互作用的影響 不太大。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核心實(shí)體和蓋由瓊脂糖制成，并且所述疏水性 配體為包含4-16個(gè)碳原子的烴配體，優(yōu)選辛基配體。優(yōu)選，核心實(shí)體的孔徑防止超過一定尺寸的分子進(jìn)入所述孔?；蛘?，或者除此 以外，在蓋中提供聚合物水凝膠(例如葡聚糖)以填充所述孔，從而進(jìn)一步降低和調(diào)節(jié)孔 徑，以防止高分子量分子進(jìn)入所述孔。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述親水性蓋包含任何類型的層析配體，該配體與樣品 內(nèi)的具有最高分子量和/或最大尺寸的分子可逆結(jié)合。一些小分子可能也與蓋結(jié)合，但 是在洗脫步驟過程中，這些小分子最可能滲透蓋并與核結(jié)合。對(duì)于某些應(yīng)用，例如蛋白質(zhì)組分析，可將磁性顆粒摻入到分離介質(zhì)的核心實(shí) 體。本發(fā)明還涉及一種分離介質(zhì)，該分離介質(zhì)包含上述蓋珠介質(zhì)與常規(guī)層析介質(zhì) (例如HIC、IE或親和介質(zhì))的混合物。優(yōu)選所述蓋珠介質(zhì)占總介質(zhì)體積的最高達(dá)10%。 在該混合介質(zhì)的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述蓋珠介質(zhì)包含辛基配體，并且所述層析介 質(zhì)包含陽離子交換介質(zhì)。該混合介質(zhì)的益處在于提高大分子與小分子之間的分辨率。在第二方面，本發(fā)明涉及在低離子強(qiáng)度下、在pH為2-11下，使用上述分離介質(zhì) 來從樣品中吸附低于一定尺寸的分子，優(yōu)選在一個(gè)單一步驟中進(jìn)行。所述方法可用于純 化超過或低于所述尺寸的分子。因此，該方面涉及使用所述分離介質(zhì)的方法，所述方法 包括吸附分子的步驟和任選的一個(gè)或多個(gè)其他步驟。在具體的應(yīng)用中，以上所指的孔徑隨著目標(biāo)分子的尺寸而變，并且由目標(biāo)分子 的尺寸決定。優(yōu)選該一定尺寸范圍相應(yīng)于選自以下的分子/有機(jī)體/顆粒的尺寸范圍細(xì) 胞、細(xì)胞顆粒、細(xì)菌、病毒、病毒樣顆粒、質(zhì)粒、抗體、脂類、蛋白質(zhì)、肽、核酸。所 述樣品可例如為培養(yǎng)上清液，并且所述高分子量分子可為單克隆抗體。所述分離介質(zhì)在 細(xì)胞收獲時(shí)加入非常有用，用于快速除去不期望的酶，如蛋白酶、肽酶和核酸酶，例如 胰蛋白酶、糜蛋白酶、DNase和RNase。所述分離介質(zhì)可用于層析模式或分批模式?？?使用任何柱或分批形式。對(duì)于某些應(yīng)用，例如對(duì)于臨床I期和II期研究的生物藥物的純 化，在RTP (準(zhǔn)備加工)形式中優(yōu)選一次性柱。在一個(gè)備用實(shí)施方案中，被吸附的低分子量例如低于60000D的分子可為期望 的分子，例如生物標(biāo)記或藥物標(biāo)記，例如通過降低洗脫液的極性，將其從核心實(shí)體中洗 脫，并進(jìn)一步分析。另一個(gè)實(shí)例為將目標(biāo)分子吸附在核心實(shí)體中，但不用于進(jìn)一步分 析，例如用于脂類去除。當(dāng)所述目標(biāo)分子為大分子/有機(jī)體/顆粒時(shí)，例如細(xì)胞、細(xì)胞顆粒、細(xì)菌、病 毒、病毒樣顆粒、質(zhì)粒、抗體、蛋白質(zhì)，目標(biāo)分子可在流通物中得到，因此，不被介質(zhì) 吸附?；蛘撸瞿繕?biāo)分子為大分子/有機(jī)體/顆粒，例如細(xì)胞、細(xì)胞顆粒、細(xì)菌、病 毒、病毒樣顆粒、質(zhì)粒、抗體、蛋白質(zhì)，它們被吸附在蓋上。所述目標(biāo)分子隨后通過適 于所選吸收模式(例如離子交換鹽和/或pH梯度，IMAC:咪唑梯度，硼酸鹽糖或 pH梯度，HIC:降低鹽濃度)的技術(shù)來洗脫。
本發(fā)明的分離介質(zhì)的優(yōu)選用途為純化單克隆抗體。另一個(gè)優(yōu)選用途為其中所述 目標(biāo)分子為小于1000kD的分子或顆粒。該實(shí)施方案適用于純化病毒，例如流感病毒，但 是也適用于其他大分子，例如IgM抗體。附圖概述

圖1說明經(jīng)測(cè)試的三種不同的珠設(shè)計(jì)。1A 瓊脂糖20 Fast Flow (20 %瓊脂糖顆 粒)和旋轉(zhuǎn)式圓盤，IB :蓋-葡聚糖瓊脂糖6 Fast Flow。IgG =單克隆抗體；P =分子 量小于約70000的蛋白質(zhì)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種層析介質(zhì)，該層析介質(zhì)在基質(zhì)中具有親水性和疏水性區(qū)域兩 者，并且可基于本身為疏水性的基質(zhì)，或者基于含有疏水性配體的親水性基質(zhì)，并且提 供有親水性外層。所述介質(zhì)還可基于被疏水性配體(例如珠中的疏水性內(nèi)核)內(nèi)部官能 化的親水性基質(zhì)。合成路徑的實(shí)例 本身疏水性原料，例如覆蓋有親水性和多孔性層的DVB珠。 本身親水性原料，其被疏水性官能團(tuán)完全官能化，并且隨后覆蓋有親水性和 多孔性層。將親水性基質(zhì)層活化并與疏水性配體內(nèi)部偶聯(lián)(圖1)。 將疏水性基質(zhì)層活化，并且使外部親水性官能化。本發(fā)明還提供了一種從液體的其他組分中分離大分子量分子例如抗體的方法， 比起現(xiàn)有技術(shù)的方法，所述方法需要較少的時(shí)間和加工步驟。這通過以下方法來實(shí)現(xiàn)， 其中使包含所需高分子量分子(例如抗體)的液體與層析介質(zhì)接觸，并且在非結(jié)合模式或 可逆結(jié)合模式中回收基本上純的高分子量分子。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于即使在非常低的離子強(qiáng) 度下，低分子量分子例如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)也被吸附于介質(zhì)的內(nèi)部。層析介質(zhì)的載體基質(zhì)和核心實(shí)體可基于有機(jī)材料或無機(jī)材料。優(yōu)選為有機(jī)聚合 物形式，其不溶于水，但是在水中或多或少可溶脹。合適的聚合物為多羥基聚合物，例 如基于多糖，如瓊脂糖、葡聚糖、纖維素、淀粉、支鏈淀粉，等等；和完全合成的聚合 物，如聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚(羥烷基乙烯基醚)、聚(羥烷基丙烯酸酯)和 聚甲基丙烯酸酯(例如聚縮水甘油甲基丙烯酸酯)；聚乙烯醇和基于苯乙烯和二乙烯基苯 的聚合物；以及其中包括兩種或更多種相應(yīng)于上述聚合物的單體的共聚物。例如通過交 聯(lián)和通過吸附或共價(jià)結(jié)合與不溶性物體偶聯(lián)，可使可溶于水中的聚合物衍生化為不溶性 的。通過具有可轉(zhuǎn)化為OH的基團(tuán)的單體的接枝聚合，或例如通過結(jié)合或吸附合適的化 合物(例如親水性聚合物和其他親水性化合物)使最終的聚合物親水化，可將親水性基團(tuán) 引入到疏水性聚合物(例如單乙烯基苯和二乙烯基苯的共聚物)上?？墒褂冒ōh(huán)氧化 物或反應(yīng)性鹵化物的反應(yīng)?？捎糜谳d體基質(zhì)的合適的無機(jī)材料為二氧化硅、玻璃、氧化鋯、石墨、氧化
鉭，等等。優(yōu)選的載體基質(zhì)不含對(duì)水解不穩(wěn)定的基團(tuán)，例如硅烷醇、酯、酰胺基以及因此 存在于二氧化硅中的基團(tuán)。在本發(fā)明的一個(gè)特別感興趣的實(shí)施方案中，載體基質(zhì)為不規(guī)則或球形顆粒形 式，對(duì)于高性能應(yīng)用，其尺寸范圍為1-1000 iim，優(yōu)選5-50iim，對(duì)于制備目的，其尺寸范圍為50-300 iim。載體基質(zhì)的一種感興趣的形式具有高于或低于液體樣品或待使用的緩沖液溶液 (例如發(fā)酵物料)的密度。這種基質(zhì)特別適用于用于流化床或膨脹床層析法以及不同的 分批法(例如在攪拌的罐中)的大規(guī)模操作。流化床和膨脹床法描述于WO 92/18237和 WO 92/00799。這些基質(zhì)最實(shí)用的用途為將密度比流化液體的密度高的顆粒/珠與上向 流組合。在樣品溶液包含顆粒和粘性材料的情況下，這種采用膨脹床模式的載體基質(zhì)特 別有益。術(shù)語“親水性載體基質(zhì)”在實(shí)踐中是指基質(zhì)可接近的表面為親水性的且對(duì)蛋白 質(zhì)友好，即，該表面不會(huì)不可逆的吸附蛋白質(zhì)和使蛋白質(zhì)變性。通常在親水性基礎(chǔ)基質(zhì) 上的可接近的表面暴露多個(gè)極性基團(tuán)，例如包含氧和/或氮原子的基團(tuán)。這種極性基團(tuán) 的實(shí)例為羥基、氨基、羧基、磺酸酯(S和SP配體)、低級(jí)烷基的醚(例如(-CH2CH2O-) nH,其中n為2、3、4和更大的整數(shù))。親水性表面涂層(可能為親水性增量劑形式)在概念上屬于載體基質(zhì)。在普通的/公認(rèn)的HIC介質(zhì)中，需要通過向流動(dòng)相中加入鹽以提高極性來實(shí)現(xiàn) 蛋白質(zhì)的結(jié)合。隨后通過降低鹽的濃度，從基質(zhì)中釋放已結(jié)合的蛋白質(zhì)。因此，該方法 的缺點(diǎn)在于需要向原料中加入鹽，因?yàn)檫@樣可能引起問題，并因此增加大規(guī)模使用者的 成本。通常在鹽濃度為0.75-4M之間將蛋白質(zhì)吸附至普通HIC-介質(zhì)(Jansson，J._C.和 Ryden, L., Protein Purification-Principles, High Resolution Methods and Applications (蛋白 質(zhì)純化一原理、高分辨率方法及應(yīng)用)，VCH，Weinheim,第220-221頁)。本發(fā)明涉及一種介質(zhì)，該介質(zhì)在MAb純化過程中，使得與小足以滲透至分離基 質(zhì)的疏水性核中的分子(例如HCP)的相互作用最大，并且與樣品中的最大的蛋白質(zhì)(例 如MAb-分子和MAb-二聚體)的相互作用最小。此外，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案能夠使 用不額外加入鹽的流動(dòng)相，并且對(duì)于含有中性或幾乎中性蓋(非結(jié)合蓋)的實(shí)施方案，無 需洗脫緩沖液(解吸緩沖液)來回收期望的高分子量分子或有機(jī)體。測(cè)試了針對(duì)宿主細(xì) 胞蛋白質(zhì)而不是大的單克隆抗體捕獲的珠設(shè)計(jì)的三種不同的方法。在一種方法中，設(shè)計(jì) 基于高含量瓊脂糖(20%)的瓊脂糖珠來得到一種珠，該珠具有排除大蛋白質(zhì)(單克隆抗 體)的孔隙率(圖1A)。在再一種方法中，生產(chǎn)基于瓊脂糖6 Fast Flow和凝膠過濾蓋的原 型。通過使葡聚糖與珠的外區(qū)段偶聯(lián)得到蓋。設(shè)計(jì)在葡聚糖填充的區(qū)段中得到的孔徑， 以防止大分子例如mAb進(jìn)入珠的核中(圖1B)。第三種方法基于旋轉(zhuǎn)式圓盤介質(zhì)，該介 質(zhì)描述于共同待審的SE專利申請(qǐng)0800263-6。在這種情況下，還設(shè)計(jì)通過引入中性外區(qū) 段來排除大蛋白質(zhì)的珠(圖1A)，所述中性外區(qū)段通過由共同擁有的層活化專利EP 0966 488 B1 (Process for introducing a functionality (引入官能團(tuán)的方法))所描述的方法獲得。在疏水性配體與不同的原型連接的過程中，使用一種合成方法來防止配體與珠 的表面偶聯(lián)，并且，采用這種方式，由于單克隆抗體與珠外部的疏水性相互作用而消除 吸附。命名為蓋-OH核-辛基介質(zhì)的原型是指辛基配體僅在珠的核中連接。此外，調(diào) 節(jié)珠的核中配體的量，使用具有非常低離子強(qiáng)度的吸附緩沖液，使得宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)被 吸附，將離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)至與生物分子的層析法相關(guān)的任何pH值。實(shí)驗(yàn)部分本文提供的這些實(shí)施例僅用于舉例說明的目的，不應(yīng)看做是限制由所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明。實(shí)施例1 基于瓊脂糖20 Fast Flow (A)、瓊脂糖6 Fast Flow (B)和旋轉(zhuǎn)式圓盤介
質(zhì)(C)的辛基介質(zhì)的制備基質(zhì)的體積是指澄清床體積，基質(zhì)的重量是指抽吸干重，并用克給出。對(duì)于 大規(guī)模反應(yīng)，由于使用磁力棒攪拌器促使破壞珠，因此攪拌是指懸浮的馬達(dá)驅(qū)動(dòng)的攪拌 器。在封閉的小瓶中進(jìn)行小規(guī)模反應(yīng)(最高達(dá)20ml凝膠)，并且攪拌是指使用振蕩工作臺(tái)。使用常規(guī)方法來分析官能團(tuán)和確定烯丙基化、環(huán)氧化的程度、或者離子交換劑 基團(tuán)在珠上的取代程度。A蓋-OH核-辛基瓊脂糖20 Fast Flow的制備A1 瓊脂糖 20 Fast Flow 的制備通過于95°C下加熱約10小時(shí)，將瓊脂糖(50g)溶解于水(250g)中。在乳化容 器中，將該溶液加入到甲苯(375ml)和乙基纖維素(35g)中，溫度保持在70°C。該乳化 容器配備有漿式攪拌器。將攪拌器的速度從150rpm逐步增至340rpm，溫度保持在70°C。 當(dāng)通過顯微鏡判斷瓊脂糖顆粒具有所需尺寸時(shí)，將速度降至150rpm。隨后將乳液冷卻， 讓珠形成凝膠。用乙醇和水洗滌珠。將水加入到250ml珠中，至總重量為310g。 向該懸浮液中加入38g Na2S04、 3.0ml50%Na()H*0.25gNaBH4，將溫度升至47°C。隨后在6小時(shí)期間，用泵加入表氯 醇(31.4ml)和氫氧化鈉溶液(21.6ml)。加入完成后，于47°C下繼續(xù)反應(yīng)過夜。隨后將 漿料冷卻，并使用60%乙酸中和至pH為5-6。最后，在玻璃濾器上用蒸餾水仔細(xì)洗滌凝 膠。隨后將珠在43 ii m和166 u m布上篩分。A2 OH-蓋烯丙基瓊脂糖20 Fast Flow的制備烯丙基活化的瓊脂糖20 Fast Flow。將50g浙干的瓊脂糖20 Fast Flow (Sepharose 6 Fast Flow, GE Healthcare, Uppsala, Sweden)與 15ml 50 % NaOH 溶液、6g Na2S04 和 O.lg NaBH4混合。將混合物于50°C下攪拌1小時(shí)，接著加入30ml烯丙基縮水甘油基醚 (AGE)。將反應(yīng)漿料于50°C下攪拌17小時(shí)。隨后在玻璃濾器上用蒸餾水、乙醇洗滌凝 膠，最后再次用蒸餾水洗滌。部分溴化和NaOH處理(OH-蓋的制備)。將10ml浙干的烯丙基化的瓊脂糖20 Fast Flow在5ml蒸餾水和0.4g乙酸鈉中攪拌。加入在加蓋的小瓶中用10ml蒸餾水溶解的 125iU溴，并繼續(xù)攪拌5分鐘。水洗后，將浙干的凝膠與7.5ml 2M NaOH—起于50°C下 攪拌18小時(shí)，接著水洗。通過滴定測(cè)得在珠的核中剩余的烯丙基含量為0.37mmol/ml。A3 核偶聯(lián)在珠的核中辛基的偶聯(lián)。將4.5ml OH-蓋瓊脂糖20 Fast Flow (見上述)完全溴 化并洗滌。將浙干的凝膠與1.25ml辛硫醇在4.5ml 2MNaOH和1ml乙醇中的溶液混合， 接著于50°C下攪拌16小時(shí)。用水、乙醇和水洗滌后，將凝膠儲(chǔ)存在20%乙醇中。B 蓋-葡聚糖核-辛基瓊脂糖6 Fast Flow的制備B1 蓋-葡聚糖烯丙基瓊脂糖6 Fast Flow的制備瓊脂糖6 Fast Flow的烯丙基化。根據(jù)以上所述將瓊脂糖6 Fast Flow烯丙基化，
通過滴定測(cè)得烯丙基含量為259 u mol/ml。
部分溴化。將烯丙基化的瓊脂糖6 Fast Flow (100ml)在燒瓶中稱重，加入900ml 蒸餾水和1.3g硫酸鈉。隨后在劇烈攪拌下，用移液管加入0.3當(dāng)量溴(400 iU)。約5分 鐘(此時(shí)溴已消耗完)后，在玻璃濾器上用蒸餾水洗滌凝膠。葡聚糖偶聯(lián)。將51ml部分溴化的凝膠轉(zhuǎn)移至燒瓶，加入30g葡聚糖AB在125ml 蒸餾水中的溶液。攪拌30分鐘后，加入lOgNaOH和0.5gNaBH4，將漿料加熱至50°C， 并攪拌過夜。約18小時(shí)后，使用乙酸(60%溶液)將pH調(diào)節(jié)至約7。隨后在玻璃濾器 上用蒸餾水洗滌凝膠。B2 核偶聯(lián)在珠的核中辛基的偶聯(lián)。將10ml浙干的凝膠(與瓊脂糖6 FastFlow偶聯(lián)的葡聚 糖，見上述)與蒸餾水一起放在燒杯中，并開始劇烈頂置式攪拌。加入溴，直至漿料剩 余深橙色/黃色。攪拌10分鐘后，加入甲酸鈉(約1.5g)，直至漿料完全褪色。隨后在 玻璃濾器上用蒸餾水洗滌凝膠。將浙干的溴化的凝膠在燒瓶中稱重，并加入10ml蒸餾 水和2.3ml辛硫醇。隨后使用NaOH (50 %溶液)將pH調(diào)節(jié)至約12.5。隨后將混合物于 50°C下攪拌過夜。20小時(shí)后，用蒸餾水和乙醇洗滌凝膠。C - -OH -絲臓麵靜馳艦C1 旋轉(zhuǎn)式圓盤介質(zhì)的制備6%瓊脂糖溶液用作原料。研究溫度、冷卻速率、粘度、速度和瓊脂糖流速(至 圓盤)相對(duì)于孔隙率的響應(yīng)。旋轉(zhuǎn)式圓盤裝置由ABB Industriservice根據(jù)給定的說明書制造(見下面)鋼品質(zhì)SS 2343-02 (對(duì)于所有指定的項(xiàng)目)聚合物材料PTFE，聚碳酸酯(拱頂保護(hù))，EPDM (乙烯丙烯二烯單體)，硅橡膠。拱頂高度900mm捕獲盆直徑2400mm，包括排水通道捕獲盆斜率3°圓盤數(shù)量6圓盤直徑200mm一般圓盤厚度最大5.2mm邊緣處的圓盤厚度12.4mm，包括135°斜率上部壓力補(bǔ)償室直徑(對(duì)于液體瓊脂糖溶液):73mm上部壓力補(bǔ)償室高度6mm分布針數(shù)量6針的內(nèi)徑0.7mm通過針將瓊脂糖溶液加入到6個(gè)圓盤中。通過使用6個(gè)圓盤而不是1個(gè)圓盤， 增加了容量。對(duì)于6個(gè)圓盤中的每一個(gè)，瓊脂糖流量均相同。這意味著源自每個(gè)圓盤 的珠尺寸均相同。將圓盤的速度范圍調(diào)節(jié)在3001-3010rpm內(nèi)，且拱頂內(nèi)的相對(duì)濕度為 100%。如果相對(duì)濕度小于100%，則存在水從瓊脂糖液滴中蒸發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。使用調(diào)節(jié)至69.7°C且粘度在397_421mPa內(nèi)的烯丙基化的6%瓊脂糖溶液加入到 旋轉(zhuǎn)式圓盤。將瓊脂糖溶液至圓盤的流速調(diào)節(jié)至170ml/分鐘。捕獲水溫度為20.1°C。
與表氯醇交聯(lián)后，旋轉(zhuǎn)式圓盤珠的孔隙率呈現(xiàn)于表1。使用不同的葡聚糖來估測(cè) 孔隙率，并且使用藍(lán)色葡聚糖2000得到空隙體積。生產(chǎn)旋轉(zhuǎn)式圓盤原型，以得到不允許 免疫球蛋白滲透珠的孔隙率。這意味著分子量大于約150000g/mol的分子應(yīng)該不能擴(kuò)散 至珠中。表1.用于旋轉(zhuǎn)式圓盤原型的五種不同的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的Kav_值
權(quán)利要求
1.分離介質(zhì)，所述分離介質(zhì)包含多孔性疏水性核心實(shí)體；和覆蓋所述核心實(shí)體的整 個(gè)外部的多孔性親水性蓋，其中所述蓋僅允許低于一定尺寸的分子滲透分離介質(zhì)的核心 實(shí)體的內(nèi)部并與之相互作用。
2.權(quán)利要求1的分離介質(zhì)，其中所述疏水性核心實(shí)體僅允許低于一定尺寸的分子滲透 分離介質(zhì)的核心實(shí)體的內(nèi)部并與之相互作用。
3.權(quán)利要求1或2的分離介質(zhì)，其中所述疏水性核心實(shí)體本身為疏水性的且基于疏水 性聚合物。
4.權(quán)利要求1或2的分離介質(zhì)，其中所述疏水性核心實(shí)體本身為親水性的且基于被疏 水性相互作用配體官能化的親水性聚合物。
5.權(quán)利要求4的分離介質(zhì)，其中所述疏水性相互作用配體包含脂族或芳族烴。
6.上述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)的分離介質(zhì)，其中在O-IM的低離子強(qiáng)度下、在2-11 的pH間隔內(nèi)，所述疏水性核心實(shí)體允許吸附低分子量分子和/或小尺寸分子。
7.權(quán)利要求4或5的分離介質(zhì)，其中所述核心實(shí)體除了所述疏水性配體以外還包含其 他配體，所述其他配體可位于所述核心實(shí)體上和/或與所述核心實(shí)體相關(guān)和/或位于所述 疏水性配體上。
8.權(quán)利要求7的分離介質(zhì)，其中所述其他配體為靜電相互作用配體。
9.上述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)的分離介質(zhì)，其中所述核心實(shí)體的孔徑防止超過一定 尺寸的分子進(jìn)入所述孔。
10.上述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)的分離介質(zhì)，其中所述親水性蓋包含與樣品內(nèi)的分子 可逆結(jié)合的配體。
11.上述權(quán)利要求4-10中一項(xiàng)或多項(xiàng)的分離介質(zhì)，其中所述核心實(shí)體和蓋由瓊脂糖制 成，并且所述疏水性配體為C4-C16配體。
12.上述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)的分離介質(zhì)，其中在蓋中提供水凝膠以填充所述孔， 從而進(jìn)一步降低和調(diào)節(jié)孔徑，以防止高分子量分子進(jìn)入所述孔。
13.上述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)的分離介質(zhì)，其中將磁性顆粒摻入到所述核心實(shí)體中。
14.上述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)的分離介質(zhì)，其中所述蓋和/或核心實(shí)體通過層活化 官能化。
15.上述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)的分離介質(zhì)，所述分離介質(zhì)與層析介質(zhì)混合，其中所 述分離介質(zhì)占總介質(zhì)體積最高達(dá)10%。
16.權(quán)利要求15的分離介質(zhì)，其中所述分離介質(zhì)包含辛基配體，并且所述層析介質(zhì)為 陽離子交換介質(zhì)。
17.上述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)的分離介質(zhì)用于在超過或等于OM的低離子強(qiáng)度下、 在pH為2-11，從樣品中吸附低于一定尺寸的分子的用途。
18.權(quán)利要求17的用途，其中所述一定尺寸相應(yīng)于由選自以下的分子/有機(jī)體/顆粒 表示的尺寸范圍細(xì)胞、細(xì)胞顆粒、細(xì)菌、病毒、病毒樣顆粒、質(zhì)粒、抗體、脂類、蛋 白質(zhì)、肽或核酸。
19.權(quán)利要求17或18的用途，其中所述目標(biāo)分子為小于60000D的小分子或顆粒。
20.權(quán)利要求17或18的用途，其中所述目標(biāo)分子為小于IOOOkD的分子或顆粒。
21.權(quán)利要求17-20中一項(xiàng)或多項(xiàng)的用途，其中所述目標(biāo)分子為大分子/有機(jī)體/顆 粒，例如細(xì)胞、細(xì)胞顆粒、細(xì)菌、病毒、病毒樣顆粒、質(zhì)粒、抗體、蛋白質(zhì)，它們不被 吸附在分離介質(zhì)上而是在流通物中得到。
22.權(quán)利要求17-21中一項(xiàng)或多項(xiàng)的用途，其中所述目標(biāo)分子為大分子/有機(jī)體/顆 粒，例如細(xì)胞、細(xì)胞顆粒、細(xì)菌、病毒、病毒樣顆粒、質(zhì)粒、抗體、蛋白質(zhì)，它們被吸 附在蓋上。
全文摘要
本發(fā)明涉及層析法領(lǐng)域。更精確地，本發(fā)明涉及一種新型層析介質(zhì)，即，一種提供有不同的蓋的疏水性介質(zhì)，由于疏水性介質(zhì)的孔隙率和/或蓋的孔隙率，排除超過一定尺寸的分子。本發(fā)明還涉及使用所述分離介質(zhì)來純化不進(jìn)入分離介質(zhì)的大分子以及進(jìn)入分離介質(zhì)并從中洗脫的小分子。
文檔編號(hào)B01D15/34GK102015094SQ200980114972
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月22日
發(fā)明者B-L·約翰遜, G·格拉德, J·伯格斯特倫, J-L·馬洛伊塞爾, N·諾爾曼, T·E·塞德曼 申請(qǐng)人:通用電氣健康護(hù)理生物科學(xué)股份公司