一種惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡(jiǎn)系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡(jiǎn)系統(tǒng)，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明的惡臭假單胞菌基因敲除系統(tǒng)和基因組精簡(jiǎn)系統(tǒng)巧妙結(jié)合了自殺質(zhì)粒敲除系統(tǒng)和位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，大大提高了二輪篩選正確率，高達(dá)90％以上，在用于長(zhǎng)達(dá)69個(gè)基因的基因簇的敲除時(shí)仍然表現(xiàn)出90％以上正確率。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)基因簇的連續(xù)敲除，操作簡(jiǎn)便，高效，正確率高，成本低。本發(fā)明為精簡(jiǎn)優(yōu)化惡臭假單胞菌基因組奠定了分子基礎(chǔ)，有利于實(shí)現(xiàn)合成生物學(xué)底盤細(xì)胞的高效構(gòu)建。
【專利說(shuō)明】
一種惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡(jiǎn)系統(tǒng)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡(jiǎn)系統(tǒng)，特別是一種基于同源 重組與特異位點(diǎn)重組相結(jié)合的敲除系統(tǒng)，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡臭假單胞菌是一類革蘭氏陰性菌，主要應(yīng)用于生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯(PHA)，即廣 泛用于生物塑料及高附加值等醫(yī)學(xué)材料的生產(chǎn)。為了改善菌株本身生產(chǎn)特性，除了常規(guī)的 代謝工程改造外，優(yōu)化其基因組勢(shì)在必行。從合成生物學(xué)角度出發(fā)，精簡(jiǎn)優(yōu)化該菌株的基因 組是優(yōu)化其作為生產(chǎn)底盤細(xì)胞的重要手段，因此構(gòu)建一套高效、快捷、準(zhǔn)確地基因簇連續(xù)敲 除系統(tǒng)顯得尤為重要。
[0003] 隨著惡臭假單胞菌生理學(xué)，生物化學(xué)和遺傳學(xué)知識(shí)的積累，及惡臭假單胞菌全基 因組的測(cè)序，基因工程手段在精簡(jiǎn)優(yōu)化其基因組中地位越來(lái)越重要，也為構(gòu)建優(yōu)良的惡臭 假單胞菌底盤細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。從合成生物學(xué)角度出發(fā)，大范圍連續(xù)地敲除其基因組上的 非必需基因簇序列是必經(jīng)之路，而利用現(xiàn)有的惡臭假單胞菌的傳統(tǒng)基因敲除方法就顯得力 不從心。目前應(yīng)用廣泛的惡臭假單胞菌敲除載體為pKISmobsacB，傳統(tǒng)的敲除質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程 中，同源臂連接到一起，進(jìn)行二輪篩選，但其由于第二輪交換回復(fù)為野生型的概率非常大， 為敲除篩選帶來(lái)很大麻煩，正確率很低，并且二輪篩選只能通過(guò)PCR驗(yàn)證，造成很高的經(jīng)濟(jì) 成本。這種傳統(tǒng)的自殺質(zhì)粒敲除方法不適用于惡臭假單胞菌的基因組精簡(jiǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡(jiǎn)系統(tǒng)及其構(gòu)建方法，通過(guò) 此敲除系統(tǒng)1)成功敲除惡臭假單胞菌KT2442基因 PP5288; 2)完成惡臭假單胞菌KT2442中基 因簇 PP3126-PP3142、PP1277-PP1290 和 PP4329-PP4397 的連續(xù)敲除。
[0005] 本發(fā)明構(gòu)建的敲除系統(tǒng)包括：1)核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的模板質(zhì)粒 PWJW101，用于擴(kuò)增兩端帶有變異loxL/R位點(diǎn)的Gm抗性片段，作為二輪篩選的抗性標(biāo)記;2) 核苷酸序列分別如SEQ ID N0.2、SEQ ID勵(lì).3所示的表達(dá)質(zhì)粒?1，102、？1，103，用于位點(diǎn) 特異性重組，其中，表達(dá)質(zhì)粒PWJW102攜帶編碼Cre重組酶和蔗糖果聚糖酶SacB的基因 ，Kan 抗性;表達(dá)質(zhì)粒PWJW103攜帶編碼Cre重組酶和蔗糖果聚糖酶SacB的基因，Gm抗性;表達(dá)質(zhì)粒 PWJW102和pWJW103都是組成型表達(dá)Cre酶，強(qiáng)啟動(dòng)子PlacM用于SacB表達(dá)，用于蔗糖平板篩 選培養(yǎng)來(lái)丟失質(zhì)粒。
[0006] 所述模版質(zhì)粒pWJWl 01的構(gòu)建方法包括以下步驟：
[0007] 第一步：以PBBR1MCS-5為模板，PCR擴(kuò)增得到gm基因，并在其兩端均引入Smal酶切 位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)酶切純化后，備用；以PDTW202質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增得到含有l(wèi)oxL/R位點(diǎn)的線性 pBSloxL/R質(zhì)粒片段，并在兩端均引入Sma頂每切位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)酶切純化后，備用；
[0008] 第二步:將已經(jīng)處理好的gm片段和pBSloxL/R質(zhì)粒片段連接，得到PWJW101。
[0009] 所述表達(dá)質(zhì)粒pWJWl 02、pWJWl 03的構(gòu)建方法包括以下步驟：
[0010] 第一步：以PSH47為模板，以相應(yīng)引物擴(kuò)增重組酶Cre可移閱讀框，并在擴(kuò)增片段的 5'和3'末端引入EcoRI和Xbal酶切位點(diǎn)，Cre片段經(jīng)過(guò)EcoRI和Xbal酶切純化后備用；以質(zhì)粒 pDXW-3為模板，以相應(yīng)引物擴(kuò)增帶有強(qiáng)啟動(dòng)子的PlacM-sacB片段，片段5'和3'末端分別引 入Xbal和SacI限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，酶切純化后備用；
[0011] 第二步：酶切純化的片段Cre和PlacM-sacB與經(jīng)過(guò)EcoRI和Xba頂每切純化的質(zhì)粒 pBBRlMCS-2 連接，得到 pWJW102;
[0012] 第三步：酶切純化的片段Cre和PlacM-sacB與經(jīng)過(guò)EcoRI和Xba頂每切純化的質(zhì)粒 pBBRlMCS-5 連接，得到 pWJW103。
[0013]本發(fā)明還提供一種應(yīng)用上述敲除系統(tǒng)敲除惡臭假單胞菌KT2442的基因或基因簇 的方法，如附圖4和附圖5所示，分別以惡臭假單胞菌自殺質(zhì)粒為例進(jìn)行說(shuō)明。兩者所闡述的 基因敲除和基因簇敲除方法包括以下步驟：
[0014] 1)敲除質(zhì)粒的構(gòu)建，根據(jù)需要敲除的基因或基因簇的序列設(shè)計(jì)其同源臂，長(zhǎng)度一 般為lOOObp左右，將同源臂擴(kuò)增后酶切回收，同時(shí)擴(kuò)增帶有l(wèi)oxL/R的抗性標(biāo)記基因，將上游 同源臂，抗性標(biāo)記基因，下游同源臂依次連接于惡臭假單胞菌自殺質(zhì)粒上，構(gòu)成敲除質(zhì)粒；
[0015] 2)敲除質(zhì)粒的第一輪交換，制備惡臭假單胞菌感受態(tài)，將1)中敲除質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入感 受態(tài)中，復(fù)蘇涂布后，對(duì)長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行蔗糖抗性篩選，有蔗糖致死的為一輪交換正確轉(zhuǎn) 化子；
[0016] 3)敲除第二輪交換，將一輪交換正確轉(zhuǎn)化子挑入Kan抗性LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，再 轉(zhuǎn)接無(wú)抗LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12h，即可稀釋100倍涂布具有同源臂中間連接的抗性標(biāo)記的抗性的 蔗糖平板，培養(yǎng)20h;對(duì)長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行抗性驗(yàn)證，即無(wú)出發(fā)自殺質(zhì)粒自身抗性的轉(zhuǎn)化子 為第二輪敲除正確轉(zhuǎn)化子，并進(jìn)一步通過(guò)PCR驗(yàn)證確定1-2個(gè)轉(zhuǎn)化子即可；
[0017] 4)去除抗性標(biāo)記，將第二輪敲除正確轉(zhuǎn)化子制備成電轉(zhuǎn)感受態(tài)，電轉(zhuǎn)入表達(dá)質(zhì)粒 PWJW102或pWJW103，在表達(dá)質(zhì)粒相應(yīng)的抗性平板培養(yǎng)20h，對(duì)長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行抗性驗(yàn)證， 無(wú)二輪交換抗性的單菌落為正確轉(zhuǎn)化子，并進(jìn)一步通過(guò)PCR驗(yàn)證確定1-2個(gè)轉(zhuǎn)化子即可；
[0018] 5)表達(dá)質(zhì)粒的去除，將抗性標(biāo)記去除成功的菌落挑入LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，稀釋 100倍涂布于含有15g/100mL的蔗糖平板上培養(yǎng)20h，對(duì)所長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行抗性驗(yàn)證，無(wú) 表達(dá)質(zhì)粒抗性的單菌落為最終正確突變株，進(jìn)一步PCR驗(yàn)證確定1-2個(gè)轉(zhuǎn)化子即可。
[0019] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述自殺質(zhì)粒可以是pK18mobsacB或pZJD29c。
[0020] 本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是應(yīng)用所構(gòu)建的基因敲除系統(tǒng)和基因組精簡(jiǎn) 系統(tǒng) 1)敲除 KT2442 中 PP5288; 2)KT2442 的基因簇 PP3126-PP3142，PP1277-PP1290 和 PP4329-PP4397的連續(xù)敲除，即KT2442的基因組精簡(jiǎn)。利用pWJWlOl和pK18mobsacB構(gòu)建了PP5288的 敲除載體PWJW201，敲除了 KT2442中的PP5288;利用pDTW202和？2邛29(：分別構(gòu)建了基因簇 PP3126-PP3142、PP1277-PP1290 和 PP4329-PP4397 的敲除載體 pWJW202、pWJW203 和 pWJW204， 敲除了〇2442中的基因簇？？3126-??3142、？？1277-??1290和？？4329-??4397;獲得菌株 KT2442 Δ PP5288 和 KT2442 ΔΡΡ3126-ΡΡ3142;并完成 KT2442 中基因簇 PP3126-PP3142、 PP1277-PP1290和PP4329-PP4397的連續(xù)敲除，獲得菌株KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-ΡΡ1290ΔΡΡ4329-ΡΡ4397。
[0021] 本發(fā)明很好地解決了傳統(tǒng)敲除方法的弊端，首先構(gòu)建了一種基于自殺質(zhì)粒同源重 組與特異位點(diǎn)重組相結(jié)合的敲除系統(tǒng)。自殺質(zhì)粒同源重組主要是依賴于敲除質(zhì)粒與目標(biāo)基 因組存在一定相同的同源DNA序列，經(jīng)過(guò)同源區(qū)的配對(duì)產(chǎn)生一輪交換，完成敲除質(zhì)粒重組到 基因組的過(guò)程;再經(jīng)過(guò)二輪篩選，不僅用蔗糖復(fù)篩，同時(shí)用同源臂中間引入的抗性篩選來(lái)獲 得正確敲除突變株，避免了傳統(tǒng)的二輪交換中回復(fù)野生的重組，大大提高了正確突變的概 率。通過(guò)自殺質(zhì)粒同源重組，我們?cè)诳剐詷?biāo)記兩側(cè)引入loxL/R位點(diǎn)，利用Cre/lox特異重組 系統(tǒng)去除抗性標(biāo)記。
[0022]用于惡臭假單胞菌傳統(tǒng)的敲除方法在第二輪交換中回復(fù)野生概率極大，突變株篩 選正確率很低，且只能通過(guò)PCR驗(yàn)證突變基因型。本發(fā)明構(gòu)建的敲除系統(tǒng)同時(shí)利用自殺質(zhì)粒 同源重組及帶有變異loxL/R位點(diǎn)的位點(diǎn)特異性重組，結(jié)合兩者優(yōu)勢(shì)克服傳統(tǒng)自殺質(zhì)粒敲除 系統(tǒng)的缺陷，可用于惡臭假單胞菌的基因敲除和基因組精簡(jiǎn);敲除過(guò)程首先通過(guò)自殺質(zhì)粒 同源重組到基因組上，然后通過(guò)蔗糖負(fù)篩和抗性標(biāo)記篩選出被刪除目的基因的轉(zhuǎn)化子，該 步較傳統(tǒng)方法的正確率大大提高，再通過(guò)位點(diǎn)特異重組去除基因組上抗性基因，操作簡(jiǎn)便 高效;可用于同一菌株中多個(gè)基因簇連續(xù)敲除;敲除完成后被改造菌株不攜帶任何抗性。適 用于有序精簡(jiǎn)惡臭假單胞菌的基因組。本發(fā)明在第二輪交換中尤其體現(xiàn)了很高的篩選優(yōu) 勢(shì)，正確率極高，通過(guò)菌落抗性驗(yàn)證即可初步篩選突變基因型，大大降低了成本。此外，本發(fā) 明敲除系統(tǒng)也可以實(shí)現(xiàn)基因簇的連續(xù)高效敲除，隨著目的基因簇的增長(zhǎng)，其正確率仍然很 高，并維持在90%以上，從而很好地實(shí)現(xiàn)惡臭假單胞菌KT2442的基因組精簡(jiǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1模板質(zhì)粒pWJWlOl的物理圖譜。
[0024] 圖2表達(dá)載體pWJW102和pWJW103的物理圖譜，分別為圖2a和圖2b所示。
[0025]圖 3??5288，？？3126-??3142，？？1277-??1290和？？4329-??4397的敲除質(zhì)粒 pWJW201，pWJW202，pWJW203 和 pWJW204 的物理圖譜，分別為圖 3a，3b，3c 和 3d。
[0026] 圖4以pK18mobsacB為自殺質(zhì)粒的基因敲除過(guò)程示意圖。
[0027]圖5以pZJD29c為自殺質(zhì)粒的基因簇敲除過(guò)程示意圖。
[0028]圖6實(shí)施例2-4中第二輪交換平板抗性驗(yàn)證圖。
[0029] 圖7基因型驗(yàn)證圖；a，實(shí)施例2-5中，采用本發(fā)明基因敲除和基因簇敲除系統(tǒng)的敲 除轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證;圖b，對(duì)照實(shí)施例2中采用pK18mobsacB傳統(tǒng)敲除方法敲除轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 實(shí)施例1模板質(zhì)粒pWJWlOl及表達(dá)質(zhì)粒PWJW102和PWJW103的構(gòu)建
[0031 ] (1)用于擴(kuò)增兩端有同向的loxL/R位點(diǎn)的Gm抗性片段的模板質(zhì)粒pWJWlOl的構(gòu)建： 第一步：以pBBRlMCS-5(Kovach，M.E.et al.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRIMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes .Gene 166，175-176( 1995) ·)為模板，以gm-F/gm-R引物對(duì)作為模板，PCR擴(kuò)增得 到gm基因，并在其兩端均引入Smal酶切位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)酶切純化后，備用；以pDTW202(Hu J， TanY，LiY，Hu X, Xu D,ffang X. Construction and application of an efficient multiple-gene-deletion system in Corynebacterium glutamicum.Plasmid，2013，70 (3):303-313)質(zhì)粒為模板，以？851 〇認(rèn)4和？851〇以-1?引物作為模板，？0財(cái)廣增得到含有 loxL/R位點(diǎn)的線性pBSloxL/R質(zhì)粒片段，并在兩端均引入Smal酶切位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)酶切純化后， 備用。
[0032] 第二步:將已經(jīng)處理好的gm片段和pBSloxL/R質(zhì)粒片段連接，轉(zhuǎn)化JM109,新質(zhì)粒命 名為 PWJW101。
[0033]用于基因或基因簇敲除的gm盒模板擴(kuò)增的引物gm-F/gm-R位于重組位點(diǎn)外側(cè)，擴(kuò) 增產(chǎn)物兩端帶有變異10XL/R位點(diǎn)的Gm抗性片段，稱為gm盒，便于后續(xù)的位點(diǎn)特異重組。 [0034] (2)Cre重組酶和蔗糖果聚糖酶SacB表達(dá)載體pWJW102和pWJW103的構(gòu)建方法，兩質(zhì) 粒分別為Km抗性和Gm抗性，分別用于去除敲除質(zhì)粒二輪交換的Gm抗性標(biāo)記和Km抗性標(biāo)記。 [0035] 表達(dá)載體pWJW102和pWJW103的構(gòu)建步驟如下：
[0036]第一步：以pSH47(Guldener U，Heck S，F(xiàn)ielder T，et al ·A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast.Nucleic Acids Res，1996， 24( 13) :2519-2524)為模板，以引物cre-F/cre-R擴(kuò)增重組酶Cre可移閱讀框，并在擴(kuò)增片段 的5'和3'末端引入EcoRI和Xbal酶切位點(diǎn)，Cre片段經(jīng)過(guò)EcoRI和Xbal酶切純化后備用；以質(zhì) |ipDXff-3(Tan Y,Xu D,LiY,ffang X.Construction of a novel sacB-based system for marker-free gene deletion in Corynebacterium glutamicum.Plasmid,2012,67(1): 44-52)為模板，以PlacM-sacB-F/sacB-R擴(kuò)增帶有強(qiáng)啟動(dòng)子的PlacM-sacB片段，片段5'和3' 末端分別引入Xbal和SacI限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，酶切純化后備用。
[0037] 第二步：酶切純化的片段Cre和PlacM-sacB與經(jīng)過(guò)EcoRI和Xba頂每切純化的質(zhì)粒 pBBRlMCS-2(Kovach,Μ.E.et al.Four new derivatives ofthe broad-host-range cloning vector pBBRIMCS,carrying different antibiotic-resistance cassettes.Gene 166,175-176(1995) ·)連接，轉(zhuǎn)化JM109,新質(zhì)粒定名為pWJW102〇
[0038] 第三步：酶切純化的片段Cre和PlacM-sacB與經(jīng)過(guò)EcoRI和Xba頂每切純化的質(zhì)粒 pBBRlMCS-5連接，轉(zhuǎn)化JM109,新質(zhì)粒定名為pWJW103。
[0039] Cre/lox重組系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)于P1噬菌體，包括重組酶和重組位點(diǎn)兩部分，其中，Cre是隸 屬于AInt酶超基因家族的重組酶，可以接到重組位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組；loxp位 點(diǎn)是可供Cre重組酶識(shí)別作用的重組位點(diǎn)，當(dāng)兩個(gè)loxp位點(diǎn)位于一條DNA鏈上并且方向相同 時(shí)，Cre重組酶能切除兩個(gè)loxp位點(diǎn)間的序列。loxL/loxR為突變loxp位點(diǎn)，兩個(gè)重組位點(diǎn)經(jīng) 過(guò)Cre酶重組后，產(chǎn)生一個(gè)不能再被Cre重組酶識(shí)別的位點(diǎn)loxL/R，該位點(diǎn)不再參與位點(diǎn)重 組。
[0040] 該實(shí)施例中所需引物序列如下表1所示。
[0041] 表1本實(shí)施例涉及的引物序列
[0042]
[0043] 實(shí)施例2惡臭假單胞菌KT2442中PP5288的敲除 [0044] 1.敲除質(zhì)粒PWJW201的獲得
[0045]以惡臭假單胞菌P.putidaKT2442基因組為模板，分別以相應(yīng)引物擴(kuò)增得到PP5288 基因的上游片段和下游片段。在上游片段的5'和3'末端分別引入EcoRI和Xbal，在下游片段 的5'和3'端分別引入BamHI和Hindm酶切位點(diǎn)。以pWJWlOl作為模板，以引物
[0046] gm-lox-Xbal(+)acctctagaAATACGACTCACTATAGGGCG,
[0047] gm-l〇x-BamHI(-)cgggatccGCGCAATTAACCCTCACTAAAG，
[0048] 擴(kuò)增兩端含有l(wèi)oxL/R位點(diǎn)的gm盒，在5'和3'末端分別引入Xbal和BamHI酶切位點(diǎn)。 將PP5288上游片段經(jīng)過(guò)EcoRI和Xbal酶切純化，下游片段經(jīng)過(guò)BamHI和Hindlll酶切純化，gm 盒片段經(jīng)過(guò)Xbal和BamM酶切純化，pK18mobsacB經(jīng)過(guò)EcoRI和Hindlll酶切純化，四個(gè)片段 連接，轉(zhuǎn)化JM109，新的質(zhì)粒即為PP5288敲除質(zhì)粒，命名為pWJW201 (如附圖2a);自殺質(zhì)粒 pK18mobsacB可用于多種微生物基因的敲除，為Kan抗性，帶有鹿糖果聚糖酶表達(dá)基因 sacB， 可降解蔗糖從而抑制細(xì)胞分裂，可用于蔗糖負(fù)篩選。
[0049] 2.敲除感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)化
[0050] 接種惡臭假單胞菌02442菌于1^液體培養(yǎng)基中，30°(：，200印111過(guò)夜培養(yǎng)。按2%接 種量轉(zhuǎn)接50mL LB液體培養(yǎng)基，30°C，200rpm培養(yǎng)至0D6QQ = 0.7時(shí)，將培養(yǎng)液冰浴半小時(shí)后轉(zhuǎn) 入預(yù)冷的50mL離心管中，4°C，8000rpm離心10min收集菌體，沉淀用預(yù)冷的10%甘油洗滌3 次，最后用〇.5mL 10%甘油懸浮，每管80yL分裝至預(yù)冷的無(wú)菌EP管中。
[0051 ] 將1000_5000ng敲除質(zhì)粒pWJW201加入感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴15min，1.5kv電擊 5ms，30°C，200rpm孵育lh，涂布30yg/mL卡那霉素的LB固體平板，30°C培養(yǎng)20h;
[0052] 3.敲除流程
[0053] (1)一輪交換
[0054]挑取電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化子于含30yg/mL卡那霉素及15g/100mL蔗糖的LB固體上劃線培養(yǎng) 20h，篩選菌周圍有粘液化透明物質(zhì)分泌的轉(zhuǎn)化子，并PCR驗(yàn)證確認(rèn)第一輪交換成功單菌落。 [0055] (2)二輪交換
[0056] 選取驗(yàn)證正確的單菌落，即pWJW201質(zhì)粒通過(guò)同源臂重組與染色體交換使得整個(gè) 質(zhì)粒整合到P. putidaKT2442的染色體上，接種于含30yg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，30 °C培養(yǎng)約12h，轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中，30 °C培養(yǎng)12h，稀釋100倍后涂布于含30yg/mL慶大霉 素和15g/100mL蔗糖的LB固體平板，30°C培養(yǎng)約20h;對(duì)所長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行Km抗性驗(yàn)證，即 劃取50個(gè)單菌落在Km固體平板上培養(yǎng)20h，不生長(zhǎng)的單菌落即為正確敲除轉(zhuǎn)化子，僅有5個(gè) 轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)，正確率達(dá)到90%，抗性驗(yàn)證平板見(jiàn)附圖6a所示，進(jìn)一步PCR驗(yàn)證2個(gè)正確單菌 落，即P · putidaKT2442 Δ PP5288-gm。
[0057] (3)抗性標(biāo)記去除
[0058]將PCR驗(yàn)證正確的單菌落接種含30yg/mL慶大霉素的LB液體培養(yǎng)基中，制備感受 態(tài)，轉(zhuǎn)入PWJW102質(zhì)粒，涂布于含30yg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)20h，挑取單菌落 驗(yàn)證其抗性，無(wú) Gm抗性并PCR驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子，即P. putidaKT2442 Δ PP5288/pWJW102。 [0059] 4.pWJW102 的去除
[0060] 將上一步驗(yàn)證正確的P.putidaKT2442 Δ PP5288/pWJW102單菌落挑取至LB液體培 養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，涂布含有15g/100mL蔗糖的固體平板，30 °C培養(yǎng)20h，對(duì)單菌落進(jìn)行Km抗性 驗(yàn)證，即將單菌落劃線卡那霉素的固體平板，30°C培養(yǎng)20h，不生長(zhǎng)且進(jìn)一步PCR驗(yàn)證正確的 菌落即為敲除成功的無(wú)抗目的菌株，即P.putidaKT2442 Δ PP5288。
[0061 ] 表2基因 PP5288敲除的PCR驗(yàn)證引物
[0062]
[0063] 結(jié)果如圖7a基因型驗(yàn)證圖：
[0064] Lane 1:PP5288U-F/PP5288D-R 引物驗(yàn)證 P.putidaKT2442APP5288-gm 基因型的 PCR圖，結(jié)果正確；
[0065] Lane 2:PP5288U-F/PP5288D-R引物驗(yàn)證？411衍(^10'2442八？？5288無(wú)抗突變株基 因型的PCR圖，結(jié)果正確；
[0066] Lane 3、4:PP5288-in-test-F/PP5288-in-test-R引物驗(yàn)證P.putidaKT2442 Δ PP5288無(wú)抗突變株基因型的PCR圖，結(jié)果正確；
[0067] Lane 5:PP5288-in-test-F/PP5288-in_test-R引物驗(yàn)證P.putida KT2442野生菌 基因型的PCR圖。
[0068] 對(duì)照實(shí)施例2惡臭假單胞菌KT2442中PP5288的敲除
[0069] 1 ·敲除質(zhì)粒 pK18mobsacB_PP5288 的獲得
[0070]以P.putidaKT2442基因組為模板，分別以相應(yīng)引物擴(kuò)增得到PP5288基因的上游片 段和下游片段。在上游片段的5'和3'末端分別引入EcoRI和Xbal，在下游片段的5'和3'端分 別引入Xbal和Hindlll酶切位點(diǎn)。將PP5288上游片段經(jīng)過(guò)EcoRI和Xba頂每切純化，下游片段 經(jīng)過(guò)Xbal和Hindin酶切純化，pK18mobsacB經(jīng)過(guò)EcoRI和Hindin酶切純化，三個(gè)片段連 接，轉(zhuǎn)化JM109,新的質(zhì)粒即為PP5288敲除質(zhì)粒，命名為pK18mobsacB-PP5288。
[0071] 2.敲除感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)化
[0072]同實(shí)施例2;
[0073] 3.敲除流程
[0074] (1)一輪交換
[0075] 同實(shí)施例2;
[0076] (2)二輪交換
[0077] 選取驗(yàn)證正確的單菌落，即pK18mobsacB_PP5288質(zhì)粒通過(guò)同源臂重組與染色體交 換使得整個(gè)質(zhì)粒整合到P.putidaKT2442的染色體上，接種于含30yg/mL卡那霉素的LB液體 培養(yǎng)基中，30 °C培養(yǎng)約12h，轉(zhuǎn)接至無(wú)抗LB液體培養(yǎng)基中，30 °C培養(yǎng)12h，稀釋100倍后涂布于 含15g/100mL蔗糖的LB固體平板，30°C培養(yǎng)約20h;對(duì)所長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證50 個(gè)單菌落，全部為回復(fù)野生型，無(wú)正確突變型。
[0078] 表3 PP5288傳統(tǒng)方法敲除的PCR驗(yàn)證引物
[0079]
[0080] 轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證結(jié)果均如同圖7b基因型驗(yàn)證圖：
[0081 ] Lane 1-14: PP5288U-F/PP5288D-R 引物驗(yàn)證采用pK18mobsacB 傳統(tǒng)敲除方法篩選 的轉(zhuǎn)化子PP5288基因型的部分PCR圖，結(jié)果全部為野生型大小。
[0082] 實(shí)施例3惡臭假單胞菌KT2442中基因簇PP3126-PP3142的敲除 [0083] 1.敲除質(zhì)粒PWJW202的獲得
[0084] 以P.putidaKT2442基因組為模板，以相應(yīng)引物擴(kuò)增得到PP3126-PP3142基因簇的 上游片段和下游片段。在上游片段的5'和3'末端分別引入SacI和Xbal，在下游片段的5'和 3'端分別引入BamHI和Sac頂每切位點(diǎn)。以pDTW202作為模板，以引物
[0085] kan-lox_XbaI(+)acctctagaAATACGACTCACTATAGGGCG，
[0086] Kan-lox-BamHI(-)cgggatccGCGCAATTAACCCTCACTAAAG,
[0087] 擴(kuò)增兩端含有l(wèi)oxL/R位點(diǎn)的kan盒，在5'和3'末端分別引入Xbal和Bamm酶切位 點(diǎn)。將PP3126-PP3142基因簇的上游片段經(jīng)過(guò)SacI和Xba頂每切純化，下游片段經(jīng)過(guò)BamHI和 SacI酶切純化，kan盒片段經(jīng)過(guò)Xbal和BamHI酶切純化，pZJD29c(Yano T, Sanders C， Catalano J,Daldal F.sacB-5-Fluoroorotic acid-pyrE-based bidirectional selection for integration of unmarked alleles into the chromosome of Rhodobacter capsulatus.Appl Environ Microbiol.2005Jun;71(6): 3014-24.)經(jīng)過(guò) SacI酶切純化，四個(gè)片段連接，轉(zhuǎn)化JM109,新的質(zhì)粒即為PP3126-PP3142敲除質(zhì)粒，命名為 pWJW202(如附圖213)。？2邛29〇質(zhì)粒為Gm抗性，也帶有sacB基因，我們發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒在惡臭假單 胞菌中也是不能復(fù)制的，可以用于基因敲除或基因組精簡(jiǎn)。
[0088] 2.敲除感受態(tài)制備及電轉(zhuǎn)
[0089]同實(shí)施例2,僅將電轉(zhuǎn)質(zhì)粒換成pWJW202;
[0090] 3.敲除流程 [0091] (1)-輪交換
[0092]同實(shí)施例2;
[0093] (2)二輪交換
[0094] 選取驗(yàn)證正確的單菌落，即pWJW202質(zhì)粒通過(guò)同源臂重組與染色體交換使得整個(gè) 質(zhì)粒整合到P. putidaKT2442的染色體上，接種于含30yg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，30 °C培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接LB試管培養(yǎng)12h，稀釋100倍后涂布于含30yg/mL卡那霉素和15g/100mL蔗糖 的LB固體平板，30°C培養(yǎng)約20h;對(duì)所長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行Gm抗性驗(yàn)證，即劃取50個(gè)單菌落在 Gm固體平板上培養(yǎng)20h，不生長(zhǎng)的單菌落即為正確敲除轉(zhuǎn)化子，僅4個(gè)轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)，正確率達(dá) 到92%，如附圖6b所示，進(jìn)一步PCR驗(yàn)證2個(gè)單菌落，正確，即P.putida ΚΤ2442ΔΡΡ3126-PP3142-kan〇
[0095] (3)抗性標(biāo)記去除
[0096]將PCR驗(yàn)證正確的單菌落接種含30yg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，制備感受 態(tài)，轉(zhuǎn)入PWJW103質(zhì)粒，于含30yg/mL慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)20h，挑取單菌落驗(yàn)證 其抗性，無(wú) Km抗性并PCR驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子，即P.putida KT2442 Δ PP3126-PP3142/ pffJW103〇
[0097] 4.pWJW103 的去除
[0098] 將上一步驗(yàn)證正確的P.putida KT2442APP3126_PP3142/pWJW103單菌落挑取至 LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，涂布含有15g/100mL蔗糖的固體平板，30 °C培養(yǎng)20h，對(duì)單菌落進(jìn) 行Gm抗性驗(yàn)證，即將單菌落劃線慶大霉素的固體平板，30°C培養(yǎng)20h，不生長(zhǎng)且進(jìn)一步PCR驗(yàn) 證正確的菌落即為敲除成功的無(wú)抗突變株，即P.putidaKT2442APP3126-PP3142。
[0099] 表4基因簇PP3126-PP3142敲除的PCR驗(yàn)證引物
[0100]
[0101] 結(jié)果如圖7a基因型驗(yàn)證圖：
[0102] Lane 6 :PP3126-PP3142-test-F/PP3126-PP3142-test-R 引物驗(yàn)證 P.putida KT2442 Δ PP3126-PP3142-kan基因型的PCR圖，結(jié)果正確；
[0103] Lane 7 :PP3126-PP3142-test-F/PP3126-PP3142-test-R引物驗(yàn)證P.putida KT2442 Δ PP3126-PP3142無(wú)抗突變株基因型的PCR圖，結(jié)果正確；
[0104] Lane 8、9:PP3126-PP3142-in-test-F/PP3126-PP3142-in-test-R引物驗(yàn)證 P. putida KT2442 Δ PP3126-PP3142無(wú)抗突變株基因型的PCR圖，結(jié)果正確；
[0105] Lane 10:PP3126-PP3142-in-test-F/PP3126-PP3142-in-test-R引物驗(yàn)證 P.putida KT2442野生菌基因型的PCR圖。
[0106] 實(shí)施例4惡臭假單胞菌KT2442 Δ PP3126-PP3142中基因簇PP1277-PP1290的敲除 [0107] 1.敲除質(zhì)粒PWJW203的獲得
[0108] 同實(shí)施例3;僅PP1277-PP1290基因簇上游同源臂的酶切位點(diǎn)換作SacI和BamHI，下 游同源臂的酶切位點(diǎn)換作Xba I和Sac I，中間帶有1 〇xL/R位點(diǎn)的kan盒兩端酶切位點(diǎn)換作 BamHI和質(zhì)粒如附圖3c。
[0109] 2.敲除感受態(tài)制備及電轉(zhuǎn)
[0110] 同實(shí)施例2,僅將電轉(zhuǎn)質(zhì)粒換成PWJW203。
[0111] 3.敲除流程
[0112] 同實(shí)施例3，ΚΤ2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290: : loxL-kan-loxR命名為 KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290-kan;同樣挑取50個(gè)單菌落，驗(yàn)證其抗性，5個(gè)單 菌落生長(zhǎng)，正確率為90%，如附圖6c所示。
[0113] 4.pWJW103 的去除
[0114] 同實(shí)施例 3,〇2442&??3126-??3142&??1277-??1290:1(?171?命名為1〇'2442厶 PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290。
[0115] 表5基因簇PP1277-PP1290敲除的PCR驗(yàn)證引物
[0116]
[0117] 結(jié)果如圖7a基因型驗(yàn)證圖：
[0118] Lane ll:PP1277-PP1290-test-F/PP1277-PP1290-test-R引物驗(yàn)證P.putida KT2442APP3126-PP3142APP1277-PP1290-kan基因型的PCR圖，結(jié)果正確；
[0119] Lane 12: PP1277-PP1290-test-F/PP1277-PP1290-test-R 引物驗(yàn)證 P.putida KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290無(wú)抗突變株基因型的PCR圖，結(jié)果正確；
[0120] Lane 13、14:PP1277-PP1290-in-test-F/PP1277-PP1290-in-test-R 引物驗(yàn)證 P.putida KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290無(wú)抗突變株基因型的PCR圖，結(jié)果正 確；
[0121] Lane 15:??1277-?卩1290-111-七68卜卩/??1277-??1290-111-七68七-1?引物驗(yàn)證 P.putida KT2442野生菌基因型的PCR圖。
[0122] 實(shí)施例5惡臭假單胞菌KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290中基因簇 PP4329-PP4397 的敲除
[0123] 1.敲除質(zhì)粒pWJW204的獲得
[0124] 同實(shí)施例質(zhì)粒如附圖3d。
[0125] 2.敲除感受態(tài)制備及電轉(zhuǎn)
[0126] 同實(shí)施例2,僅將電轉(zhuǎn)質(zhì)粒換成pWJW204。
[0127] 3.敲除流程
[0128] 同實(shí)施例3，ΚΤ2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397: : loxL-kan-loxR命名為KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397-kan;同樣挑 取50個(gè)單菌落，驗(yàn)證其抗性，4個(gè)單菌落生長(zhǎng)，其正確率達(dá)到92 %，如附圖6d所示。
[0129] 4pWJW103 的去除
[0130] 同實(shí)施例3，ΚΤ2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397: : loxL/R 命名為KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397。
[0131] 表6基因簇PP4329-PP4397敲除的PCR驗(yàn)證引物
[0132]
[0133] 結(jié)果如圖7a基因型驗(yàn)證圖：
[0134] Lane 16 : PP4329-PP4397-test-F/PP4329-PP4397-test-R引物驗(yàn)證P · putida KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397-kan基因型的PCR圖，結(jié)果正 確；
[0135] Lane 17 : PP4329-PP4397-test-F/PP4329-PP4397-test-R引物驗(yàn)證P · putida KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397無(wú)抗突變株基因型的PCR圖，結(jié) 果正確；
[0136] Lane 18、19:PP4329-PP4397-in-test-F/PP4329-PP4397-in-test-R 引物驗(yàn)證 P.putida KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397無(wú)抗突變株基因型 的PCR圖，結(jié)果正確；
[0137] Lane 20:PP4329-PP4397-in-test-F/PP4329-PP4397-in-test-R引物驗(yàn)證 P.putida KT2442野生菌基因型的PCR圖。
[0138] 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡(jiǎn)系統(tǒng)，其特征在于，包括：1)核苷酸序列如 SEQIDN0.1所示的模板質(zhì)粒pWJW101;2)核苷酸序列分別如SEQIDN0.2、SEQIDN0.3所 示的表達(dá)質(zhì)?？?，102、?1，103;其中，表達(dá)質(zhì)粒?1，102攜帶編碼〇6重組酶和蔗糖果聚糖 酶SacB的基因，Kan抗性;表達(dá)質(zhì)粒pWJW103攜帶編碼Cre重組酶和蔗糖果聚糖酶SacB的基 因，Gm抗性。2. -種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡(jiǎn)系統(tǒng)的方法，其特 征在于， 模板質(zhì)粒PWJW101的構(gòu)建方法包括以下步驟： 第一步：以PBBR1MCS-5為模板，PCR擴(kuò)增得到gm基因，并在其兩端均引入Smal酶切位點(diǎn)， 經(jīng)過(guò)酶切純化后，備用；以PDTW202質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增得到含有l(wèi)oxL/R位點(diǎn)的線性 pBSloxL/R質(zhì)粒片段，并在兩端均引入Sma頂每切位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)酶切純化后，備用； 第二步:將已經(jīng)處理好的gm片段和pBSloxL/R質(zhì)粒片段連接，得到pWJWlOl; 所述表達(dá)質(zhì)粒PWJW102、pWJW103的構(gòu)建方法包括以下步驟： 第一步：以PSH47為模板，以相應(yīng)引物擴(kuò)增重組酶Cre可移閱讀框，并在擴(kuò)增片段的5'和 3'末端引入EcoRI和Xbal酶切位點(diǎn)，Cre片段經(jīng)過(guò)EcoRI和Xbal酶切純化后備用；以質(zhì)粒 pDXW-3為模板，以相應(yīng)引物擴(kuò)增帶有強(qiáng)啟動(dòng)子的PlacM-sacB片段，片段5'和3'末端分別引 入Xbal和SacI限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，酶切純化后備用； 第二步：酶切純化的片段Cre和PlacM-sacB與經(jīng)過(guò)EcoRI和Xbal酶切純化的質(zhì)粒 pBBRlMCS-2 連接，得到 pWJW102; 第三步：酶切純化的片段Cre和PlacM-sacB與經(jīng)過(guò)EcoRI和Xbal酶切純化的質(zhì)粒 pBBRlMCS-5 連接，得到 pWJW103。3. -種應(yīng)用權(quán)利要求1所述的惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡(jiǎn)系統(tǒng)敲除惡臭假單 胞菌的基因或基因簇的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 敲除質(zhì)粒的構(gòu)建，根據(jù)需要敲除的基因或基因簇的序列設(shè)計(jì)其同源臂，長(zhǎng)度一般為 lOOObp左右，將同源臂擴(kuò)增后酶切回收，同時(shí)擴(kuò)增帶有l(wèi)oxL/R的抗性標(biāo)記基因，將上游同源 臂，抗性標(biāo)記基因，下游同源臂依次連接于惡臭假單胞菌自殺質(zhì)粒上，構(gòu)成敲除質(zhì)粒； 2) 敲除質(zhì)粒的第一輪交換，制備惡臭假單胞菌感受態(tài)，將1)中敲除質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入感受態(tài) 中，復(fù)蘇涂布后，對(duì)長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行蔗糖抗性篩選，有蔗糖致死的為一輪交換正確轉(zhuǎn)化 子； 3) 敲除第二輪交換，將一輪交換正確轉(zhuǎn)化子挑入Kan抗性LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，再轉(zhuǎn)接 無(wú)抗LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12h，即可稀釋100倍涂布具有同源臂中間連接的抗性標(biāo)記的抗性的蔗糖 平板，培養(yǎng)20h;對(duì)長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行抗性驗(yàn)證，即無(wú)出發(fā)自殺質(zhì)粒自身抗性的轉(zhuǎn)化子為第 二輪敲除正確轉(zhuǎn)化子，并進(jìn)一步通過(guò)PCR驗(yàn)證確定1-2個(gè)轉(zhuǎn)化子即可； 4) 去除抗性標(biāo)記，將第二輪敲除正確轉(zhuǎn)化子制備成電轉(zhuǎn)感受態(tài)，電轉(zhuǎn)入表達(dá)質(zhì)粒 PWJW102或pWJW103，在表達(dá)質(zhì)粒相應(yīng)的抗性平板培養(yǎng)20h，對(duì)長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行抗性驗(yàn)證， 無(wú)二輪交換抗性的單菌落為正確轉(zhuǎn)化子，并進(jìn)一步通過(guò)PCR驗(yàn)證確定1-2個(gè)轉(zhuǎn)化子即可； 5) 表達(dá)質(zhì)粒的去除，將抗性標(biāo)記去除成功的菌落挑入LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，稀釋100倍 涂布于含有15g/ 100mL的鹿糖平板上培養(yǎng)20h，對(duì)所長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行抗性驗(yàn)證，無(wú)表達(dá)質(zhì) ?？剐缘膯尉錇樽罱K正確突變株，進(jìn)一步PCR驗(yàn)證確定1-2個(gè)轉(zhuǎn)化子即可。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述自殺質(zhì)粒是pK18mobsacB或pZJD29c。5. -種應(yīng)用權(quán)利要求1所述的惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡(jiǎn)系統(tǒng)敲除惡臭假單 胞菌KT2442的PP5288基因的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 以自殺質(zhì)粒pK18mobsacB為出發(fā)質(zhì)粒，連接PP5288的同源臂和pWJWlOl中的gm盒，轉(zhuǎn) 化E.coli JM109,構(gòu)建PP5288敲除質(zhì)粒； (2) 將（1)中PP5288敲除質(zhì)粒從E. col i JM109中提取，電轉(zhuǎn)化惡臭假單胞菌KT2442菌 株，涂布于含有卡那霉素的固體恢復(fù)培養(yǎng)基，30 °C培養(yǎng)約20小時(shí)； (3) 挑取平板上單菌落，即一輪轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，選取驗(yàn)證正確的單菌落，進(jìn)行蔗 糖平板劃線培養(yǎng)，有明顯透明粘液的菌為正確的轉(zhuǎn)化子； (4) 挑取上述(3)中驗(yàn)證正確的一輪轉(zhuǎn)化子，接到Kan抗性的LB培養(yǎng)基中，30 °C培養(yǎng)12小 時(shí)，轉(zhuǎn)接LB無(wú)抗試管培養(yǎng)12h，稀釋100倍，涂布Gm抗性的LB固體平板； (5) 挑取平板上單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，選取驗(yàn)證正確的單菌落； (6) 將(5)所得菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，30 °C過(guò)夜培養(yǎng)，并制備正確單菌落的電轉(zhuǎn)感 受態(tài)； (7) 從E. co 1 i JM109中提取pWJWl02，電轉(zhuǎn)入上述感受態(tài)中，30 °C培養(yǎng)約20小時(shí)，PCR驗(yàn) 證轉(zhuǎn)化子，選取驗(yàn)證正確的單菌落； (8) 挑取平板上正確的單菌落入LB液體培養(yǎng)基，30 °C培養(yǎng)約12小時(shí)，稀釋100倍涂布含 15g/100mL蔗糖的LB固體平板，30°C培養(yǎng)約20小時(shí)； (9) 挑取(8)中單菌落，畫格子驗(yàn)證是否有Kan抗性，無(wú) Kan抗性的單菌落，再經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn) 證，選取正確的單菌落，即為敲除無(wú)抗突變株。6. -種應(yīng)用權(quán)利要求1所述的惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡(jiǎn)系統(tǒng)敲除惡臭假單 胞菌基因簇的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 以自殺質(zhì)粒pZJD29c為出發(fā)質(zhì)粒，連接目的基因簇的同源臂和kan盒，轉(zhuǎn)化 E.coliJM109,構(gòu)建敲除質(zhì)粒； (2) 將（1)中敲除質(zhì)粒從E.coli JM109中提取，電轉(zhuǎn)化要敲除的惡臭假單胞菌，涂布于 含有卡那霉素的固體恢復(fù)培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)約20小時(shí)； (3) 挑取平板上單菌落，即一輪轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，選取驗(yàn)證正確的單菌落，進(jìn)行蔗 糖平板劃線培養(yǎng)，有明顯透明粘液的菌正確； (4) 挑取上述(3)中驗(yàn)證正確的一輪轉(zhuǎn)化子，接到Kan抗性的LB培養(yǎng)基中，30 °C培養(yǎng)12小 時(shí)，轉(zhuǎn)接LB無(wú)抗試管培養(yǎng)12h，稀釋100倍，涂布Kan抗性的LB固體平板； (5) 挑取平板上單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，選取驗(yàn)證正確的單菌落； (6) 將上步所示菌株接種于液體培養(yǎng)基，30°C過(guò)夜培養(yǎng)，并制備正確單菌落的電轉(zhuǎn)感受 態(tài)； (7) 從E. co 1 i JM109中提取pWJWl03，電轉(zhuǎn)入上述感受態(tài)中，30 °C培養(yǎng)約20小時(shí)，PCR驗(yàn) 證轉(zhuǎn)化子，選取驗(yàn)證正確的單菌落； (8) 挑取平板上正確的單菌落入LB液體培養(yǎng)基，30 °C培養(yǎng)約12小時(shí)，稀釋100倍涂布含 15g/100mL蔗糖的LB固體平板，30°C培養(yǎng)約20小時(shí)； (9) 挑取(8)中單菌落，畫格子驗(yàn)證是否有Kan抗性，無(wú) Kan抗性的單菌落，再經(jīng)過(guò)PCR，選 取正確的單菌落，即為敲除無(wú)抗突變株。7. 權(quán)利要求1所述的惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡(jiǎn)系統(tǒng)在惡臭假單胞菌的基因 敲除中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求1所述的惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡(jiǎn)系統(tǒng)在惡臭假單胞菌的基因 組精簡(jiǎn)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/78GK106086056SQ201610415109
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月13日 公開號(hào)201610415109.0, CN 106086056 A, CN 106086056A, CN 201610415109, CN-A-106086056, CN106086056 A, CN106086056A, CN201610415109, CN201610415109.0
【發(fā)明人】王小元, 王建莉, 馬文漸, 林琳, 王雨舟, 王甜憶, 黃舒婷, 王雨倩, 張怡平, 孫康康, 李燁
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)